Testes manuais e automatizados para detecção de resistência bacteriana a antibióticos

Transcrição

1 Testes manuais e automatizados para detecção de resistência bacteriana a antibióticos Dr. Maria Teresa Destro Dir. Assuntos Científicos P I O N E E R I N G D I A G N O S T I C S

2 COMPROMISO FAMILIAR HISTÓRICO CON A MEDICINA E SAÚDE PUBLICA AO REDOR DO MUNDO Tradição Pasteuriana: Marcel Mérieux - Louis Pasteur em Um compromisso que ja transcende 4 gerações 2

3 LIDER EM MICROBIOLOGIA PARA INDUSTRIAS Alimentos y Bebidas Salud y Cuidado Personal Diagnostico Veterinario 3

4 4 SOLUCIONES PARA TOMAR DECISIONES CON CONFIANZA

5 Resistencia a antimicrobianos Uma das principais ameaças à - Saúde pública - Segurança alimentar - Desenvolvimento 5

6 Como se dissemina a resistência a antibiótico? Antibióticos administrados a animais Antibióticos administrados a humanos Disseminação de bactérias resistentes aos humanos e outros animais (alimentos inadequadamente preparados, falta de higiene, proximidade ) Disseminação de bactérias resistentes entre pessoas (higiene inadequada ou proximidade) Resistencia pode desenvolver Resistencia pode desenvolver Disseminação de bactérias resistentes, ao meio ambiente e alimentos, por água contaminada com fezes ou animais silvestres Disseminação, de bactérias resistentes, aos humanos e outros animais pelo ambiente (água, solo e ar) 6

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9 PARA QUE FAZER O TESTE? Avaliar in vitro a interação fármaco x bactéria Orientar o tratamento Determinar a sensibilidade Concentração inibitória mínima Que referencia usar para avaliar? Ministério da Saúde EUCLAST para humanos 9

10 10 Euclast mais clinico CLSI mais epidemiológico E para animais? Plano de Ação Nacional de Prevenção e Controle da Resistência aos Antimicrobianos, no âmbito da Agropecuária (PAN-BR Agro) - Lançado em 2018 Animal CLSI?

11 COMO AVALIAR A RESISTÊNCIA/ SENSIBILIDADE DE UM ISOLADO? Metodologia Qualitativa Disco difusão Metodologia quantitativa Diluição em caldo - Macrodiluição - Microdiluição Ágar-diluição E-test Automação 11

12 COMO AVALIAR A RESISTÊNCIA/ SENSIBILIDADE DE UM ISOLADO? Metodologia Qualitativa Disco difusão Metodologia quantitativa Diluição em caldo - Macrodiluição - Microdiluição Ágar-diluição E-test Automação 12

13 COMO AVALIAR A RESISTÊNCIA/ SENSIBILIDADE DE UM ISOLADO? Disco difusão (Kirby-Bauer) Camada homogênea de bactéria na superfície da placa (suspensão 0,5 McFarland) Discos impregnados com concentração conhecida de antibióticos Princípio do método - Difusão do fármaco no ágar 13

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15 COMO AVALIAR A RESISTÊNCIA/ SENSIBILIDADE DE UM ISOLADO? Disco difusão (Kirby-Bauer) Camada homogênea de bactéria na superfície da placa (suspensão 0,5 McFarland) Discos impregnados com concentração conhecia de antibióticos Resultados - Medir o halo de inibição (mm) - Resistente, Intermediário, Sensível - Baseado em informações - BRCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) Fonte: Laborclin 15

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17 Vantagens Baixo custo Simples Reprodutibilidade Fácil interpretação Flexibilidade Desvantagens Resultados somente qualitativos Não padronização de combinações micro-organismos-agentes Controle rigoroso de todas as variáveis - Preparo do ágar (ph) - Espessura do ágar - Armazenamento dos discos, etc 17

18 COMO AVALIAR A RESISTÊNCIA/ SENSIBILIDADE DE UM ISOLADO? Metodologia Qualitativa Disco difusão Metodologia quantitativa Diluição em caldo - Macrodiluição - Microdiluição Ágar-diluição E-test Automação 18

19 Macrodiluição em caldo Preparar diluições seriadas e logarítmicas (8 ou mais) de antimicrobianos (32, 16, 8, 4, 2 g/ml) em meio de cultura (1-2ml) Inocular com concentração padronizada (5 x 10 5 UFC/ml) do microrganismo Incubar a condições adequadas Avaliar turbidez Resultado: - Maior diluição sem crescimento - concentração inibitória mínima (CIM) - Expressa em g/ml 19

20 20 CIM

21 Vantagens Quantitativo Desvantagens Elevado volume de reagente Espaço Longo tempo de preparo Baixa reprodutibilidade Sujeito a erro humano - Preparo - Interpretação 21

22 Microdiluição em caldo Miniaturização da macrodiluição Preparar placas fundo em U com as concentrações da droga - Existem placas pré-preparadas 22

23 Microdiluição em caldo Miniaturização da macrodiluição Preparar placas fundo em U com as concentrações da droga - Existem placas pré-preparadas Inocular com concentração padronizada (5 x 10 5 UFC/ml) do microrganismo (0,5 McFarland) Incubar Avaliar visualmente o crescimento Resultado: - Maior diluição sem crescimento - (CIM) - Expressa em g/ml 23

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27 Vantagens Economia de espaço e reagentes Reprodutibilidade Quantitativo Existência de placas prépreparadas Desvantagens Custo das placas prontas Baixa flexibilidade com placas prépreparadas 27

28 COMO AVALIAR A RESISTÊNCIA/ SENSIBILIDADE DE UM ISOLADO? Metodologia Qualitativa Disco difusão Metodologia quantitativa Diluição em caldo - Macrodiluição - Microdiluição Ágar-diluição E-test Automação 28

29 Ágar diluição Placas de ágar com concentrações seriadas do fármaco placas/ fármaco 1 placa para cada diluição Várias bactérias/ placa - Uso de multi-inoculador l (10 4 UFC/ml) 29

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31 Vantagens Possibilidade de testar vários isolados em uma única placa Custo relativamente baixo Quantitativo Desvantagens Trabalhoso - Preparo de placas, inóculos, etc Espaço para armazenamento Leitura 31

32 COMO AVALIAR A RESISTÊNCIA/ SENSIBILIDADE DE UM ISOLADO? Metodologia Qualitativa Disco difusão Metodologia quantitativa Diluição em caldo - Macrodiluição - Microdiluição Ágar-diluição E-test Automação 32

33 E-test Fita plástica - De um lado concentrações crescentes do antimicrobiano - Outro lado escala das concentrações Principio - Gradiente de difusão do agente no ágar 33

34 Molécula pequena - elipse grande Molécula grande - elipse pequena 34

35 E-test Principio - Gradiente de difusão do agente no ágar Teste - Semear superfície da placa com micro-organismo - Swab - Suspensão 1-2 x 10 8 UFC/ml - Aguardar secar a placa - Colocar as fitas - Incubar - Leitura da CIM - Usar critérios de referencias - CLSI - EUCLAST - BRCAST 35

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37 IMPORTANTE CIM determinado com E-test é concordante com Ágar Diluição Microdiluição em caldo Por ser teste comercial - Não é padronizado pelo CLSI - Aceito pelo FDA e ASM 37

38 Vantagens Versatilidade - 15 diluições em 1 fita Simplicidade Reprodutibilidade +100 antimicrobianos - Flexibilidade na escolha de agentes Estável por até 5 anos Desvantagens Custo(?) Número de testes por placa (?) 38

39 COMO AVALIAR A RESISTÊNCIA/ SENSIBILIDADE DE UM ISOLADO? Metodologia Qualitativa Disco difusão Metodologia quantitativa Diluição em caldo - Macrodiluição - Microdiluição Ágar-diluição E-test Automação 39

40 Automação 3 plataformas oferecidas no Brasil VITEK 2 e VITEK2 Compact Identificação de patógeno (ID) + avaliação suscetibilidade (AST) - 5 8h Resultados CIM comprovadamente correlacionados aos métodos referencia - Cleared pelo US FDA - Com selo CE conformidade europeia 40

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42 VITEK2 Como é o sistema Cartões 42

43 Gram Suspensão 3ml salina Densicheck 43

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45 INFORMAÇÕES NA TELA Nos cartões de AST fornece informações como: Antimicrobiano Valor do MIC Interpretações do teste Passando o mouse aparece a família do antibiótico Nos cartões de ID fornece informações como: Testes bioquímicos Número dos poços Reações pos e neg Nome do teste do poço 45

46 PRINCÍPIO DO TESTE Comparação da turvação Controle x concentrações antimicrobianos A cada 15 min Curvas de crescimento no Poço Controle e nos poços com concentrações do antimicrobiano Concentração C1<C2<C3 46

47 MIC 8ug/ml 32ug/ml 128ug/ml? Comparação com o banco de dados do equipamento Conc. ATB Valor turbidez amostra REF C1 C2 C Base de dados MIC = 32 47

48 AUTOMAÇÃO Vantagens Automático Simples Rápido Padronização Desvantagens Limitações para bactérias com mecanismos de resistência induzíveis - Rápida incubação Custo (?) 48

49 Inútil para sinusite EU NÃO AJUDO NA TOSSE 49

50 P I O N E E R I N G D I A G N O S T I C S