MICROSCOPIA DE LUZ / CAMPO CLARO

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1 MICROSCOPIA DE LUZ / CAMPO CLARO COLORAÇÕES Mais utilizado na observação de microorganismos SIMPLES DIFERENCIAL Qualidade da imagem depende do tipo delente edotamanhodoespécime Exige utilização de métodos de coloração para Positiva Negativa Separação de grupos Coloração de Gram Coloração de Ziehl-Nielsen Visualização de estruturas Esporos Cápsulas Flagelo bactérias Coloração simples Positiva Tipo de corante básico Incubação Utilização de um único corante, carregado positivamente Ligação do corante às cargas negativas das superfícies celulares e do material genético Azul de metileno Cristal violeta Carbolfucsina 1-2 min seg seg 1

2 Método do esfregaço Simpleserápido Cumprimento de regras básicas para garantir um bom preparo do material Preparodaslâminasdevidro Lavadas com água e sabão (enxaguadas à exaustão) Retiradas do recipiente com pinça Secascom papeltoalha oupano macio (semfiapos) Preparo do esfregaço Cultivo em meio líquido - Retirardo material com auxílio de alça de platina (1a 3gotas) - Depositar sobre lâmina de vidro previamente limpa Recipientecometanola95% Cultivoemmeiosólido - Depositar 1 a 2 gotas de solução salina estéril sobre lâminade vidro previamente limpa - Recolhercom a alça de platina uma pequena porção da colônia de crescimento bacteriano - Diluir na gota de salina, espalhando as células com movimentos circulares 2

3 Bacillus anthracis Corynebacterium diphteriae Concentração não deve ser excessiva Aguardar secagem total do esfregaço Fixação pelo calor Evitar que os micro-organismos sejam perdidos durante as colorações e lavagens repetitivas Cristal violeta Cristal violeta Azul de metileno Cristal violeta Passagem da lâmina sobre a chama do bico de Bunsen por 3 X consecutivas Bacillus brevis Cocos Gram + Negativa Utilização de corante acídico Contrastação a partir da repulsão entre as cargas negativas celulares e o corante - Coloração da lâmina Tinta nanquim Nigrosina Mistura DIRETA do corante ao microrganismo - SEM aquecimento Melhor qualidade na preservação do material - Fundo contrastado, micro-organismo claro - Ideiade negativo fotográfico - Importante na observação de cápsulas mucóides 3

4 Cryptococcus neoformans Nanquim Nigrosina Coloração diferencial Utilização de dois corantes contrastantes, gerando duas colorações diferentes entre grupos bacterianos distintos Separação de diferentes grupos bacterianos Visualização de estruturas particulares de alguns grupos bacterianos Coloração de Gram Hans Christian Gram (1884) Coloração mais utilizada na bacteriologia Deveserutilizadoduranteafaselog Esfregaço Princípio da técnica: diferença na composição das paredes celulares Coloração primária X contracorante 4

5 Preparo do esfregaço Coloração com cristal violeta 1 min Remoção do corante com água destilada Lugol(mordente) 1 min Remoção do lugol com água destilada Lavagem com etanol a 95% até que o residual fique transparente Remoção do etanol com água destilada Coloração com fucsina/safranina 45 seg Remoção da fucsina/safranina com água destilada Secagem com papel de filtro Coloração de Ziehl-Nielsen Micobactérias Parede de ácidos imcólicos evita a penetração de diversos corantes - Após penetração, não ocorre remoção mesmo utilizando reagentes descolorantes Característica álcool-ácido resistente Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Nocardia patog. Esfregaço mais difícil - Microbactérias não são tão solúveis - Difícil espalhamento na gota de salina - Secagemdoesfregaçoao arpor15-30 min - Fixaçãopelocalor3-5 vezes,por3-4seg cada Fucsina deve ser colocado sobre o esfregaço em alta temperatura - Utilização de placa aquecedora (SEM evaporação) 5

6 Rápido resfriamento(geladeira) - Dificultarsaída do corante Tratamento com solução de álcool-ácido - Etanola95% ehcl concentrado Contra-coloração com azul de metileno das células descoradas Princípio da técnica: diferença na composição das paredes celulares Coloração de endósporos Técnica de Schaeffer-Fulton Altaresistência - Peptideoglicano multilaminar - Dipicolinato de cálcio Utilização de calor para penetração do corante Cuidados especiais no esfregaço -Secagem ao areposteriorfixaçãopelocalor Depósito do corante verde de malaquita sobre o esfregaço - Sobre placa aquecedora - NÃO pode haver evaporação ou efervescência do corante Lavagem com água destilada Contra-coloração com fucsina/safranina - Células vegetativas 6

7 MICROSCÓPIO ÓPTICO Ampliação deumobjetoatravés deumconjunto de lentes Iluminação natural ou artificial É constituído por uma parte mecânica que suporta e permite controlar uma parte óptica que amplia as imagens Braço Pinças Parafuso macrométrico Parafuso micrométrico Ocular Canhão Revólver Objetivas Platina Condensador Diafragma Fonte luminosa Pé ou base 7

8 Oculares Ampliam a imagem fornecida pelo sistema de objetivas Canhão ou tubo Serve de suporte ao sistema ocular Braço Revólver Serve de suporte à platina e ao revólver Suporte às objetivas, mecanismo permite a mudança entre as lentes 8

9 Objetivas Código de cores dos anéis em microscópios ópticos Código de cor Tipo de imersão Preto...Óleo de imersão Laranja...Imersão em glicerol Branco...Imersão em água Vermelho...Especial Ampliam a imagem do objeto que está a ser observado Código de cor Aumento Preto...1x, 1.25x Marrom...2x, 2.5x Vermelho...4x, 5x Amarelo...10x Verde...16x, 20x Azul turqueza...25x, 32x Azul claro...40x, 50x Azul cobalto (escuro)...60x, 63x Branco (creme)...100x CARACTERÍSTICA DA IMAGEM Antes Depois Ampliada Simétrica Invertida Virtual 9

10 Abertura numérica Indicaângulodeabertura da luz Determina: poder de iluminação, resolução e profundidade de campo da objetiva < Abertura numérica > Lentes especiais - Transmissão de fluorescência ou microscopia de campo escuro presença de diafragma interno para ajuste da abertura numérica Lentes com correções a) Lentes acromáticas: menor nível de correção b) Fluorito ou semi-apocromáticas: nível médio de correção c) Apocromáticas: maior nível de correção Correções ópticas Correções esféricas: Achro(achromat), Apo (apochromat) e Fl, Fluar, Fluor, Neofluar, ou Fluotar(fluorite) for better spherical Correções de curvatura de campo: Plan, Pl, EF, Acroplan, PlanApo ouplano 10

11 Meiodeimersão Platina Maioria desenhada para interagir com o ar Meiodeimersão - Atingirmaiores abertura numéricas - Redução do índice de refração - PlanApo: 1,40 Suporte da amostra. Tem uma abertura na pane central (janela da platina) Condensador Diafragma Distribui regularmente no campo da preparação a luz que atravessa o diafragma Regula a intensidade da luz que incide na preparação 11

12 Fonte de Luz Parafusos Macrométrico e Micrométrico Permite movimentos (de maior ou menor amplitude) de aproximação ou afastamento entre a preparação e as objetivas Base ou pé MICROSCOPIA DE LUZ / CAMPO CLARO Mais utilizado na observação de microorganismos Constitui a base de suporte de todos os elementos do microscópio Qualidade da imagem depende do tipo delente edotamanhodoespécime 12

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