RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS: TESTES DE SENSIBILIDADE

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1 RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS: TESTES DE SENSIBILIDADE Em 1928, Alexander Fleming observou a inibição do crescimento de S. aureus ao redor das colônias de um fungo (Penicillium notatum) que havia contaminado a placa. 1

2 RESISTÊNCIA INTRÍNSECA OU ADQUIRIDA: Emprego generalizado e indiscriminado de antibióticos Originada por mutação ou transferência genética MUTAÇÕES: mutações pontuais, transposição de segmentos de genes, inserções, deleções, inversões TRANSFERÊNCIA GENÉTICA: plasmídeos, bacteriófagos, transposição de genes (do plasmídeo para o cromossomo) MECANISMOS DE RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS 2

3 As bactérias se tornam resistentes por meio de 4 mecanismos: I I. Destruição ou inativação da droga por enzimas bacterianas As β-lactamases destroem o local de ligação dos antimicrobianos β-lactâmicos (proteínas de ligação da penicilina ou PLPs). Ex. Staphylococcus aureus e penicilinas. II. Prevenção da penetração dentro do MO (contra tetraciclinas). Ocorre alteração na porina específica da membrana celular. Bacilos Gram-negativos à penicilina, eritromicina, clindamicina e vancomicina e pela resistência de Pseudomonas aeruginosa ao trimetoprim e imipenem. 3

4 III. Alteração dos sítios alvos das drogas (troca de aas contra macrolídeos) Um gene transportado por plasmídeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a ligação dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina. Staphylococcus aureus resistente à oxacilina e estafilococos coagulase-negativos resistente à antibimicrobianos β-lactâmicos. IV. Efluxo rápido (ejeção) que bombeia a droga para fora da célula antes do efeito iniciar. A resistência às tetraciclinas codificada por plasmídeos em Escherichia coli resulta deste efluxo ativo. 4

5 PLAMÍDEOS E TRANSPOSONS Plasmídeo são fragmentos de DNA auto-replicantes, circulares, contendo genes. Fatores R (resistência): De importância médica. Plasmídeos que transferem características de resistência à antibióticos, metais pesados e toxinas celulares. 5

6 TESTES DE SENSIBILIDADE MICROBIANA O padrão de sensibilidade de muitos microrganismos geralmente é previsível. O médico deve saber a sensibilidade de um patógeno antes do tratamento por antibióticos. Após a identificação do patógeno (gênero e espécie) é fundamental a determinação da terapia. A susceptibilidade de um MO pode mudar com o tempo ou mesmo durante a terapia. A freqüência de antibióticos no ambiente hospitalar e na comunidade aumentou a resistência de muitos patógenos importantes em humanos como Staphylococcus aureus e Neisseria gonorrhoeae. Os testes de susceptibilidade são indicados quando: (1) O microrganismo envolvido é frequentemente resistente às drogas antimicrobianas (ex. bactérias gram-negativas entéricas); (2) Um processo infeccioso é mortal se não tratado especificamente; (3) Em certas infecções que requerem o uso de drogas que são rapidamente bactericidas. 6

7 DUAS CATEGORIAS DE TESTES Qualitativos (disco de difusão) Quantitativos (valor CIM ou MIC) Método do disco de difusão Diluição em Caldo de Cultura Fita com gradiente: Etest TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO Utiliza um disco com papel de filtro impregnado com antimicrobiano colocado sobre o ágar. A leitura da área de inibição é feita com medição do diâmetro (Ø) do halo em milímetros. Três categorias de resultados são utilizados: Sensível Sensibilidade intermediária Resistente 7

8 Os discos para antibiogramas são acondicionados em cartuchos com 50 unidades cada, em uma embalagem protegida contra a umidade por sílica. São armazenados sob refrigeração (2 a 8 C) e possuem validade de um ano. Antes do uso manter fora da geladeira de 1 a 2 horas. Ambas as faces são impressas com a sigla do antibiótico, separados em cores de acordo com seu grupo. As concentração são conforme as indicações da NCCLS Antibiótico Concentração em disco (µg) Amicacina 30 Amoxicillina 25 Ampicillina 10 Azitromicina 15 Bacitracina 130 Cefaclor 30 Cefalexina 30 Clindamicina 2 Eritromicina 5 Gentamicina 10 Imipenem 10 Rifampicina 2 Tetraciclina 10 Trimetropim 2,5 Vancomicina 30 8

9 FATORES QUE INFLUENCIAM O TESTE MEIO DE CULTURA Meios padronizados proporcionam resultados reproduzíveis. O ICSST (International Collaborative Study of Susceptibility Testing) recomenda que o meio deverá: Ter alta qualidade, Possibilitar o crescimento da maioria dos patógenos Não ser antagonista dos agentes antimicrobianos empregados Deverá ser isotônico Não alterar o ph significativamente durante o crescimento microbiano. MEIO DE CULTURA Ágar Mueller-Hinton (método Kirby-Bauer) Committee for Clinical Laboratory Standards) NCCLS (National Streptococcus, S. aureus e E. coli necessitam de piridoxina; Sangue lisado para Neisseria spp. e Streptococcus. PROFUNDIDADE DO ÁGAR Afeta o Ø do halo, ou seja, um meio com pouca profundidade aumenta a difusão e o tamanho do halo. Ideal 25 ml de meio em placa de 90 mm de Ø, ou 4 mm de profundidade. 9

10 ph Em média o ph deverá ser estável em torno de 7,2 a 7,4. Aminoglicosídeos, macrolídeos, lincomicina, e cefalosporinas = melhor em ph alcalino. Tetraciclina, meticilina, novobiocina e pirazinamida = melhor em ph ácido. PRÉ-DIFUSÃO E PRÉ-INCUBAÇÃO Para evitar que o inóculo cresça antes da colocação do disco ou ocorrer a pré-difusão do antimicrobiano, o inoculo deverá: Ser semeado após 15 minutos da preparação da placa de ágar. Aguardar mais 15 minutos e colocar o disco. Passados mais 15 minutos, incubar com as placas invertidas. Procedimentos padrões requer o uso de concentrações padronizadas de inóculo em solução salina estéril. Utiliza-se uma escala de Mac Farland de 0,5 para comparação visual. Nesta escala há aproximadamente 1,5 x 10 8 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. Umedecer um swab na solução com bactérias padronizada e semear na placa de Mueller-Hilton. 10

11 TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO Após a semeadura, adicionar os discos de antibióticos. As placas são incubadas de 30 a 37 C, com leitura de 16 a 24 horas, com ou sem CO 2 (dependendo do patógeno). Uma placa de 90 mm poderá ter 6 discos, um representante de cada classe e a escolha é pelo menos ativo. Utilizar uma cepa padrão como controle (S. aureus NCTC 6571; E. coli NCTC 10418). MÉTODO QUALITATIVO DO DISCO DE DIFUSÃO Determinação do diâmetro do halo de inibição Sensibilidade ao antibiótico numa concentração fixa em disco Zona de inibição R Sem halo ou zona de inibição= Resistente. S Zona de inibição= Sensível ao quimioterápico. 11

12 Sensíveis: As bactérias são sensíveis às doses comuns. Sensibilidade intermediária ou Sensibilidade Dose Dependente (SDD): Depende da concentrações alcançadas no sítio infeccioso ou se o MO é sensível à terapêutica de infecções sistêmicas no caso de altas doses do antibiótico. Resistente: Não é provável que as bactérias respondam à terapêutica com o antibiótico. 12

13 Arraste da zona de inibição, causada pelo deslizamento do disco no meio. 13

14 Cepa bacteriana resistente (?????????????) QUANTITATIVOS: Etest Ao invés de disco, usa-se uma fita graduada contendo antimicrobiano. Determina: Sensibilidade ao antibiótico; Concentração de antibiótico: MIC=Concentração Inibitória Mínima* *Concentração inibitória mínima (MIC): concentração que resulta em 99% de inibição (mínimo que deve atingir o sítio de ação). 14

15 Campana et al., 2011 TESTES DE DILUIÇÃO EM CALDOS DE CULTURAS Determinada com uma mistura da droga antimicrobiana + meio líquido + inóculo padronizado. O teste em caldo determina a Concentração Inibitória Mínima de uma droga (CIM ou MIC). Cultura em caldo Cultura em caldo + Tetraciclina µg/ml 8 MIC= 4 µg/ml

16 Podem ser usados em sistemas de automação ou de leitura de placa de ELISA. Suscetibilidade ao voriconazol de espécies Candida a um agente antifúngico. Discos impregnados com 1 µg de voriconazol são usados para testar a suscetibilidade de leveduras. Suscetível (S) Concentração Inibitória Mínima (CIM em µg/ml) Suscetibilidade Dose-dependente (S-DD) Resistente (R) 1,0 2,0 4,0 Suscetível (S) Difusão do Disco (zona de diâmetro em mm) Suscetibilidade Dose-dependente (S-DD) Resistente (R)