UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA MEDICINA. Disciplina de Microbiologia Humana

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1 UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA MEDICINA Disciplina de Microbiologia Humana AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA 2014

2 ÍNDICE LEMBRETES IMPORTANTES... 3 RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS... 3 MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA... 5 MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO... 8 CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS GENÉTICA BACTERIANA (CONJUGAÇÃO)... Erro! Indicador não definido. DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS STREPTOCOCCUS STAPHYLOCOCCUS PSEUDOMONAS ENTEROBACTÉRIAS... 26

3 LEMBRETES IMPORTANTES 1. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas, é necessário o uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em uma sacola ou saco plástico, de modo a evitar possível contaminação do ambiente fora do laboratório. 2. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são realizados. 3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a bancada ou chão, ferimentos de qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc.). 4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado. 5. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório. 6. Não é permitido o uso de chinelo, sandália ou qualquer outro calçado que deixe os pés expostos. RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS Após o término de cada aula prática, o aluno deverá entregar relatório da(s) atividade(s) do dia ao docente responsável pela mesma. No caso da atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatório correspondente deverá ser entregue ao final da última aula, sendo que o aluno que faltar em pelo menos uma das aulas necessárias para sua conclusão, terá nota igual a zero em seu relatório, mesmo que o entregue. Os relatórios deverão ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente não ocuparem mais que duas folhas. 3

4 Docentes: Bacteriologia Prof. Dr. Augusto Cezar Montelli Prof. Dr. Josias Rodrigues Prof. Dr. Rodrigo Tavanelli Hernandes Profa. Dra. Vera Lúcia Mores Rall 4

5 MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA Nesta aula, será feita a observação de bactérias ao microscópio. Uma das lâminas será corada pelos alunos, conforme roteiro abaixo. As demais já foram coradas e estão prontas para a observação. Na observação das lâminas coradas pelo método de Gram, as bactérias deverão ser classificadas quanto à coloração (como Gram positiva ou negativa), o arranjo (agrupamento) e a morfologia (coco ou bacilo). Além das lâminas coradas pelo método de Gram, será feita a observação de uma lâmina contendo um esfregaço de escarro apresentando bacilos álcool-ácido resistentes (que não se coram pelo método de Gram) e corada pelo método de Ziehl-Neelsen. A) Coloração de Bactérias pelo Método de Gram Material: - Lâminas contendo o esfregaço de bactérias - Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, álcool 95%, fucsina. Procedimento: a) Cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1 minuto. b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol. Esperar 1 minuto. c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto, deixe o álcool cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos. d) Lavar a lâmina em água corrente. e) Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30 segundos a 1 minuto. f) Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de filtro. g) Observar ao microscópio e desenhar. 5

6 Observar e Desenhar: Lâmina A (Escherichia coli) Forma: Arramjo: Gram: Lâmina B (Staphylococcus aureus) Forma: Arranjo: Gram: Lâmina C (Streptococcus agalactiae) Forma: Arranjo: Gram: 6

7 Lâmina D (Bacillus cereus) Forma: Arranjo: Gram: Lâmina E (Neisseria sp.) Forma: Arranjo: Gram: Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR) (Mycobacterium tuberculosis) Lâmina contendo um esfregaço de escarro de um paciente com tuberculose, corada pelo método de Ziehl-Neelsen, apresentando bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR). 7

8 MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias Material: - Cultura A (Escherichia coli) - Cultura B (Staphylococcus aureus) - Cultura C (Streptococcus agalactiae) - Caldo sintético - Caldo comum - Caldo glicosado (caldo comum mais glicose) - Alça de níquel cromo Procedimento: 1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios. 2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte. 3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio). 4. Anotar os resultados. Cultura A (Escherichia coli) B (Staphylococcus aureus) C (Streptococcus agalactiae) caldo sintético Crescimento em: Caldo comum caldo glicosado 8

9 B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano Material: - Meio de Tiogel - Cultura A (Escherichia coli) - Cultura D (Pseudomonas aeruginosa) - Cultura F (Clostridium sp.) - Agulha de níquel cromo Procedimento: Com a agulha de níquel cromo, semear as culturas A e D em tubos de tiogel. Colocar todos os tubos na estufa a 37 C por aproximadamente 18 horas. No dia seguinte, observar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a localização do crescimento. A cultura F será semeada no Laboratório de aula prática do Departamento de Microbiologia e Imunologia, e observada juntamente com as culturas A e D. Culturas A (Escherichia coli) D (Pseudomonas aeruginosa) F (Clostridium sp.) Local de crescimento no meio de Tiogel: Superfície Toda Base do extensão Meio Classificação 9

10 CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS A) Efeito de agentes físicos sobre as bactérias Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada ou não. Material: - Cultura A em ágar inclinado (Escherichia coli, bactéria não esporulada) - Cultura E em ágar inclinado (Bacillus cereus, bactéria esporulada) - Tubo contendo 1 ml da solução salina esterilizada - Placas de Petri contendo ágar nutriente - Banho-Maria a 60º C - Alça de Níquel cromo Procedimento: 1. Inocule (com a alça de níquel cromo) as suspensões bacterianas A e E no quadrante correspondente ao tempo Coloque o tubo com a suspensão em banho-maria a 60º C e, aos 5', 10' e 15', retire amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes da placa de Petri (proceda exatamente como no item 1). 3. Deixe a placa na estufa a 37 C até o dia seguinte. 4. Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++, conforme a intensidade de crescimento). Resultados: Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++) na tabela abaixo. Cultura A (Escherichia coli) E (Bacillus cereus) Tempo de aquecimento

11 B) Efeito de agentes químicos sobre as bactérias: antisséptico para enxague bucal Material: 03 zaragatoas estéreis Anti-séptico bucal de uso comercial 01 placa de ágar-nutriente Procedimento: 1. Divida uma placa de ágar nutriente em 3 quadrantes, marcando A (antes do tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo tratamento). 2. Friccionar uma zaragatoa estéril na mucosa da buchecha e semear no quadrante A em zigue-zague. 3. Bochechar com parte do o anti-séptico bucal fornecido por 1 minuto. 4. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material semeando no quadrante B. 5. Bochechar novamente com o anti-séptico bucal por 1 minuto. 6. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta do material semeando no quadrante C. 7. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte. Resultados: Fazer a leitura das placas, anotando o crescimento microbiano com cruzes (de + a ++++) na tabela abaixo. Crescimento Microbiano A B C A (antes do tratamento) B (depois do primeiro tratamento) C (depois do segundo tratamento) 11

12 C) Efeito de agentes químicos sobre bactérias: álcool iodado a 0,1% Material: 01 tubo contendo aproximadamente 1 ml de álcool iodado a 0,1% 01 Placa de ágar-nutriente 03 zaragatoas estéreis Procedimento: 1. Umedeça uma zaragatoa em um tubo contendo salina. Após retirar o excesso de salina, pressionando a zaragatoa contra a parede do tubo, esfregue-a vigorosamente no dorso de uma das mãos; 2. Passe a zaragatoa em área correspondente à metade de uma placa com ágar nutriente; 3. Umedeça uma segunda zaragatoa em álcool iodado a 0,1% e esfregue no dorso da outra mão; 4. Aguarde 2 minutos para que haja ação do antisséptico; 5. Passe então, nessa área, uma terceira zaragatoa umedecida, tomando cuidado para não ultrapassar a área higienizada. Inocule, passando a zaragatoa na superfície da outra metade da placa com ágar nutriente; 6. Incube a placa na estufa, durante uma noite. 7. Observe a intensidade de crescimento anotando com sinal + na tabela abaixo. Resultados: Observe a intensidade do crescimento microbiano anotando com cruzes (de + a ++++) na tabela abaixo. Crescimento Microbiano Antes do Tratamento Depois do Tratamento 12

13 GENÉTICA BACTERIANA CONJUGAÇÃO Material: 01 Placa de MacConkey contendo ácido nalidíxico (Nal) 01 Placa de MacConkey contendo Cloranfenicol (Clo) 01 placa de ágar MacConkey contendo Nal + Clo Culturas A (Escherichia coli C600, lac - ), B (Escherichia coli J53, lac + ) e M (cultura A + cultura B) em meio líquido Alça de níquel cromo Procedimento: 1. Semeie as amostras A, B e a mistura (M) nas placas contendo meio seletivo MacConkey, com antibóticos (Nal + Clo), conforme o esquema abaixo. 2. Para controle das culturas A e B, semeie cada uma das culturas recebidas para essa aula prática em placas de ágar MacConkey contendo Nal e Clo (separadamente), visando definir a capacidade das amostras em fermentar da lactose e o perfil de resistência. 3. Incube as placas a 37ºC até o dia seguinte. 13

14 Resultados: Registre os resultados obtidos na tabela abaixo: Bactéria Crescimento em ágar MacConkey: Nal Clo Nal + Clo Fermentação da lactose Padrão de Resistência A B M Nal (ácido nalidíxico, 50 g/ml), Clo (cloranfenicol, 50 g/ml ) Quais as hipóteses possíveis para explicar o ocorrido? Como você poderia comprovar a sua hipótese utilizando métodos moleculares? 14

15 Análise Molecular do Experimento de Conjugação Eletroforese do DNA em gel de agarose das amostras A, B e da resultante da mistura M Atividade: Identifique o perfil plasmidial de cada uma das amostras empregadas nessa aula prática no gel apresentado acima. Perfil Plasmidial Amostra 15

16 DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS Interpretação de Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby Material: - Culturas bacterianas em Ágar Müeller-Hinton crescidas em contato com 5 discos contendo drogas distintas - Régua - Tabela de referência Procedimento: 1. Com o auxílio da régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento. 2. Consultar a tabela de referência, para interpretar os resultados e anotar no quadro abaixo Droga Concentração ( g/ml) Diâmetro do halo de inibição do crescimento Interpretação* * S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário. 16

17 STREPTOCOCCUS EXERCÍCIOS A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas C, D e E. Verificar o tipo de hemólise. Cultura C D E Hemólise B) Observar a coloração de Gram das culturas C e E. Cultura C Cultura E 17

18 C) Prova da catalase. Colocar sobre a cultura C (em caldo) e sobre uma cultura controle positivo (Staphylococcus aureus) algumas gotas de água oxigenada. Verificar a reação e anotar o resultado (Positivo = formação de bolhas). Cultura C Staphylococcus aureus (Controle +) Catalase D) Prova de sensibilidade à bacitracina. Princípio: O princípio desta prova baseia-se na inibição de crescimento do Streptococcus pyogenes ( -hemolítico, grupo A) frente a uma pequena quantidade de bacitracina. Técnica: Verificar se ocorre uma zona de inibição de crescimento ao redor do disco de papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura C. Leitura: sensível: existência de uma zona de inibição do crescimento. resistente: ausência de zona de inibição de crescimento. 18

19 E) CAMP Teste Princípio: A atividade da hemolisina do S. aureus é aumentada pela atividade hemolítica do S. agalactiae ( -hemolítico do grupo B). Técnica: Verificar zona de hemólise, em placa de ágar sangue (feito c/ sangue de carneiro), semeada com a cultura D e S. aureus. Leitura: resultado - positivo: formação de uma zona de hemólise semelhante à "ponta de flecha" na união das duas hemolisinas. negativo: não formação de "ponta de flecha". F) Prova da bilesolubilidade Princípio: Esta prova verifica a sensibilidade da bactéria à lise por sais biliares Técnica: Adicionar 0,1 ml de uma solução a 10% de desoxicolato de sódio a 1 ml da cultura D. Incubar a 37 o C e examinar após 15 minutos. Anotar o resultado. Fazer o mesmo com a cultura E. Leitura. Resultado positivo (suspensão solúvel) - a cultura fica transparente. Resultado negativo (suspensão insolúvel) - a cultura permanece turva. Cultura D E Bile-solubilidade G) Identificação das culturas Cultura C Cultura D Cultura E 19

20 STAPHYLOCOCCUS A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Cultura A Características das Colônias Hemólise B B) Observar esfregaço da cultura A, corada pelo método de Gram e desenhar. Observar ao microscópio e desenhar. Cultura A 20

21 C) Prova da Catalase Colocar sobre as culturas A e B e sobre uma cultura controle algumas gotas de água oxigenada. Observar a reação e anotar o resultado. Cultura A B Prova da Catalase D) Prova da Coagulase Princípio: A coagulase é uma enzima bacteriana que age sobre o plasma sanguíneo. Técnica: Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho a 1%. Incubar a 37 o C e observar durante 4 horas. Fazer o mesmo com a cultura B e anotar os resultados. Resultado positivo - formação de coágulo. negativo - suspensão inalterada Cultura A B Prova da Coagulase E) Compilação dos resultados e Identificação das culturas Cultura A Cultura B Hemólise Catalase Coagulase Identificação 21

22 ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO DOS GÊNEROS Staphylococcus e Micrococcus (família Micrococaceae) Cocos Gram positivos Isolados ou agrupados Catalase + O OF Micrococcus sp Staphylococcus sp Coagulase 22

23 ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO Família: Streptococcaceae Gênero: Streptococcus (cocos Gram positivos aos pares ou em cadeia) Catalase (-) Tipo de hemólise Optoquina Bilesolubilidade Letalidade em camundongos Bacitracina S R (+) (-) (+) (-) S* R* S. pneumoniae S. -hemolítico S. pneumoniae S. -hemolítico S. pneumoniae S. -hemolítico S. pyogenes (g. A) Streptococcus (quaisquer dos grupos de Lancefield, exceto o A) S = sensível; R = resistente provas sorológicas (grupos de Lancefield) 23

24 PSEUDOMONAS 1. Observar placa de ágar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa. Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Observar, também, a pigmentação verde do crescimento em ágar simples uma característica peculiar da espécie. Cultura Característica das colônias P. aeruginosa 2. Corar, pelo método de Gram, esfregaço da cultura de Pseudomonas aeruginosa. Observar ao microscópio e desenhar. Pseudomonas aeruginosa 24

25 3. Teste de fermentação de Glicose Observar uma cultura de Pseudomonas aeruginosa e uma de Escherichia coli em caldo glicosado contendo vermelho fenol ou indicador andrade. Interpretar a diferença de cor das culturas bacterianas e anotar os resultados na tabela abaixo. Cultura Cor da Meio Fermentação da Glicose Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli 4. Prova da Citrocromo-oxidase Fazer prova da citocromo-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com uma cultura de Escherichia coli, para fins de comparação. Anotar o resultado. Cultura Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Prova da citocromo-oxidase 25

26 ENTEROBACTÉRIAS 1. Observar a coloração das colônias das bactérias A, B e C cultivadas em placas de ágar MacConkey e SS. Anotar os resultados da prova de lactose. Cultura A B C D Coloração da colônia em MacConkey SS Lactose 2. Interpretar crescimento das culturas A, B, C e D em meio de EPM, MILi e citrato de Simmons (conforme orientação nas páginas 26 e 27) Anotar abaixo os resultados (+ ou -) das provas para cada cultura. Prova Cultura A B C D Citrato Glicose Gás Urease H 2 S LTD* Motilidade Lisina Indol Lactose** *LTD = L-triptofano desaminase ** Ver resultados nos meios de isolamento (item 1) Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da página 28, identificar cada uma das culturas. Culturas: A B C D 26

27 3. Reação sorológica para confirmação dos resultados de identificação bioquímica. Fazer reação de aglutinação em lâmina com as culturas B e C, utilizando os soros anti - S. flexneri e anti - Salmonella sp. Anotar os resultados (positivo ou negativo). Soro Anti - Shigella flexneri Anti Salmonella sp. B Cultura C 27

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30 Prova E. coli Shigella Edwardsiella flexneri tarda Perfil Bioquímico e Motilidade de Algumas Enterobactérias Salmonella Citrobacter sp freundii Klebsiella pneumoniae Enterobacterc loacae Serratia Proteus Proteus marcescens mirabilis vulgaris Morganella morganii Providencia rettigeri Citrato ou ou - + ou Glicose Gás + ou ou ou - + ou - + ou - Urease ou ou - + ou - + ou H 2 S LTD* Motilidade + ou ou - + Lisina + ou Indol + + ou Lactose ou ou *LTD = L-triptofano desaminase 30