UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

Transcrição

1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E ANTIPROLIFERATIVA DA ESPÉCIE Luehea candicans MART et ZUCC. (TILIACEAE) Dissertação apresentada por Dioni Antunes da Silva ao Programa de Pós- Graduação em Química do Departamento de Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Estadual de Maringá, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química. MARINGÁ, DEZEMBRO DE 2004

2 Quanto a você, porém, permaneça nas coisas que aprendeu e das quais tem convicção, pois você sabe de quem aprendeu. Porque desde criança você conhece as Sagradas letras, que são capazes de torná-lo sábio para salvação mediante a fé em Cristo Jesus. 2 Timóteo 3: 14,15 (NVI)

3 Agradecimentos - À Professora Doutora Cleuza Conceição da Silva pela orientação, paciência e dedicação. - À Professora Doutora Maria Conceição de Souza, Departamento de Biologia, pela coleta e identificação da planta. - Aos Professores Doutores Celso Vataru Nakamura e Benedito Prado Dias Filho, Departamento de Análises Clínicas, pela realização dos ensaios de atividade antibacteriano e antifúngico. - Ao Doutor João Ernesto de Carvalho, Instituto CPQBA (UNICAMP), pela realização dos ensaios de atividade antiproliferativa. - Aos professores do curso de mestrado em Química Aplicada pela formação. - À professora Doutora Silvana Maria de Oliveira Santin pela orientação na realização do estágio docência. - Aos colegas da Universidade Estadual de Maringá, pelos inúmeros serviços prestados, em particular ao Cláudio, Ana e Claudemir. - À Ivânia pela valiosa contribuição e também pela obtenção dos espectros. - Aos acadêmicos e amigos Vanessa, Anelise, Júlio, Anderson, Conceição, Fábio, Isis e Lílian. - A todos os professores, funcionários e amigos pela convivência durante este período. - Ao CNPq, pelo suporte financeiro e à CAPES pela bolsa concedida para realização deste trabalho. - Finalmente, ao Sivaldo pela compreensão, paciência e presença nos momentos difíceis.

4 SUMÁRIO 1 Introdução e objetivo Introdução Objetivos 4 2 Revisão Bibliográfica Família Tiliaceae Gênero Luehea 11 3 Parte Experimental Matérias e métodos Estudo químico de Luehea candicans Coleta e secagem do material botânico Isolamento dos principais constituintes químicos dos galhos de Luehea candicans Preparação e fracionamento do extrato bruto dos galhos Tratamento da fração LCG-4 (fração clorofórmica) Tratamento da fração LCG-5 (fração CHCl 3 /MeOH 25%) Tratamento da fração LCG-6 (fração CHCl 3 /MeOH 50%) Tratamento da fração LCG-7 (fração CHCl 3 /MeOH 75%) Isolamento dos principais constituintes químicos das folhas de Luehea candicans Preparação e fracionamento do extrato bruto das folhas Tratamento da fração LCF-2 (fração clorofórmica) Tratamento da fração LCF-3 (fração acetato de etila) Tratamento da fração LCF-4 (fração metanólica) 24 4 Resultados e Discussão Método de extração e isolamento dos constituintes químicos de L. candicans Determinação estrutural dos compostos isolados Substância LC Substância LC-2 41

5 4.2.3 Substância LC Substância LC Substância LC Substância LC Substância LC Dados espectroscópicos das substâncias isoladas Substância LC-1: lup-20(29)-en-3β-ol Substância LC-2 : Mistura dos compostos: LC-2(I) 24ξ- etil- colest- 5 enol, LC-2(II)24ξ- etil- colesta- 5, 22- dienol, LC-2(III) 24ξ- metil- colest- 5 enol Substância LC-3: 3β,28-diidróxilup-20(29)-ene Substância LC-4: 3β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5enol Substância LC-5: 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2Hbenzopiran-3,5,7-triol Substância LC-6: (siringaresinol-(2,6-bis(4,4 -Obis-β-D-glicosídeo-3,5 -dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo) Substância LC-7: 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi- 2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona 91 5 Estudo da atividade biológica Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto dos galhos e do extrato bruto das folhas Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos e substâncias isoladas Avaliação da atividade antiproliferativa Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto das folhas e frações Hexano, CHCl 3, AcOEt e MeOH Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto dos galhos e frações Hexano, CHCl 3, CHCl 3 / MeOH (50%) e MeOH 99 6 Conclusões Referências Bibliográficas 105

6 INDICE DE ESQUEMAS ESQUEMA 1: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna cromatográfica do extrato bruto dos galhos e para o 15 isolamento de seus principais constituintes químicos ESQUEMA 2: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna cromatográfica do extrato bruto das folhas e para o 21 isolamento de seus principais constituintes químicos ESQUEMA 3: Provável fragmentação de LC-1 33

7 INDICE DE FIGURAS FIGURA 1: Luehea candicans árvore 3 FIGURA 2: Luehea candicans flores 3 FIGURA 3: Espectro no IV de LC-1 31 FIGURA 4: Espectro de massas (70 ev) de LC-1 32 FIGURA 5: Espectro de RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-1 35 FIGURA 6: Mapa de contornos 1 Hx 1 H COSY (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-1 37 FIGURA 7: Espectro de RMN 13 C e DEPT 90 o e135 o (75 MHz, CDCl 3 ) de 39 LC-1 FIGURA 8: Mapa de contornos HETCOR ( 13 C x 1 H, CDCl 3 ) de LC-1 40 FIGURA 9: Cromatograma da mistura LC-2 42 FIGURA 10: Espectro de massas (70 ev) de LC-2(I) 42 FIGURA 11: Espectro de massas (70 ev) de LC-2(II) 43 FIGURA 12: Espectro de massas (70 ev) de LC-2(III) 43 FIGURA 13: Espectro de RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-2 44 FIGURA 14: Espectro de RMN 13 C e DEPT 90 o e135 o (75 MHz, CDCl 3 ) de 45 LC-2 FIGURA 15: Espectro no IV de LC-3 49 FIGURA 16: Espectro de massas (70 ev) de LC-3 50 FIGURA 17: Espectro de RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-3 52 FIGURA 18: Mapa de contornos 1 Hx 1 H COSY (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-3 53 FIGURA 19: Espectro de RMN 13 C e DEPT 90 o e135 o (75 MHz, CDCl 3 ) de 56 LC-3 FIGURA 20: Mapa de contornos HETCOR ( 13 C x 1 H, CDCl 3 ) de LC-3 57 FIGURA 21: Espectro de RMN 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-4 59 FIGURA 22: Espectro de RMN 13 C e DEPT 90 o e135 o (75 MHz, CDCl 3 ) de 61 LC-4 FIGURA 23: Espectro no IV de LC-5 63 FIGURA 24: Espectro de massas (70 ev) de LC-5 64 FIGURA 25: Espectro de RMN 1 H (300 MHz, CD 3 OD) de LC-5 67

8 FIGURA 26: Espectro de RMN 13 C e DEPT 90 o e135 o (75 MHz, CD 3 OD) de 68 LC-5 FIGURA 27: Espectro de massas (70 ev) de LC-6 69 FIGURA 28: Espectro de RMN 1 H (300 MHz, D 2 O) de LC-6 71 FIGURA 29: Espectro de RMN 13 C e DEPT 90 o e135 o (75 MHz, D 2 O) de 72 LC-6 FIGURA 30: Mapa de contornos HMQC (75 MHz, D 2 O) de LC-6 73 FIGURA 31: Mapa de contornos 1 Hx 1 H COSY (300 MHz, D 2 O) de LC-6 74 FIGURA 32a: Mapa de contornos NOESY (300 MHz, D 2 O) de LC-6 75 FIGURA 32b: Mapa de contornos NOESY de LC-6 (expansão) 76 FIGURA 33: Mapa de contornos HMBC (300 MHz, D 2 O) de LC-6 77 FIGURA 34: Correlações de HMBC de LC-6 78 FIGURA 35: Espectro no IV de LC-7 81 FIGURA 36: Espectro de massas (70 ev) de LC-7 82 FIGURA 37: Espectro de RMN 1 H (300 MHz, DMSO) de LC-7 84 FIGURA 38: Espectro de RMN 13 C e DEPT 90 o e135 o (75 MHz, DMSO) de 85 LC-7 FIGURA 39: Doxorrubicina Controle positivo do teste antiproliferativo 97 FIGURA 40: Teste antiproliferativo do extrato bruto das folhas de L. 97 candicans FIGURA 41: Teste antiproliferativo da fração hexano (folhas) 98 FIGURA 42: Teste antiproliferativo da fração CHCl 3 (folhas) 98 FIGURA 43: Teste antiproliferativo da fração MeOH (folhas) 98 FIGURA 44: Teste antiproliferativo da fração AcOEt (folhas) 99 FIGURA 45: Teste antiproliferativo do extrato bruto dos galhos de L. 100 candicans FIGURA 46: Teste antiproliferativo da fração hexano (galhos) 101 FIGURA 47: Teste antiproliferativo da fração CHCl 3 /MeOH (50%) (galhos) 101 FIGURA 48: Teste antiproliferativo da fração CHCl 3 (galhos) 102 FIGURA 49: Teste antiproliferativo da fração MeOH (galhos) 102

9 INDICE DE TABELAS TABELA 1: Fracionamento preliminar do extrato bruto dos galhos 15 TABELA 2: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-4 16 TABELA 3: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-5 17 TABELA 4: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-6 18 TABELA 5: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7 19 TABELA 6: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG TABELA 7: Dados do fracionamento do extrato bruto das folhas 21 TABELA 8: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2 22 TABELA 9: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF TABELA 10: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF TABELA 11: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-4 24 TABELA 12: Linhagens de células tumorais utilizadas no teste de atividade antiproliferativa 28 TABELA 13: Dados de RMN 1 H de LC-1 e do lupeol 34 TABELA 14: Correlações observadas nos espectros HETCOR ( 13 C x 1 H) e COSY ( 1 H x 1 H) de LC-1 36 TABELA 15: Dados de RMN 13 C/DEPT de LC-1 e do lupeol 38 TABELA 16: Dados de RMN 13 C/DEPT da mistura LC-2 e da mistura 24α etil- colest- 5 enol (sitosterol), 24α etil- colesta- 5, 22- dienol 46 (estigmasterol) e 24ξ metil- colest- 5 enol TABELA 17: Dados de RMN 1 H para os metilas de LC-2(I) e do 24α metil- colest- 5 enol(campesterol) e 24β metil- colest enol(22,23 diidrobrassicasterol) TABELA 18: Dados de RMN 1 H para os metilas de LC-2(II) e do 24α etilcolest- 5,22- dienol(estigmasterol) e 24β etil- colest- 5,22-47 dienol(poriferasterol) TABELA 19: Dados de RMN 1 H para os metilas de LC-2(III) e do 24α etil-

10 colest- 5 enol(sitosterol) e 24β etil- colest enol(clionasterol) TABELA 20: Dados de RMN 1 H de LC-3 e da betulina 51 TABELA 21: Correlações observadas nos espectros HETCOR ( 13 C x 1 H) e COSY ( 1 H x 1 H) de LC-3 54 TABELA 22: Dados de RMN 13 C/DEPT de LC-3 e da betulina 55 TABELA 23: Dados de RMN 1 H de LC-4 e do glicopiranositosterol 60 TABELA 24: Dados de RMN 13 C/DEPT de LC-4 e do glicopiranositosterol 62 TABELA 25: Dados de RMN 1 H de LC-5 e da ( )-epicatequina 65 TABELA 26: Dados de RMN 13 C / DEPT de LC-5 e da ( )-epicatequina 66 TABELA 27: Correlações observadas nos mapas de contornos ( 13 C x 1 H) HMQC, ( 1 H x 1 H) COSY e NOESY da substância LC-6 78 TABELA 28 Correlações observadas no mapa de contornos HMBC da substância LC-6 79 TABELA 29: Dados de RMN 1 H de LC-6 e da liriodendrina 79 TABELA 30: Dados de RMN 13 C/DEPT de LC-6 e da liriodendrina 80 TABELA 31: Dados de RMN 1 H de LC-7 e da vitexina 83 TABELA 32: Dados de RMN 13 C/DEPT de LC-7 e da vitexina 86 TABELA 33: Atividade antibactriana do extrato bruto das folhas e galhos de L. candicans 94 TABELA 34: Atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos 95 galhos de L. candicans TABELA 35: Atividade antiproliferativa ( efeito citostático) dos extratos brutos das folhas e das frações Hexano, CHCl 3, AcOEt e 96 MeOH de L. candicans TABELA 36: Atividade antiproliferativa ( efeito citostático) dos extratos brutos dos galhos e frações Hexano, CHCl 3, CHCl 3 / MeOH 99 (50%) e MeOH de L. candicans

11 ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ATCC CC CCD COSY D Dd Dl DEPT DMSO EM EV HETCOR HMBC HMQC IV J M M.+ m/e NOESY Ppm Q S Sl T TMS UFC UV δ American Type Culture Collection Cromatografia em coluna Cromatografia em camada delgada 1 H- 1 H Correlation Spectroscopy Dubleto Duplo Dubleto Dubleto Largo Distortionless Enhancement By Polarization Transfer Dimetilssulfóxido Espectro de massas Elétron Volt Heteronuclear Correlation Spectroscopy Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heteronuclear Multiple Quantun Coherence Infravermelho Constante de acoplamento, em Hertz Multipleto Íon molecular Relação massa/carga Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy Partes por milhão Quarteto Singleto Singleto largo Tripleto Tetrametilsilano Unidade Formadora de Colônia Ultravioleta Deslocamento químico (em ppm)

12 RESUMO A espécie Luehea candicans Mart. et Zucc., (Tiliaceae), conhecida popularmente como mutamba-preta e açoita cavalo, está distribuida nos Estados de Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e floresta latifoliada semidecídua da bacia do Paraná. Pouco se conhece a respeito dos constituintes químicos presentes no gênero Luehea, e o único estudo químico descrito na literatura para espécie do gênero, o qual foi realizado anteriormente em nosso laboratório de pesquisa, relata o isolamento de um triterpeno, da classe dos ursenos e outro dos oleanenos, da espécie Luehea divaricata, da qual também foram obtidos uma flavona e um flavonol. O presente estudo envolveu a extração, isolamento, identificação dos constituintes químicos dos galhos e folhas de L. candicans, e ainda ensaios biológicos para avaliação da atividade antibacteriana, antifúngica e antiproliferativa dos extratos brutos, frações e substâncias isoladas. Do extrato bruto metanólico dos galhos foram isolados dois triterpenos pertencentes à classe dos lupanos, o lup-20(29)-en-3β-ol (lupeol) e o 3β,28-diidróxilup-20(29)-eno (betulina), a mistura dos esteróides 24ξ- etil- colest- 5 enol (sitosterol), 24ξ- etil- colesta- 5, 22- dienol (estigmasterol) e 24ξ- metil- colest- 5 enol, o esteróide glicosilado 3-β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5-enol (3-O-β-Dglicopiranosilsitosterol), o flavan-3-ol, 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2Hbenzopiran-3,5,7-triol [(-)-epicatequina] e a lignana (+)-siringaresinol di- O-β-D-glicopiranosídeo (liriodendrina). Do extrato bruto metanólico das folhas foi isolada a flavona C- glicosilada 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-Hbenzopiran-4-ona (vitexina). Os extratos brutos dos galhos e folhas tiveram suas atividades antibacteriana, antifúngica e antiproliferativa testadas. Nenhum dos extratos apresentou atividade antibacteriana através da metodologia

13 empregada. O extrato bruto das folhas apresentou atividade antifúngica contra a cepa Candida krusei. O extrato bruto das folhas de L. candicans apresentou atividade antiproliferativa, com efeito citostático de 85% (25μg/mL) e efeito citocida em 25%, na maior concentração utilizada, para células de câncer de rim. As frações hexano, CHCl 3 e MeOH apresentaram efeito citastático em 100%, na maior concentração utilizada, também para células de câncer de rim. O extrato bruto dos galhos apresentou atividade antiproliferativa concentração dependente com efeito citostático e pequena seletividade entre as linhagens estudadas. A atividade antifúngica dos triterpenos, esteróides e flavonóides isolados foi testada, e nenhuma das substâncias foi ativa através da metodologia empregada. Palavras-chave: Luehea candicans; triterpenos; flavonóides; lignana; atividade biológica

14 ABSTRACT The species Luehea candicans Mart. et Zucc., ( Tiliaceae), popularly known as mutamba- preta and açoita cavalo, it is found in the states of Minas Gerais, Mato Grosso do Sul and forests of Paraná s basin. Little is known about the chemical components presented in the genus Luehea, and the only chemical research described in the literature for the species of the genus, which was made in our laboratory of research previously, reports the isolation of a triterpene, of the class of the ursenes and another of the oleanenes, of the species Luehea divaricata, from which was obtained also a flavone and a flavonol. The following study involved the extraction, isolation, identification of the chemical components of the branches and leaves of the L. candicans, besides biological essays to evaluate the antibacterial, antifungal and antiproliferative activity of the crude extracts, fractions and isolated substances. From the crude methanolic extract of the branches were isolated two triterpenes belonging to the class of the lupanes, the lup- 20 (29)- en- 3ß -ol (lupeol) and the 3ß, 28- dihydroxylup-20 (29)-ene (betulin), the mixture of the steroid 24ξ-ethylcholest-5-enol ( sitosterol), 24ξethylcholesta-5,22-dienol (stigmasterol) and 24ξ-methylcholest-5-enol, the glucosiled steroid 3-ß-O-glucopyranosyl-24ξ-ethylcholest-5-enol (3-Oß-D-glucopyranosylsitosterol), the flavan-3-ol, 2-(3,4-dihydroxyphenil)- 3,4-dihydro-1-2H-benzopyran-3,5,7- triol [(-)-epicatechin] and the lignan (+)- syringaresinol di-o-ß-d-glucopyranoside (liriodendrin). From the crude methanolic extract of the leaves it was isolated the (-glucoside 8- ß-D-Glucopyranosyl-5, flavone 7- dihydroxy-2-(4- hydroxyphenil)-4-h-benzopyran-4-one (vitexin). The crude extracts of the branches and leaves had their antibacterial, antifungal and antiproliferative activities tested. None of the extracts presented antibacterial activity through the methodology

15 employed. The crude extract of the leaves presented antifungal activity against Candida Krusei. The crude extract of the leaves of L. candicans presented antiproliferative activity with inhibition of growth of 85% (25μg/mL) and cellular death in 25%, in the major concentration utilized, to cells of cancer of kidney. The fractions hexane, CHCl 3 and MeOH presented inhibition of growth in 100%, in the major concentration utilized, also, to the cells of kidney s cancer. The crude extract of the branches presented anticancer activity, dependent concentrations with inhibition of growth and small selectivity between the lineages studied. The antifungal activity of the triterpenes, steroids and isolated flavonoids it was tested, and none of the substances tested presented any activity. Key words: Luehea candicans; triterpenes; flavonoids; lignan; biological activity

16 1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS 1.1 INTRODUÇÃO Há cerca de 15 anos o grupo de pesquisa do Nupélia/UEM iniciou o levantamento florístico direcionado às espécies nativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná, região considerada como área de preservação ecológica do Estado. Esta região abriga uma grande diversidade de ambientes, incluindo florestas do tipo estacional semidecídua, submontana e mata ciliar. Existem ainda, várzeas paludícula e aquática em áreas alagadas das lagoas temporárias ou permanentes. Um dos objetivos deste levantamento é apresentar uma listagem das espécies presentes nesta área e correlacioná-las com sua distribuição na América do Sul, acompanhando principalmente a vegetação que segue o leito do rio Paraná, através de outros estados brasileiros e outros países como Argentina e Paraguai. Muitas espécies mapeadas nesta região não possuem estudo químico e/ou de atividade biológica descritos na literatura e algumas já estão incluídas entre as ameaçadas de extinção no Estado do Paraná, sendo que dentre estas encontra - se a espécie Luehea candicans (Vazzoler e col.1997). Este levantamento tem ainda o objetivo de contribuir para a ampliação do conhecimento do potencial químico e farmacológico de tais espécies, bem como dar suporte à classificação botânica das mesmas, com base em estudos qimiotaxonômicos. Desta forma, considerando que alguns estudos químicos de plantas bioativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná, estão sendo desenvolvidos de forma interdisciplinar entre pesquisadores do NUPÉLIA, Biologia, do grupo de Produtos Naturais (DQI) e Análises Clínicas, optou-se pelo estudo químico de Luehea candicans, o qual se somará ao estudo da espécie L. divaricata, realizado em nosso laboratório de pesquisa, sendo este o primeiro no gênero.

17 Pertencente à família Tiliaceae, a qual compreende aproximadamente cerca de 35 gêneros e 370 espécies e tem o sul da África e o Brasil como os dois principais centros de dispersão, sendo que no Brasil encontra-se cerca de 13 gêneros e de 55 a 60 espécies (Barroso e col., 1978), a espécie L. candicans (Figuras 1 e 2) conhecida popularmente como mutamba-preta e açoita-cavalo, ocorre também nos Estados de Minas Gerais e Mato Grosso do Sul (Lorenzi,1998). Na classificação botânica segundo Cronquist (1988), a espécie Luehea candicans pertence à seguinte posição sistemática: Divisão: Magnoliophyta Classe: Magnoliopsida Sublcasse: Dilleniidae Ordem: Malvales Família: Tiliaceae Tribo: Tilieae (segundo Angely 1965) Gênero: Luehea Espécie: Luehea candicans E segundo Lorenzi (1992) seus dados botânicos são: Nome científico: Luehea candicans Mart. et Zucc. Nomes populares: mutamba-preta, açoita-cavalo. Características morfológicas: árvore com altura de 8-12 m, com tronco de cm de diâmetro. Folhas simples, de coloração prateada. Ocorrência: São Paulo, Minas Gerais e Mato Grosso do Sul, floresta latifoliada semidecídua da bacia do Paraná. Utilidade: a madeira é empregada na confecção de cadeiras, cangas de boi, saltos de calçados, ripas, caibros, etc. Informações ecológicas: planta decídua, heliófita, seletiva higrófita, exclusiva da floresta semidecídua do rio Paraná. Planta rara e de dispersão descontínua. Fenologia: floresce durante os meses de novembro-dezembro. A maturação dos frutos ocorre durante os meses de julho-agosto.

18 FIGURA 1 Luehea candicans : Árvore FIGURA 2 Luehea candicans : Flores

19 1.2 OBJETIVOS O estudo de L. candicans visa ampliar o conhecimento químico e biológico do gênero Luehea que iniciou-se com o estudo da espécie L. divaricata. E ainda, o estudo químico e a avaliação da atividade biológica sevirão de auxílio, contribuição e suporte para a confirmação da classificação botânica desta espécie. Desta forma, considerando que tais informações também poderão contribuir para ampliar o conhecimento do potencial químico e farmacológico das espécies nativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná e com isto, assegurar a preservação de espécies com potencial biológico ainda desconhecidos, este trabalho tem por objetivo: Estudar fitoquimicamente a espécie L. candicans visando isolar e identificar os principais metabólitos secundários presentes nos galhos e folhas. Avaliar a atividade biológica (antibacteriana, antifúngica e antiproliferativa) dos extratos brutos, frações e substâncias isoladas.

20 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Família Tiliaceae Na família Tiliaceae poucas espécies, pertencentes a apenas três dos 35 gêneros, foram estudadas quimicamente, sendo que a maioria dos estudos são com espécies do gênero Corchorus, relatando principalmente o isolamento de cardenolídeos glicosilados. Da espécie C. olitorius foram isolados os cardenolídeos glicosilados (1,2,3,4,5,6,7,8)(Nakamura e col., 1998). R 2 O CH 3 OH O (1) R 1 =a, R 2 =CHO, R 3 =OH (2) R 1 =c, R 2 =CHO, R 3 =OH (3) R 1 =d, R 2 =CHO, R 3 =OH (4) R 1 =b, R 2 =CH 2 OH, R 3 =H (5) R 1 =e, R 2 =CH 3, R 3 =H (6) R 1 =b, R 2 =CH 3, R 3 =H (7) R 1 =a, R 2 =CH 3, R 3 =H (8) R 1 =c, R 2 =CH 3, R 3 =H R 1 O R 3 a HO HO HO O OH O CH 3 OH O c HO CH 3 OH O b HO HO HO O OH O CH 3 O d HO CH 3 OH O OH e HO HO HO O O OH HO HO O OH O CH 3 O OH

21 Venkata (1975) isolou quatro cardenolídeos glicosilados (9), (10), (11), (12), da espécie C. trilocularis. O O RO OH (9) R=β-D-boivonosil (10) R=H (11) R=OMe (12) R=α-L-raminosil Ahmad e colaboradores (1998) isolaram os triterpenos cicloartanos glicosilados (13) e (14), enquanto que Khan e colaboradores (1991) obtiveram os derivados da α-amirina (15), (16) e (17) da espécie C. depressus.

22 O OH OH Glc O (13)

23 O OH OAc Glc O (14) OH HO CO 2 H HO HO 2 C (15) OH HO CO 2 H HO GlcO 2 C (16)

24 H O C O 2 H H O H O 2 C (17) Os triterpenos glicosilados (18) e (19), juntamente com os triterpenos (20), (21) e (22) foram isolados da espécie C. acutangulus por Mahato e col. (1988).

25 CH 2 OR 3 OR 2 R 1 O HO (18) R 1 = HO OH O OH R 2 =R 3 =H MeO (19) R 1 = MeO OMe O OMe R 2 =R 3 =Me (20) R 1=R 2 =R 3 =H (21) R 1 =H, R 2 =R 3 =Me (22) R 1=Ac, R 2 =R 3 =Me Das folhas da espécie C. capsularis foram obtidos os triterpenos (23), (24), (25) e (26) por C. M. Hasan e col. (1984).

26 OH R 3 O O H H R 1 O CH 2 OR 2 (23) R 1 =R 2 =R 3 =H (24) R 1 =R 2 =Ac, R 3 =H (25) R 1 =R 2 =R 3 =Ac (26) R 1 = Glc, R 2 =R 3 =H Do gênero Microcos foram isolados alcalóides piperidínicos, sendo a micropina (27) isolada da espécie M. philippinensis por Aguinaldo (1990) e a piperidina (28) isolada da espécie M. paniculata por Bandara e col. (2000). OH (27) N Me CH 2 OH

27 OMe (28) N Me Me No gênero Grewia, Rosler e colaboradores (1978) isolaram o alcalóide 6- hidróxi-1-metil-β-carbolina (29) das raízes de Grewia mollis e Lakshmi e colaboradores (1976) obtiveram uma δ-lactona (30) das flores de Grewia asiatica. HO N H N CH 3 (29) O O OH (30)

28 2.2 Gênero Luehea No gênero Luehea, algumas espécies são usadas na medicina popular como diuréticas e antinflamatórias (Alice e col.,1985). Braga (1976), assinalou como adstringentes as cascas de L. speciosa Willd. (sinônimo botânico de L. divaricata), e registrou também a presença das espécies L. candicans Mart. et Zucc. (Luehea uniflora St. Hil.) e L. paniculata Mart., assinalando-as como tendo o mesmo uso da primeira. A atividade antifúngica de L. divaricata foi avaliada por Zacchino e colaboradores (1998), obtendo como resultado a ação moderada do extrato diclorometânico na inibição do crescimento de hifas de fungos dermatófitos. Sáens e Nassar (1968) constataram a presença, em pequena quantidade, de alcalóides na espécie L. candida (DC) Mart. Flavonóides, taninos, saponinas e triterpenos/esteróides foram detectados em triagem fitoquímica dos extratos etanólicos das folhas e caules de L. divaricata (Alice e col.,1985), cujo estudo químico foi realizado em nosso laboratório de pesquisa. No trabalho citado, foram isolados de L. divaricata o triterpeno inédito ácido 3β-p-hidroxibenzoil tormêntico (ácido 3β-p-hidroxibenzoil, 2α,19α-di-hidroxiurs-12-en-28-óico) (31); uma mistura de triterpenos cujo constituinte majoritário é o ácido 2α, 3β-dihidroxiolean-12-en- 28-óico (ácido maslínico), um derivado 2,3 diidroxilado de β-amirina (32) (Tanaka e col., 2003). Além dos triterpenos, foi isolado uma flavona, a vitexina (33) e a (-)- epicatequina (34), um flavonóide pertencente à classe dos flavan-3-ol (Tanaka, 2002). Este foi o primeiro relato de estudo fitoquímico no genêro Luehea. OH HO COOH HO O O H H (31)

29 HO COOH HO H H (32) OH HO HO O HO HO O OH OH (33) O OH OH HO O OH OH (34)

30 3 PARTE EXPERIMENTAL 3.1 Materiais e métodos Os espectros de massas de baixa resolução foram obtidos em um equipamento GC/MS SHIMADZU a 70 ev, modelo QP 2000A, com sonda para sólidos. Os espectros de absorção na região do IV foram registrados em um espectrofotômetro FTIR-BOMEM MB-100, na região de 400 a 4000 cm -1. Utilizouse a absorção em 1601 cm -1 de um filme de poliestireno como referência. Os espectros de RMN de 1 H e de 13 C foram obtidos em espectrômetro VARIAN, modelo Gemini 2000 BB e Mercury Plus BB (300,6 MHz para 1 H e 75,45 MHz para 13 C). Os deslocamentos químicos foram obtidos em ppm, tendo como referência interna o TMS (δ = 0,0 ppm). Os solventes deuterados utilizados foram DMSO-d 6, CDCl 3, CD 3 OD, Aldrich ou Isotec. As técnicas unidimensionais de RMN utilizadas na obtenção dos dados experimentais visando a elucidação estrutural das substâncias obtidas foram RMN de 1 H, RMN de 13 C, DEPT 90 o e 135 o. Foram também utilizadas em alguns casos, as técnicas bidimensionais COSY 45 o, HETCOR, NOESY, HMQC e HMBC. As cromatografias em coluna foram feitas utilizando sílica gel 60 [(0,063 0,200 mm) ( mesh ASTM)] ou [(0,2-0,5 mm) (35-70 mesh ASTM)] da Merck ou Fluka e o monitoramento das frações foi realizado através de cromatografia em camada delgada analítica (CCDA). A espessura da camada de sílica gel (silica gel GF Merck) usada na confecção das placas de vidro para cromatografia em camada delgada analítica (CCDA) e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foram de 0,25 mm (20x5 cm) e 1,00 mm (20x20 cm). Os solventes utilizados nas CC, CCDP, CCDA e recristalizações apresentavam grau de pureza P.A. ou foram tratados e destilados quando necessário.

31 As substâncias foram visualizadas nas placas de CCDA utilizando reveladores como H 2 SO 4 /MeOH (1:1), iodo e anisaldeído para terpenos (4-metóxibenzaldeído, ácido acético, ácido sulfúrico, / 1,0 : 48,5 : 0,5). As substâncias fluorescentes foram visualizadas sob luz UV nos comprimentos de onda de 254 e 366 nm. 3.2 Estudo químico de Luehea candicans Coleta e secagem do material botânico A planta foi coletada no entardecer do dia 12 de outubro de 2000, na região de Porto Rico, Estado do Paraná, reserva ecológica do NUPÉLIA (UEM). A coleta e identificação do material botânico foi feito pela Prof a Dr a Maria Conceição de Souza. Uma excicata da planta em estudo foi depositada no Herbário do Departamento de Biologia da Universidade Estadual de Maringá, sob número O material foi seco ao ar e pulverizado em moinho, obtendo-se 345,0g das folhas e 432,5g dos galhos Isolamento dos principais constituintes químicos dos galhos de Luehea candicans Preparação e fracionamento do extrato bruto dos galhos O material botânico dos galhos foi submetido ao processo de remaceração exaustiva com metanol (20x 500mL), a temperatura ambiente e concentrado a pressão reduzida em evaporador rotativo (40 o ) obtendo-se 49,0g de extrato bruto. Parte do extrato bruto, 20,0 g, foi adsorvido em sílica gel (31,0g) e submetido a uma separação preliminar em coluna cromatográfica utilizando o sistema de eluentes conforme Tabela 1. O procedimento geral do fracionamento dos galhos está representado no Esquema 1.

32 Tabela 1: Fracionamento preliminar do extrato bruto dos galhos Fração(%) Volume(mL) Massa(g) Código Hexano ,0151 LCG-1 Hex./Clorofórmio ,0415 LCG-2 Hex./Clorofórmio ,0730 LCG-3 Clorofórmio ,7020 LCG-4 CHCl 3 /Metanol ,8979 LCG-5 CHCl 3 /Metanol ,7527 LCG-6 CHCl 3 /Metanol ,9094 LCG-7 Metanol ,1133 LCG-8 LCG-1 HEXANO HEX./CHCl 3 50% GALHOS (430,0g) EXTRATO BRUTO ( 49,0g) CHCl 3 EXTRATO BRUTO 20,0g PRÉ-FRACIONAMENTO CC SILICA GEL CHCl 3 /MeOH 25% CHCl 3 /MeOH 50% CHCl 3 /MeOH 75% LCG-2 LCG-4 LCG-5 LCG-6 LCG-7 LCG-8 MeOH CC sílica gel CC sílica gel CC sílica gel CC sílica gel LC-4 18mg LC-5 9mg LC-7.9 LC-1 16mg LC-2 12mg LC-3 12mg CC sílica gel LC-6 4,3mg Esquema 1: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna cromatográfica do extrato bruto dos galhos e para o isolamento de seus principais constituintes químicos

33 Tratamento da fração LCG-4 (Fração clorofórmica) Parte da fração LCG-4 (620,0 mg) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60( = 1,0 cm e m si = 8,6g) empacotada com hexano e eluída com hexano/ acetato de etila em polaridade crescente. Foram coletadas 125 frações de 10,0mL cada, reunidas em 14 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 2. Tabela 2: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-4 Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância Isolada 1-5 Hexano/AcOEt 2,5 0,1 LCG Hexano/ AcOEt 2,5 19,0 LCG Hexano/ AcOEt 2,5 0,1 LCG Hexano/ AcOEt 5,0 18,1 LCG-4.4 LC-1 (16,0mg) Hexano/ AcOEt 5,0 1,0 LCG Hexano/ AcOEt 5,0 29,3 LCG-4.6 LC-2 (12,0mg) Hexano/ AcOEt 5,0 2,0 LCG Hexano/ AcOEt 7,0 19,7 LCG Hexano/ AcOEt 10,0 31,0 LCG Hexano/ AcOEt 10,0 10,0 LCG Hexano/ AcOEt 15,0 70,4 LCG-4.11 LC-3 (12,0mg) Hexano/ AcOEt 20,0 32,0 LCG Hexano/ AcOEt 50,0 28,0 LCG Hexano/ AcOEt 75,0 13,0 LCG-4.14 Na fração LCG-4.4 formou-se um sólido branco, o qual foi lavado com hexano para remoção de impurezas. A análise por CCDA apresentou uma única mancha. Os dados de RMN de 1 H e de 13 C demonstraram tratar-se de um triterpeno, o qual foi denominado de LC-1. A fração LCG-4.6 também apresentou uma única mancha em CCDA e seus dados de RMN de 1 H e de 13 C demonstraram tratar-se de mistura de esteróides, denominada de LC-2. Esta fração também foi purificada com hexano.

34 Da fração LCG-11 as impurezas foram retiradas utilizando-se acetona, isolando-se também um sólido branco solúvel em clorofórmio. Os dados de RMN de 1 H e de 13 C demonstraram que esta substância também tratava-se de um triterpeno, a qual foi denominada de LC-3. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-se como misturas complexas ou por conterem pouca massa Tratamento da fração LCG-5 (Fração CHCl 3 /MeOH 25%) Parte da fração LCG-5 (700,0mg) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 ( = 1,5cm e m si = 12,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com clorofórmio/acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Desta coluna foram coletadas 103 frações de 10,0mL cada, reunidas em 15 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 3. Tabela 3: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-5 Frações Reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância Isolada 1-2 CHCl 3 /AcOEt 2,5 0,1 LCG CHCl 3 / AcOEt 2,5 19,9 LCG CHCl 3 / AcOEt 2,5 61,7 LCG CHCl 3 / AcOEt 5,0 23,9 LCG CHCl 3 / AcOEt 10,0 96,1 LCG CHCl 3 / AcOEt 10,0 37,8 LCG CHCl 3 / AcOEt 25,0 12,0 LCG CHCl 3 / AcOEt 25,0 85,4 LCG-5.8 LC-4 (10,0mg) CHCl 3 / AcOEt 50,0 68,7 LCG-5.9 LC-4 (8,0mg) CHCl 3 / AcOEt 75,0 19,1 LCG AcOEt 89,6 LCG AcOEt 25,5 LCG AcOEt/MeOH 20,0 10,6 LCG MeOH 10,6 LCC MeOH 92,6 LCG-5.15 Nas frações LCG-5.8 e LCG-5.9 formou-se um precipitado branco, cuja a análise por CCDA apresentou uma única mancha. Os dados obtidos nos

35 espectros de RMN de de 1 H e de 13 C demonstraram tratar-se de um esteróide (LC- 4). As frações LCG-5.5 e LCG-5.15 foram estudadas não tendo sido obtido resultado satisfatório. As demais frações não foram estudadas por apresentaremse como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa Tratamento da fração LCG-6 (Fração CHCl 3 /MeOH 50%) Parte da fração LCG-6 (2,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 ( = 2,5cm e m si = 38,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com clorofórmio/acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 123 frações de 10,0mL cada, reunidas em 11 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 4. Tabela4: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-6 Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância Isolada 1-61 CHCl 3 /AcOEt 5,0-50,0 25,6 LCG AcOEt 28,9 LCG-6.2 LC-5 (9,0mg) AcOEt 42,8 LCG AcOEt /MeOH 10,0 616,3 LCG AcOEt /MeOH 25,0 103,4 LCG AcOEt /MeOH 25,0 249,1 LCG AcOEt /MeOH 25,0 399,5 LCG AcOEt /MeOH 50,0 197,2 LCG AcOEt /MeOH 50,0 116,3 LCG MeOH 193,8 LCG MeOH 42,0 LCG-6.11 Na fração LCG-6.2, formou-se um sólido levemente marrom, solúvel em metanol, o qual foi purificado utilizando-se clorofórmio. A análise por CCDA apresentou uma única mancha. Os dados de RMN de 1 H e de 13 C demonstraram que a substância isolada pertencia à classe dos flavonóides, a qual foi denominada de LC-5. A fração LCC-6.4 foi estudada, não tendo sido obtido

36 resultado satisfatório. As demais frações não foram estudadas por apresentaremse como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa Tratamento da fração LCG-7 (Fração CHCl 3 /MeOH 75%) Parte da fração LCG-7 (5,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 ( = 2,5cm e m si = 60,0g) empacotada com acetato de etila e eluída com acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 95 frações de 10,0mL cada, reunidas em 11 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 5. Tabela 5: Cromatografia em coluna da fração LCG-7 Frações reunidas Eluente(%) Massa(g) Denominação Substância isolada 1-6 AcOEt 0,074 LCG-7.1 LC-5 7 AcOEt 0,455 LCG AcOEt 0,227 LCG AcOEt/MeOH 10,0 0,130 LCG AcOEt /MeOH 20,0 0,180 LCG-7.5 LC AcOEt/MeOH 20,0 0,712 LCG AcOEt/MeOH 20,0-30,0 0,953 LCG AcOEt/MeOH 30,0 0,334 LCG AcOEt/MeOH 30,0-40,0 1,000 LCG AcOEt/MeOH 50,0 0,515 LCG AcOEt/MeOH 75,0 0,199 LCG-7.11 Nas frações LCG-7.1 a LCG-7.5 foi detectado a presença de LC-5. As frações LCG-7.6 a LCG-7.8 foram reunidas por apresentarem flurescência semelhante sob luz ultravioleta, no comprimento de onda λ = 366 nm, e submetidas a uma coluna cromatográfica em silica gel onde nenhum resultado satisfatório foi obtido. A fração LCG-7.9 (1,0g), por apresentar perfil cromatográfico menos complexo, foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 ( = 1,0cm e m si = 12,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em

37 polaridade crescente. Foram coletadas 40 frações de 15,0mL cada, reunidas em 6 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 6. Tabela 6: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7.9 Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância Isolada 1-6 CHCl 3 /MeOH 5,0 18,3 LCG CHCl 3 /MeOH 7,0-10,0 1,7 LCG CHCl 3 /MeOH 15,0 4,3 LCG LC-6 (4,3mg) CHCl 3 /MeOH 20,0 2,9 LCG CHCl 3 /MeOH 25,0-50,0 177,0 LCG CHCl 3 /MeOH 75,0 728,0 LCG Na fração LCG precipitou um sólido branco(4,0mg) solúvel em H 2 O, denominado LC-6. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-se como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa. As frações LCG-1, LCG-2 e LCG-3 não foram estudadas por apresentarem perfil muito complexo e massa insuficiente para dar continuidade aos trabalhos. A fração LCG-8 não foi estudada por apresentar muita quantidade de taninos, visualizados através de cromatografia em camada delgada (MeOH/ H 2 O 50%) que dificultaram o trabalho Isolamento dos principais constituintes químicos das folhas de Luehea candicans Preparação e fracionamento do extrato bruto das folhas As folhas foram submetidas ao processo de remaceração exaustiva com metanol (26x500mL) à temperatura ambiente, concentrado à pressão reduzida em evaporador rotativo (40 o ) obtendo-se 61,0g de extrato bruto.

38 Parte do extrato bruto obtido, 40,0 g, foi adsorvido em silica gel (40,0g) e submetido a uma separação preliminar em coluna cromatográfica utilizando o sistema de eluentes conforme Tabela 7. O procedimento geral do fracionamento das folhas está representado no Esquema 2. Tabela 7: Dados do fracionamento do extrato bruto das folhas Fração Volume(L) Massa(g) Código Hexânica 2,2 0,286 LCF-1 Clorofórmica 2,0 2,789 LCF-2 Acetato de etila 2,0 1,597 LCF-3 Metanólica 2,5 23,855 LCF-4 FOLHAS (345,0g) EXTRATO BRUTO ( 60,0g) EXTRATO BRUTO 40,0g PRÉ-FRACIONAMENTO CC SILICA GEL HEXANO CHCl 3 AcOEt MeOH LCF-1 LCF-2 LCF-3 LCF-4 CC sílica gel Ppt LCF-3p CC sílica gel CHCl 3 / H 2 O (sucessivas lavagens) LC-1 LC-4 11,0 mg LC-7 8,0 mg LC-7 4,0 mg Esquema 2: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna cromatográfica do extrato bruto das folhas e para o isolamento de seus principais constituintes químicos

39 Tratamento da fração LCF-2 (Fração clorofórmica) Parte da fração LCF-2 (2,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 ( = 2,0cm e m si = 20,0g) empacotada com hexano e eluída com hexano/acetato de etila em polaridade crescente. Foram coletadas 64 frações de 15,0mL cada, reunidas em 8 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 8. Tabela 8: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2 Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância isolada 1-14 Hexano/AcOEt 2,5-7,0 173,6 LCF Hexano AcOEt 10,0 114,8 LCF-2.2 LC Hexano/ AcOEt 10,0 160,0 LCF Hexano/ AcOEt 15,0 106,3 LCF-2.4 LC Hexano/ AcOEt 20,0-25,0 220,8 LCF Hexano/ AcOEt 50,0-75,0 215,4 LCF AcOEt 49,1 LCF AcOEt 42,7 LCF-2.8 Na fração LCF-2.2 foi detectada a presença de LC-1 e na fração LCF-2.4 LC-2. As frações LCF-2.6 e LCF-2.7 foram reunidas por apresentarem semelhanças. Esta fração foi denominada LCF-2.6 (264,0mg), e foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 ( = 1,0cm e m si = 10,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 55 frações de 15,0mL cada, reunidas em 5 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 9.

40 Tabela 9: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6 Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação 1-8 CHCl 3 88,0 LCF CHCl 3 /MeOH 2,5 160,0 LCF CHCl 3 /MeOH 2,5-5,0 4,0 LCF CHCl 3 /MeOH 7,0-40,0 2,3 LCF CHCl 3 /MeOH 40,0-80,0 1,0 LCF A fração LCF (160,0mg), por apresentar fluorescência sob luz ultravioleta no comprimento de onda λ = 254 nm, foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 ( = 1,0cm e m si = 8,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 43 frações de 15,0mL cada, reunidas em 4 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 10. Tabela 10: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação 1-11 CHCl 3 14,0 LCF a CHCl 3 /MeOH 1,0 76,0 LCF b CHCl 3 /MeOH 1,5-2,5 52,6 LCF c CHCl 3 /MeOH 5,0 3,0 LCF d A fração LCF-2.6.3b (76,0mg), por apresentar perfil cromatográfico menos complexo foi submetida a uma cromatografia em camada delgada preparativa(ccdp). Foram retiradas quatro faixas sendo que apenas uma apresentou quantidade de massa suficiente para análises espectroscópicas, sendo denominada LCF-2.6b (4,0mg) Tratamento da fração LCF-3 (Fração acetato de etila) A fração LCF-3 foi evaporada à secura e ao ser solubilizada em metanol,para removê-la do balão, houve a formação de um precipitado de coloração

41 amarela. A análise por CCDA apresentou duas manchas com r fs diferentes, uma de cor amarela e outra de cor violeta sob luz visível. As substâncias foram separadas utilizando-se clorofórmio e água. Os dados de RMN de 1 H e de 13 C demonstraram que uma substância isolada pertencia à classe dos flavonóides, a qual foi denominada de LC-7 (8,0 mg) e a outra substância era o esteróide já isolado (LC-4) (11,0 mg). Optou-se por não fazer coluna cromatográfica da fração LCF-3 por apresentar perfil intermediário entre a fração clorofórmica(lcf-2) e a fração metanólica(lcf-4) Tratamento da fração LCF-4 (Fração metanólica) Parte da fração LCF-4 (4,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de silica gel 60 ( = 2,5cm e m si = 50,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com clorofórmio/acetato de etila/ metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 72 frações de 15,0mL cada, reunidas em 7 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 11. Tabela 11: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-4 Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância isolada 1-33 CHCl 3 / AcOEt 10,0-50,0 42,5 LCF AcOEt /MeOH 5,0-10,0 104,8 LCF AcOEt /MeOH 20,0 84,6 LCF-4.3 LC AcOEt /MeOH 30,0 45,0 LCF AcOEt /MeOH 50,0 87,2 LCF AcOEt /MeOH 50,0-75,0 104,8 LCF MeOH 178,0 LCF-4.7 Na fração LCF-4.2 foi detectado através de CCDA, uma mancha de coloração amarela sob luz visível. Esta fração foi purificada com acetato de etila

42 não tendo sido obtido quantidade de massa suficiente para as análises espectroscópicas. Na fração LCF-4.3 foi isolada mais quantidade da substância LC-7 (4,0 mg). As demais frações não foram estudadas por apresentarem um perfil cromatográfico muito complexo. A fração LCF-1 não foi estudada por apresentar pouca massa e perfil cromatográfico muito complexo. 3.3 Estudo de atividade biológica Os testes de atividade antifúngica e antibacteriana foram realizados no Departamento de Análises Clínicas da Universidade Estadual de Maringá, sob coordenação do professor Dr. Benedito Dias Prado Filho e professor Dr. Celso Nakamura. O método usado nos testes foi o da microdiluição descrito por Woods (1995). A avaliação da atividade antiproliferativa foi realizada no CPQBA (UNICAMP), sob responsabilidade do professor Dr. João Ernesto de Carvalho. Os testes de atividade foram realizados segundo método descrito por Skehan e col. (1990) e Monks e col. (1991) Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto dos galhos e das folhas A avaliação da atividade antibacteriana foi feita através do teste de susceptibilidade antibacteriana pelo método de microdiluição. Este método utiliza placas contendo 96 compartimentos, sendo cada compartimento denominado well (poço). Foram utilizadas três placas para verificar a atividade antibacteriana, uma para cada espécie de bactéria, juntamente com os respectivos antibacterianos padrões descritos pela literatura. Cada poço continha aproximadamente 10 μl de caldo de cultura Müller-Hinton para crescimento bacteriano. As drogas utilizadas (padrões e testes) foram diluídas em dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração de 20 mg/ml. Após sucessivas diluições do extrato e das frações em meio de

43 cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se concentração de 2000 μg/ml. A partir dessa concentração foi retirada uma alíquota de 100 μl e iniciou-se a inoculação da droga em sucessivos compartimentos com meio de cultura. As diluições ocorreram no sentido das colunas, uma para cada droga. Ao ser adicionada em um compartimento este era homogeneizado com a mesma pipeta, sendo transferida uma quantidade igual a 100 μl para o poço seguinte. Dessa forma, cada compartimento anterior tinha o dobro da concentração do posterior. O primeiro poço da primeira coluna, portanto, ficou com a primeira droga teste numa concentração de 1000 μg/ml, o segundo com 500 μg/ml, o terceiro com 250 μg/ml, o quarto com 125 μg/ml, o quinto com 62,5 μg/ml, o sexto com 31,75 μg/ml e o último com aproximadamente 15,85 μg/ml. As placas de microdiluição foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi feita, considerando o CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento bacteriano. A concentração mínima bactericida foi determinada retirando uma alíquota de 10 μl (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a droga, mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio de cultura ágar Mueller Hinton, devidamente identificadas. A Concentração Mínima Bactericida (CMB) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga que impediu o crescimento visível do subcultivo. Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente as bactérias Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6623 e Escherichia coli ATCC 25922, utilizando-se como padrões os antibacterianos penicilina, vancomicina e tetraciclina, respectivamente Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos A avaliação utilizou o teste de susceptibilidade antifúngica pelo método de microdiluição. Este método utiliza placas contendo 96 compartimentos, sendo cada compartimento denominado well (poço). Foram utilizadas quatro placas para verificar a atividade antifúngica, uma para cada espécie de fungo, juntamente com

44 o antifúngico padrão descrito pela literatura. Cada poço continha aproximadamente 10 μl de caldo de cultura RPMI-1640 da Sigma para crescimento fúngico. As drogas utilizadas (padrão e testes) foram diluídas em dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração de 20 mg/ml. Após sucessivas diluições do extrato em meio de cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se concentração de 2000 μg/ml. A partir dessa concentração foi retirada uma alíquota de 100 μl e iniciou-se a inoculação da droga em sucessivos compartimentos com meio de cultura. As diluições ocorreram no sentido das colunas, uma para cada droga. Ao ser adicionada em um compartimento este era homogeneizado com a mesma pipeta, sendo transferida uma quantidade igual a 100 μl para o poço seguinte. Dessa forma, cada compartimento anterior tinha o dobro da concentração do posterior. O primeiro poço da primeira coluna, portanto, ficou com a primeira droga teste numa concentração de 1000 μg/ml, o segundo com 500 μg/ml, o terceiro com 250 μg/ml, o quarto com 125 μg/ml, o quinto com 62,5 μg/ml, o sexto com 31,75 μg/ml e o último com aproximadamente 15,85 μg/ml. As placas de microdiluição foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi feita, considerando o CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico. A concentração mínima fungicida (CMF) foi determinada retirando uma alíquota de 10 μl (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a droga, mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio de cultura ágar Sabourand, devidamente identificadas. A concentração mínima fungicida (CMF) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga que impediu o crescimento visível do subcultivo. A droga padrão foi a micostatina e a incubação foi realizada em estufa bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi realizada considerando a CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico. Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente aos fungos Candida albicans, C. parapsilosis, C. krusei e C. tropicalis utilizando-se como antifúngico padrão a micostatina.

45 3.3.3 Avaliação da atividade antiproliferativa dos extratos brutos das folhas e suas frações, do extrato bruto dos galhos e suas frações As linhagens celulares cedidas pelo National Cancer Institute (NCI) dos Estados Unidos da América, e utilizadas na triagem da atividade antiproliferativa foram diluídas em dimetilsulfóxido de sódio (DMSO) na concentração de 1g/mL resultando em soluções estoques. Para o teste de atividade, foram plaqueados 100 μl de células em meio RPMI/SFB/ gentamicina, nas suas respectivas densidades de inoculação, em placas de 96 compartimentos. As placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO 2 e ambiente úmido, para readaptação ao ambiente. Após esse período uma placa controle foi fixada através da adição de ácido tricloroacético para determinação da quantidade de células no momento da adição das drogas. Nas demais placas foram adicionadas as drogas nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250 ug/ml e incubadas por 48 horas, centrifugadas por 3 minutos a 2000 rpm, e fixadas com 50 μl de ácido tricloroacético a 50% (TCA) para as células aderidas e 80% para as células em suspensão (leucemia). Para completar a fixação celular, as placas foram incubadas por 1 hora a 4ºC, submetidas a quatro lavagens com água destilada para a remoção dos resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários e mantidas em temperatura ambiente até a secagem completa. As placas foram coradas pela adição de 50μl do corante proteico sulforrodamina B (SRB) a 0,4 % (peso/volume), dissolvido em ácido acético a 1 %, e incubadas a 4 ºC, durante 30 minutos e lavadas por 4 vezes com uma solução de ácido acético 1%. O resíduo da solução de lavagem foi removido das placas, as quais foram secas à temperatura ambiente. O corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com uma solução de Trizma Base na concentração de 10μM e ph 10,5 por 5 minutos em ultra-som. A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 560 nm em um leitor de microplacas. Para análise dos resultados, foram calculadas as médias das absorbâncias descontadas de seus respectivos brancos, e calculada a porcentagem de inibição de crescimento. Com os dados obtidos, foram construídos gráficos relacionando a porcentagem de inibição de crescimento com

46 a concentração da substância teste. Como controle positivo foi padronizado o quimioterápico doxorrubicina Os testes foram realizados com os extratos brutos das folhas e galhos e frações, avaliados frente a um painel de células tumorais humanas composto pelas linhagens apresentadas na Tabela 12. O quimioterápico utilizado como controle foi a doxorrubicina. Tabela 12: Linhagens de células tumorais utilizadas no teste de atividade antiproliferativa Código Tipo de célula tumoral K-562 Leucemia linfóide UACC-62 Melanoma NCI-460 Pulmão tipo não pequenas células MCF-7 Mama NCI-ADR Mama que expressa o fenótipo de resistência MDR HT-29 Cólon OVCAR-3 Ovário Rim PCO-3 Próstata

47 3.4 Dados espectroscópicos das substâncias isoladas Substância LC-1: lup-20(29)-en-3β-ol Fórmula molecular: C 30 H 50 O IV ν KBr cm -1, (FIGURA 3) max 3324 (O-H), (C-H), (CH 2 ). EM (70 ev), [m/e (%)], (FIGURA 4) [M.+ ] 426 (14,4); 411 (8,3); 281 (9,9); 219 (11,5); 218 (24,4); 208 (18,1); 207 (52,5); 203 (21,6); 191 (21,8); 190 (20,6); 189 (43,2); 176 (7,8); 175 (18,0); 173 (10,9); 163 (16,1); 162 (10,0); 161 (19,4); 149 (21,3); 148 (16,9); 147 (27,3); 145 (9,6); 137 (13,2); 136 (21,9); 135 (45,4); 134 (16,7); 133 (24,6); 123 (33,4); 122 ( 21,8); 121 (47,5); 119 (32,3); 109 ( 58,9); 108 (36,0); 107 ( 55,0); 105 (31,3); 97 (16,4); 96 (18,5); 95 (78,1); 93 (62,0); 91 (29,8); 83 (23,8); 81 (79,4); 79 (44,6); 71 (24,4); 69 (73,7); 68 ( 29,7); 67 (55,1); 57 ( 32,4); 55 (87,6); 53 (16,6); 43 ( 100,0); 41 (81,5); 40 (47,2); 39 (11,0). RMN 1 H (CDCl 3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 5) 4,69 (H-29; d;zshz 2,4; 1H); 4,56 (H-29; m; 1H); 3,19 (H-3; dd;zshz 10,8 e 5,4; 1H); 2,39 (H-19; spt; 1H); 1,91 (H-21; m; 1H); 1,88 (H-15; t;2,4; 1H); 1,68 (H-30; s; 3H); 1,66 (H-13; t; 3,0; 1H); 1,65 (H-1; 1H); 1,62 (H-12; 1H); 1,54 (H- 2; 2H); 1,49 (H-16; 2H); 1,41 (H-7; 2H); 1,41 (H-22; 1H); 1,38 (H-11; d; 1,5; 1H); 1,36 (H-18; 1H); 1,35 (H-21; m; 1H); 1,28 (H-9; 1H); 1,20 (H-11; 1H); 1,20 (H-22; m; 1H); 1,07 (H-12; 1H); 1,03 (H-26;s; 3H); 0,99 (H-15; d; 2,1; 1H);0,97 (H-23; s; 3H); 0,94 (H-27; s; 3H); 0,88 (H-1; 1H); 0,83 (H-25; s; 3H); 0,79 (H-28; s; 3H); 0,76 (H-24; s; 3H); 0,70 (H-5; 1H).

48 RMN 13 C (CDCl 3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 7) 38,6 (C-1, CH 2 ); 27,3 (C-2, CH 2 ); 79,0 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH); 18,2 (C-6, CH 2 ); 34,1 (C-7, CH 2 ); 40,7 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C); 20,8 (C-11, CH 2 ); 25,0 (C-12, CH 2 ); 37,9 (C-13, CH); 42,7 (C-14, C); 27,3 (C-15, CH 2 ); 35,5 (C-16, CH 2 ); 42,9 (C-17, C); 48,2 (C-18, CH); 47,9 (C-19, CH); 151,1 (C-20, C); 29,7 (C-21, CH 2 ); 39,9 (C-22, CH 2 ); 27,8 (C-23, CH 3 ); 15,2 (C-24, CH 3 ); 16,0 (C-25, CH 3 ); 15,8 (C-26, CH 3 ); 14,4 (C-27, CH 3 ); 17,8 (C-28, CH 3 ); 109,3 (C- 29, CH 2 ); 19,2 (C-30 CH 3 ) Substância LC-2: Mistura dos compostos: LC-2(I) 24ξ- etil- colest- 5 enol LC-2(II)24ξ- etil- colesta- 5, 22- dienol LC-2(III) 24ξ- metil- colest- 5 enol EM (70 ev), [m/e (%)], LC-2(I) (FIGURA 10) [M.+ ] 400 (28,2); 367 (19,0); 207 (41,6); 145 (42,2); 133 (22,0); 119 (20,3); 107 (29,7); 105 (26,2); 95 (28,5); 93 (25,9); 91 (28,6); 81 (35,4); 79 (25,8); 73 (23,3); 71 (29,1); 69 (31,9); 67 (28,6); 57 (44,6); 55 (60,7); 43 (100,0); 41 (56,9); 40 (45,0). EM (70 ev), [m/e (%)], LC-2(II) (FIGURA 11) [M.+ ] 412 (23,7); 281 (27,0); 255 (23,0); 207 (50,0); 159 (21,7); 145 (21,8); 133 (30,1); 119 (19,8); 109 (21,8); 107 (25,2); 105 (25,7); 97 (29,4); 95 (28,8); 93 (27,5); 91 (28,1); 83 (52,1); 81 (47,9); 79 (30,5); 73 (23,9); 71 (20,6); 69 (57,5); 67 (32,7); 57 (28,8); 55 (100,0); 43 (69,0); 41 (63,8). EM (70 ev), [m/e (%)], LC-2(III) (FIGURA 12) [M.+ ] 414 (23,6); 213 (16,7); 145 (21,0); 133 (15,7); 119 (18,0); 107 (28,9); 105 (25,6); 95 (30,1); 93 (24,3); 91 (24,8); 85 (16,1); 81 (33,7); 79 (24,7); 71 (22,8); 69 (31,8); 67 (25,7); 57 (52,2); 55 (58,7); 43 (100,0); 41 (48,9).

49 RMN 1 H (CDCl 3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), Mistura LC-2 (FIGURA 13) 0,68 (H-18, 3H, LC-2 (I) e (III)); 0,69 (H-18, 3H, LC-2 (II)); 1,01 (H-19, 3H, LC-2 (I) e (III)); 1,03 (H-19, 3H, LC-2 (II)); 0,91 (H-21, 3H, d, 6,3, LC-2 (I) e (III)); 1,03 (H- 21, 3H, LC-2 (II)); 0,85 (H-26, 3H, LC-2 (I) e (II)); 0,83 (H-26, 3H, LC-2 (III)); 0,80 (H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,79 (H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (II)); 0,83 (H-27, 3H, d, 6,3, LC-2 (III)); 0,77 (H-28, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,80 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (II)); 0,85 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (III)). RMN 13 C (CDCl 3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), Mistura LC-2 (FIGURA 14) 37,18(C-1, CH 2 ); 31,58(C-2, CH 2 ); 71,79(C-3, CH); 42,25(C-4, CH 2 ); 140,88(C-5, C); 121,80(C-6, CH); 31,82(C-7, CH 2 ); 31,82(C-8, CH); 50,08(C-9, CH); 36,43(C- 10, C); 20,97(C-11, CH 2 ); 39,70(C-12, CH 2 ); 42,25(C-13, C); 56,72(C-14, CH); 24,20(C-15, CH 2 ); 28,15(C-16, CH 2 ); 56,01(C-17, CH); 11,84(C-18, CH 3 ); 19,28(C- 19, CH 3 ); 40,20(C-20, CH); 18,92(C-21, CH 3, LC-2(I) e(iii)); 21,11(C-21, CH 3, LC- 2(II)); 33,85(C-22, CH 2, LC-2(I) e (III)); 138,42(C-22, CH, LC-2(II)); 39,70(C-23, CH 2, LC-2(I)); 129,36(C-23, CH, LC-2(II)); 28,81(C-23, CH 2, LC-2(III)); 45,77(C-24, CH, LC-2(I)); 51,19(C-24, CH, LC-2(II)); 56,01(C-24, CH, LC-2(III)); 26,00(C-25, CH, LC-2(I)); 31,82(C-25, CH, LC-2(II)); 29,06(C-25, CH, LC-2(III)); 18,66(C-26, CH 3, LC-2(I) e (III)); 19,22(C-26, CH 3, LC-2(II)); 19,70(C-27, CH 3, LC-2(I) e (III)); 19,22(C-27, CH 3, LC-2(II)); 22,95(C-28, CH 3, LC-2(I)); 25,30(C-28, CH 2, LC-2(II)); 18,66(C-28, CH 2, LC-2(III)); 11,72(C-29, CH 3, LC-2(I)); 12,12(C-29, CH 3, LC-2(II)) Substância LC-3: 3β,28-diidróxilup-20(29)-ene Fórmula molecular: C 30 H 50 O 2 IV ν KBr cm -1, (FIGURA 15) max

50 3407 e 3076 (O-H), (C-H), 1455 (CH 2 ), 1375 (CH3), (=C- H). EM (70 ev), [m/e (%)], (FIGURA 16) [M.+ ] 456 (7,2); 411 (12,5); 248 (31,0); 234 (19,6); 220 (18,3); 207 (100,0); 203 (24,1); 190 (9,6); 189 (42,8); 175 (18,1); 147 (17,3); 137 (13,2); 135 (47,4); 123 (35,4); 122 ( 24,8); 119 (33,3); 109 ( 58,9); 107 ( 54,0); 95 (78,6); 83 (23,2); 81 (80,2); 79 (43,5); 69 (72,8); 68 ( 31,1); 57 ( 31,8); 55 (89,3); 53 (17,3); 40 (56,2); 39 (7,0). RMN 1 H (CDCl 3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 17) 4,68 (H-29;zsHz 1H); 4,58 (H-29; 1H); 3,78 (H-28; dd; 10,2; 1H); 3,31 (H-28; dd; 10,8; 1H); 3,18 (H- 3; dd;zshz 10,8 e 5,1; 1H); 2,38 (H-19; m; 1H); 1,95 (H-21; m; 1H); 1,92 (H-16; 1H); 1,84 (H- 22; 1H); 1,68 (H-30; s; 3H); 1,68 (H-15; 1H); 1,64 (H-1; 1H); 1,63 (H-12; 1H); 1,62 (H-13; 1H); 1,58 (H-2; 2H); 1,57 (H-18; 1H); 1,42 (H-11; m; 1H); 1,39 (H-7; 2H); 1,26 (H-9; 1H); 1,20 (H-16; d; 2,4; 1H); 1,18 (H-11; d; 4,2; 1H); 1,05 (H-12; 1H); 1,04 (H-15; d; 2,7; 1H); 1,02 (H-22; 1H); 1,02 (H-26; s; 3H); 0,98 (H-27; s; 3H); 0,97 (H-23; s; 3H); 0,89 (H-1; 1H); 0,82 (H-25; s; 3H); 0,76 (H-24; s; 3H); 0,67 (H- 5; 1H). RMN 13 C (CDCl 3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 19) 38,6 (C-1, CH 2 ); 27,2 (C-2, CH 2 ); 78,9 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH); 18,1 (C-6, CH 2 ); 34,1 (C-7, CH 2 ); 40,8 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C); 20,7 (C-11, CH 2 ); 25,0 (C-12, CH 2 ); 37,2 (C-13, CH); 42,6 (C-14, C); 26,9 (C-15, CH 2 ); 26,9 (C-16, CH 2 ); 47,7 (C-17, C); 48,6 (C-18, CH); 47,7 (C-19, CH); 150,6 (C-20, C); 29,6 (C-21, CH 2 ); 39,8 (C-22, CH 2 ); 27,8 (C-23, CH 3 ); 15,2 (C-24, CH 3 ); 15,9 (C-25, CH 3 ); 15,8 (C-26, CH 3 ); 14,6 (C-27, CH 3 ); 60,5 (C-28, CH 2 ); 109,7 (C- 29, CH 2 ); 18,9 (C-30 CH 3 ).

51 3.4.4 Substância LC-4: 3β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5enol Fórmula molecular: C 35 H 60 O 6 RMN 1 H (CDCl 3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 21) 5,35 (H-6; d;zshz 1H); 5,07 (H-1 ; d ; 7,8; 1H); 4,56 (H-3 ; dl; 9,3; 1H); 4,45-4,25 (H-6 b, H-4, H-2 ; m; 3H); 4,09-3,91 (H-6 a, H-5, H-3α; m; 3H); 0,92 (H-19; s; 3H); 0,64 (H-18; s; 3H). RMN 13 C (CDCl 3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 22 ) 37,3 (C-1, CH 2 ); 30,0 (C-2, CH 2 ); 78,4 (C-3, CH); 39,1 (C-4, CH 2 ); 140,9 (C-5, C); 121,8 (C-6, CH); 31,9 (C-7, CH 2 ); 31,8 (C-8, CH); 50,1 (C-9, CH); 36,7 (C-10, C); 21,0 (C-11, CH 2 ); 39,7 (C-12, CH 2 ); 42,3 (C-13, C); 56,6 (C-14, CH); 24,3 (C-15, CH 2 ); 28,3 (C-16, CH 2 ); 56,0 (C-17, CH); 11,7 (C-18, CH 3 ); 19,2 (C-19, CH 3 ); 36,2 (C-20, CH); 18,9 (C-21, CH 3 ); 34,0 (C-22, CH 2 ); 26,1 (C-23, CH 2 ); 45,8 (C-24, CH); 29,2 (C-25, CH); 18,7 (C-26, CH 3 ); 19,7 (C-27, CH 3 ); 23,1 (C-28, CH 2 ); 11,9 (C-29, CH 3 ); 102,5 (C-1' CH); 75,2 (C-2, CH); 77,9 (C-3, CH); 71,5 (C-4, CH); 78,3 (C-5, CH); 62,6 (C-6, CH 2 ) Substância LC-5: 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-benzopiran- 3,5,7-triol. Fórmula molecular: C 15 H 14 O 6 IV ν KBr cm -1, (FIGURA 23) max 3324 (O-H), 1628 (C = C), 1148 (C-O)

52 EM (70 ev), [m/e (%)], (FIGURA 24) [M.+ ] 290 (14,0); 272 (44,2); 258 ( 17,0); 164 ( 45,3); 152 (36,4); 139 (100,0); 123 (45,4); 110 (6,6); 64 (13,6); 44 (17,6);39 (6,7). RMN 1 H (CD 3 OD, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 25) 6,96 (H-2 ; d;zshz 1,8; 1H); 6,80 (H-6 ; dd; 1,8; 1H); 6,76 (H-5 ; d; 1H); 5,91 (H-6; d; 2,1; 1H); 5,93 (H-8; d; 2,4; 1H); 4,80 (H-2; m;zshz 1H); 4,17 (H-3; m; 1H); 2,69 (H-4b; dd; 16,8 e 3,0; 1H); 2,87 (H-4a; dd; 16,8 e 4,5; 1H). RMN 13 C (CD 3 OD, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURAS 26) 79,9 (C-2, CH); 67,5 (C-3, CH); 29,2 (C-4a e C-4b, CH 2 ); 157,8 (C-5, C); 96,4 (C-6, CH); 158,2 (C-7, C); 95,9 (C-8, CH); 157,5 (C-9, C); 100,1 (C-10, C); 132,2 (C-1, C); 115,4 (C-2, CH); 145,9 (C-3, C); 146,1 (C-4, C); 116,0 (C-5, CH); 119,5 (C-6, CH) Substância LC-6: (siringaresinol-(2,6-bis(4,4 -O-bis-β-D-glicosídeo-3,5 - dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo). Fórmula molecular: EM (70 ev), [m/e (%)], (FIGURA 27) 135 (36,5); 76 (19,2); 75 (100,0); 73 (82,7); 69 (12,2); 60 (84m0); 57 (36,1); 45 (48,2); 44 (47,2); 43 (55,5); 42 (18,0); 41 (11,4). RMN 1 H (D 2 O, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 28) 6,82 (H-2 e H-6; s;zshz 2H); 4,90 (H-7; d; 5,1; 1H); 3,32 (H-8, m; 1H); 4,34 (H-9; m; 1H b ); 3,99 (H-9; dd; 7,2; 1H a ); 3,51 (H-10; 1H); 3,88 (OCH 3 ; s; 6H); 5,03 (H-1 ; d; 7,2; 1H); 3,84 (H-5 ;

53 dd; 12,0 e 6,0; 1H b ); 3,73 (H-5 ; dd; 12,6 e 5,4; 1H a ); 3,57 (H-2 ; d; 1,8; 1H); 3,54 (H-4 ; 1H); 3,36 (H-3 ; d; 1H). RMN 13 C (D 2 O, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 29) 141,1 (C-1; C); 106,9 (C-2 e C-6; CH); 155,9 (C-3 e C-5; C); 136,0 (C-4; C); 88,7 (C-7; CH); 56,2 (C-8; CH); 74,7 (C-9; CH 2 ); 72,3 (C-10; CH); 103,1 (C-11; C); 59,2 (2x OCH 3 ); 105,9 ( C-1 ; CH); 79,3 (C-4 ; CH); 78,7 (C-3 ; CH); 76,4 (C-2 ; CH); 63,5 (C-5 ; CH 2 ) Substância LC-7: 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4- hidroxifenil)-4-h-benzopiran-4-ona Fórmula molecular: C 21 H 20 O 10 IV ν KBr cm -1, (FIGURA 35) max 3381 e 3237 (O-H), 1652 (C=O), 1614 (C = C), 1189 (C -O) EM (70 ev), [m/e (%)], (FIGURA 36) [M.+ ] 432 (0,6); 414 (12,1); 378 (6,7); 342 ( 6,0); 324 (5,9); 323 (5,7); 312 (6,3); 310 (6,6); 294 ( 8,3); 284 ( 19,7); 283 (100,0); 270 (18,0); 254 (7,7); 165 (37,6); 123 (7,6); 121 (13,4); 119 (7,1); 118 (12,6); 93 (7,7); 89 (7,8); 69 (24,9); 65 (8,9); 63 (8,6); 61 (12,3); 60 (11,8); 55 (17,3); 53 (10,4); 51 (8,5); 44 (14,7); 43 (33,2); 42 (12,1); 39 (13,9). RMN 1 H (DMSO, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 37) 8,02 (H-2 e H-6 ; d;zshz 8,4; 2H); 6,89 (H-3 e H-5 ; d; 8,4; 2H); 6,77 (H-3, s; 1H); 6,26 (H-6; s; 1H); 4,69 (H-1 ; d; 9,9; 1H); 3,78 (H-2 ; nd; 1H).

54 RMN 13 C (DMSO, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 38) 164,5 (C-2, C); 102,8 (C-3, CH); 182,6 (C-4, C); 160,9 (C-5, C); 98,5 (C-6, CH); 163,0 (C-7, C); 104,4 (C-8, C); 156,5 (C-9, C); 105,0 (C-10, C); 122,0 (C-1, C); 129,4 (C-2, CH) 116,3 (C-3, CH); 161,6 (C-4, C); 116,3 (C-5, CH); 129,4 (C-6, CH); 73,7 (C-1, CH); 71,2 (C-2, CH); 78,9 (C-3, CH); 70,8 (C-4, CH); 82,1 (C-5, CH); 61,6 (C-6, CH 2 ). 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Método de extração e isolamento dos constituintes químicos de L. candicans O estudo químico de L. candicans iniciou-se com a preparação do extrato bruto metanólico dos galhos e folhas (em separado) por remaceração à temperatura ambiente. Pelo fato dessa espécie ser muito rica em taninos, optouse por submeter o extrato bruto dos galhos a um pré fracionamento em coluna de silica gel obtendo-se oito frações, denominadas de LCG-1, LCG-2, LCG-3, LCG-4, LCG-5, LCG-6, LCG-7 e LCG-8 (frações Hexano, Hex./CHCl 3 50%, Hex./CHCl 3 75%, CHCl 3, CHCl 3 /MeOH 25%, CHCl 3 /MeOH 50%, CHCl 3 /MeOH 75%, MeOH, respectivamente). A fração LCG-4 foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 15 frações, sendo que dessas frações foram isolados três substâncias denominadas LC-1, LC-2 e LC-3. A fração LCG-5 também foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 15 frações, tendo sido isolada a substância denominada LC-4. Da fração LCG-6 foi isolada a substância LC-5, através de CC em sílica gel e da fração LCG-7 após CC em sílica gel foi isolada a substância LC-6. O extrato bruto das folhas também foi submetido a um pré fracionamento em coluna de sílica gel obtendo-se quatro frações denominadas de LCF-1, LCF-2, LCF-3 e LCF-4 (frações Hexano, AcOEt, CHCl 3 e MeOH, respectivamente).

55 A fração LCF-2 foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 8 frações(lcf-1 a LCF-8), sendo que dessas frações foram isolados mais quantidade das substâncias LC-1 e LC-2 e detectado a presença de LC-3. As frações LCF2-6 e LCF-2.7 por serem semelhantes foram reunidas e submetidas a uma CC em sílica gel, obtendo-se 5 novas frações. Esta fração foi denominada LCF-2.6. A fração LCF-2.6.3, por apresentar fluorescência sob luz ultravioleta no comprimento de onda λ = 254 nm, foi submetida a uma CC em silica gel, obtendose 4 frações (LCF-2.6.a a LCF-2.6.d). A fração LCF-2.6.3b, por apresentar perfil cromatográfico menos complexo foi submetida a uma cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP). Foram retirados quatro faixas sendo que apenas uma apresentou quantidade suficiente para análises espectroscópicas, a qual foi denominada LCF-2.6b (4,0mg). Os dados de RMN de 1 H e de 13 C de LCF-2.6b demonstraram que a substância estava impura, sendo que no processo de purificação não houve quantidade de massa suficiente para continuação dos estudos. A fração LCF-3 foi evaporada à secura e ao ser solubilizada em metanol houve a formação de um precipitado de coloração amarela, o qual foi denominado de LC-7. As demais frações não foram estudas ou por apresentarem pouca massa ou devido à presença de taninos que dificultam muito o trabalho.

56 4.2 Determinação estrutural dos compostos isolados Substância LC-1 A substância LC-1(35) (16,0mg) foi isolada da fração clorofórmica através de coluna cromatográfica, como um sólido branco solúvel em clorofórmio HO (35) O espectro no IV (Figura 3) apresentou banda de absorção em 3330 cm 1 referente a estiramento de ligação OH, em 2917 a 2849 cm 1 referente a deformação axial de ligação C-H, e deformação angular de grupos metilenos em 1472 a 1462 cm 1.

57 FIGURA 3 Espectro no IV de LC-1 O espectro de massas de baixa resolução, obtido por inserção direta via sólido (Figura 4), apresentou o pico base em m/e 43, relativo a uma clivagem da cadeia lateral α ao anel com rearranjo e ganho de um hidrogênio (Silverstein e col.,1994), e o pico do íon molecular em m/e 426 [M.+ ]. Verifica-se ainda os picos em m/e 218[M.+ ] - [C 14 H 23 O] +, correspondendo a uma possível clivagem nos carbonos C-8/C-14 e C-9/C-11(Esquema 3), e ainda um pico em m/e 191[207 OH/ + H] + com transferência de um hidrogênio através de rearranjo (Branco & Pizzoletti, 2002).

58 FIGURA 4 Espectro de massas (70 ev) de LC-1 HO m/e 426 H H HO H HO HO m/e 207 m/e 218

59 Esquema 3- Provável fragmentação de LC-1 O espectro de RMN de 1 H (Figura 5) de LC-1 apresentou sinais de hidrogênios vinílicos em δ 4,56(dd) e δ 4,69 (d; J=2,4Hz), referentes aos hidrogênios H-29 da ligação dupla terminal. O duplo dubleto em δ 3,18 (J =5,4 e 10,8Hz) é relativo ao hidrogênio carbinólico H-3, estes acoplamentos indicaram a presença de β-configuração, e os sinais em δ 0,76 a δ 1,68 são referentes aos metilas. Os dados de RMN de 1 H de LC-1 (Tabela 13) foram comparados com os dados da literatura para o lupeol, isolado da espécie Clathrotropis branchypetala por Reynolds e col. (1986). Tabela 13: Dados de RMN 1 H de LC-1 e do lupeol (Reynolds e col.,1986). Hidrogênio LC-1 a δ 1 H, mult. (n o H, J) Lupeol b δ 1 H, multiplicidade H-1 0,88, m (1H), 1,65, m (1H) 0,91, 1,68 H-2 1,54, m (2H) 1,54, q, 1,61, d H-3 3,18, dd (1H, 5,4 e 10,8) 3,18, dd H-5 0,70, m (1H) 0,69, d H-6 * 1,39, q, 1,54, d H-7 1,41, m (2H) 1,41, m H-9 1,28, m (1H) 1,28, d H-11 1,20, m (1H), 1,38, d (1H, 1,5) 1,25, q, 1,42, d H-12 1,07, m (1H), 1,62, m (1H) 1,07, q, 1,68, d H-13 1,66, t (1H, 3,0) 1,67, t H-15 0,99, d (1H, 2,1), 1,88, t (1H,2,4) 1,01, d, 1,71, t H-16 1,49, m (2H) 1,38, t, 1,49, d H-18 1,36, m (1H) 1,37, t H-19 2,37, m (1H) 2,39, m H-21 1,35, m (1H), 1,91, m (1H) 1,33, m, 1,93, m H-22 1,20, m (1H), 1,41, m (1H) 1,20, m, 1,42, m

60 H-23 0,97, s (3H) 0,98, s H-24 0,76, s (3H) 0,77, s H-25 0,83, s (3H) 0,84, s H-26 1,03, s (3H) 1,04, s H-27 0,94, s (3H) 0.97, s H-28 0,79, s (3H) 0,79, s H-29 4,69, d (1H,2,4), 4,50, m (1H) 4,69, m, 4,56, m H-30 1,68, s (3H) 1,69, s a- RMN de 1 H (CDCl 3, 300MHz); b- RMN de 1 H (CDCl 3, 400MHz); As constantes de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz. * Sinal encoberto. As correlações entre os hidrogênios vinílicos foram confirmadas através do mapa de contornos COSY (Figura 6) (Tabela 14). Este experimento mostra também a correlação entre o duplo dubleto em δ 4,56 (H-29) e o metila em δ 1,68(H-30). O septeto em δ 2,37 (H-19) está correlacionado com o sinal em δ 1,35 (H a -21), que correlaciona - se com o sinal em δ 1,91 (H b -21).

61 FIGURA 5 Espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-1 Tabela 14: Correlações observadas nos mapas de contornos HETCOR ( 13 C x 1 H ) e COSY ( 1 H x 1 H) da substância LC-1. Carbono δ 13 C / DEPT HETCOR ( 13 C x 1 H) δ 1 H C-1 38,6(CH 2 ) 0,88; 1,65 COSY ( 1 H x 1 H) δ 1 H C-2 27,3(CH 2 ) 1,54 3,18 C-3 79,0 (CH) 3,18 1,54 C-5 55,2(CH) 0,70 C-7 34,1(CH 2 ) 1,41 C-9 50,3(CH) 1,28 C-11 20,8 (CH 2 ) 1,20; 1,38 C-12 25,0 (CH 2 ) 1,07; 1,62 C-13 37,9(CH) 1,66 C-15 27,3(CH 2 ) 0,99 C-18 48,2(CH) 1,36 C-19 47,9 (CH) 2,37 1,35 C-21 29,7(CH 2 ) 1,35; 1,91 1,91; 1,35 C-22 39,9 (CH 2 ) 1,41 C-23 27,8(CH 3 ) 0,97 C-24 15,2(CH 3 ) 0,76 C-25 16,0(CH 3 ) 0,83 C-26 15,8(CH 3 ) 1,03 C-27 14,4(CH 3 ) 0,94

62 C-28 17,8(CH 3 ) 0,79 C ,3 (CH 2 ) 4,69; 4,56 4,56; 4,69 C-30 19,2 (CH 3 ) 1,68 4,56

63 FIGURA 6 Mapa de contornos 1 Hx 1 H COSY (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-1 No espectro de RMN de 13 C e DEPT (Figura 7) observa-se os sinais em δ 109,3 (C-29) e δ 151,1 (C-20), referentes a dupla terminal. O sinal em δ 79,0 corresponde ao metino carbinólico C-3, e os sinais da região de δ 14,4 a 27,8, são atribuídos aos metilas C-23 a C28 e C-30. Os dados de RMN de 13 C de LC-1 foram comparados com os dados da literatura para o lupeol, segundo Reynolds e col.(1986), conforme Tabela 15. Tabela 15: Dados de RMN 13 C / DEPT de LC-1 e do lupeol (Reynolds e col.,1986).

64 nº carbono (DEPT) LC-1 a δ 13 C Lupeol b δ 13 C 1(CH 2 ) 38,6 38,7 2(CH 2 ) 27,3 27,4 3(CH) 79,0 78,9 4(C) 38,7 38,8 5(CH) 55,2 55,3 6(CH 2 ) 18,2 18,3 7(CH 2 ) 34,1 34,2 8(C) 40,7 40,8 9(CH) 50,3 50,4 10(C) 37,0 37,1 11(CH 2 ) 20,8 20,9 12(CH 2 ) 25,0 25,1 13(CH) 37,9 38,0 14(C) 42,7 42,8 15(CH 2 ) 27,3 27,4 16(CH 2 ) 35,5 35,5 17(C) 42,9 43,0 18(CH) 48,2 48,2 19(CH) 47,9 47,9 20(C) 151,1 150,9 21(CH 2 ) 29,7 29,8 22(CH 2 ) 39,9 40,0 23(CH 3 ) 27,8 28,0 24(CH 3 ) 15,2 15,4 25(CH 3 ) 16,0 16,1 26(CH 3 ) 15,8 15,9 27(CH 3 ) 14,4 14,5 28(CH 3 ) 17,8 18,0 29(CH 2 ) 109,3 109,3 30(CH 3 ) 19,2 19,3 a- RMN de 13 C (CDCl 3, 75MHz); b- RMN de 13 C (CDCl 3, 14,5MHz)

65 FIGURA 7 Espectro de RMN de 13 C e DEPT 90 o e 135 o (75 MHz, CDCl 3 ) de LC-1

66 O mapa de contornos HETCOR ( 13 Cx 1 H) (Figura 8) mostra a correlação dos sinais dos hidrogênios em δ 4,56 e δ 4,69 com o sinal de carbono em δ 109,3. O sinal de carbono em δ 38,6 está correlacionado com os sinais em δ 0,88 e 1,65 e o duplo dubleto em δ 3,18 correlaciona-se com o sinal em δ 79,0. Os sinais em δ 27,8, 15,2, 16,0,15,8, 14,4, 17,8 e 19,2 estão correlacionados com os singletos em δ 0,97, 0,76, 0,83, 1,03, 0,94, 0,79 e 1,68, respectivamente. Os dados obtidos nos mapas de contorno COSY ( 1 Hx 1 H) e HETCOR ( 13 Cx 1 H), confirmam as principais atribuições de LC-1. FIGURA 8 Mapa de contornos 1 Hx 13 C HETCOR (75 MHz, CDCl 3 ) de LC-1 Após análise dos dados espectrais e da comparação com os dados da literatura, conclui-se que a substância LC-1 trata-se de um triterpeno da série dos lupanos, o lupeol (lup-20(29)-en-3β-ol) Substância LC-2

67 A mistura LC-2 (36) foi isolada da fração clorofórmica do extrato bruto dos galhos como cristais brancos (16mg) solúveis em clorofórmio. 28 HO R (I) R= (II) R= 21 (III) R= (36) No cromatograma obtido na análise por CG/EM de LC-2 observa-se a existência de três substâncias (Figura 9), com tempos de retenção de 35,81 min., 36,98 min. e 39,60 min. O espectro de massas para a substância com o tempo de retenção 35,81 min. (Figura 10), apresenta o pico do íon molecular em m/e 400 [M.+ ], e o pico base em m/e 43. Para a substância com tempo de retenção 36,98 min. (Figura 11), o pico do íon molecular ocorre em m/e 412[M.+ ] e o pico base em m/e 55, enquanto que para a substância com tempo de retenção 39,60 min. (Figura 12), os mesmos ocorrem em m/e 414[M.+ ] e em m/e 43.

68 FIGURA 9 Cromatograma da mistura LC-2 FIGURA 10 Espectro de massas (70 ev) de LC-2 (I)

69 FIGURA 11 Espectro de massas (70 ev) de LC-2 (II) FIGURA 12 Espectro de massas (70 ev) de LC-2 (III) O espectro de RMN de 1 H (Figura 13) de LC-2 apresenta dois multipletos na região de hidrogênios olefínicos, sendo o sinal entre δ 5,35 a 5,37 atribudo ao

70 hidrogênio H-6 e o sinal na região de δ 4,97 a 5,19 correspondente aos hidrogênios H-22 e H-23. O multipleto em δ 3,47 a 3,58 é atribuido ao hidrogênio carbinólico H-3, e os sinais entre δ 0,68 a 1,03 são referentes aos metilas. FIGURA 13 Espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-2 Os deslocamentos químicos observados nos espectros de RMN de 13 C e DEPT (Figura 14), para a mistura LC-2 foram comparados com os dados existentes na literatura (Goulart e col., 1993) para a mistura de esteróides pertencentes a classe Δ 5, 24α- etil- colest- 5 enol(sitosterol) (a), 24α- etil- colesta- 5, 22- dienol(estigmasterol) (b) e 24ξ- metil- colest- 5 enol (c), conforme Tabela 16, devido ao deslocamento químico do C-19 (δ 19,39) dos mesmos ocorrer na

71 mesma região que os da mistura LC-2 (C-19=δ 19,28). O deslocamento químico do C-19 dos esteróides da classe Δ 7 ocorre em δ 13,2. FIGURA 14 Espectro de RMN de 13 C e DEPT 90 o e 135 o (75 MHz, CDCl 3 ) de LC-2

72 Tabela 16: Dados de RMN de 13 C / DEPT da mistura LC-2 (isolada) e da mistura 24α- etil- colest- 5 enol(sitosterol) (a), 24α- etil- colesta- 5, 22- dienol(estigmasterol) (b) e 24ξ- metil- colest- 5 enol (c) (Goulart e col., 1993). Nº carbono Mistura a δ 13 C (DEPT) LC-2(I) LC-2(II) LC-2(III) Mistura b δ 13 C (a) (b) (c) c 1 37,18(CH 2 ) 37,18(CH 2 ) 37,18(CH 2 ) 37,25 37,25 37, ,58(CH 2 ) 31,58(CH 2 ) 31,58(CH 2 ) 31,64 31,64 31, ,79(CH) 71,79(CH) 71,79(CH) 71,89 71,89 71, ,25(CH 2 ) 42,25(CH 2 ) 42,25(CH 2 ) 42,29 42,29 42, ,88(C) 140,88(C) 140,88(C) 140,73 140,73 140, ,80(CH) 121,80(CH) 121,80(CH) 121,72 121,72 121, ,82(CH 2 ) 31,82(CH 2 ) 32,82(CH 2 ) 31,89 31,89 31, ,82(CH) 31,82(CH) 31,82(CH) 31,89 31,89 31, ,08(CH) 50,08(CH) 50,08(CH) 50,12 50,12 50, ,43(C) 36,43(C) 36,43(C) 36,40 36,40 36, ,97(CH 2 ) 20,97(CH 2 ) 20,97(CH 2 ) 21,08 21,08 21, ,70(CH 2 ) 39,70(CH 2 ) 39,70(CH 2 ) 39,78 39,68 39, ,25(C) 42,25(C) 42,25(C) 42,29 42,29 42, ,72(CH) 56,72(CH) 56,72(CH) 56,75 56,87 56, ,20(CH 2 ) 24,20(CH 2 ) 24,20(CH 2 ) 24,30 24,38 24, ,15(CH 2 ) 28,15(CH 2 ) 28,15(CH 2 ) 28,24 28,24 28, ,01(CH) 56,01(CH) 56,01(CH) 56,05 55,93 56, ,84(CH 3 ) 11,84(CH 3 ) 11,84(CH 3 ) 11,87 11,87 11, ,28(CH 3 ) 19,28(CH 3 ) 19,28(CH 3 ) 19,38 19,38 19, ,10(CH) 40,20(CH) 36,10(CH) 36,16 40,50 36, ,92(CH 3 ) 21,11(CH 3 ) 18,92(CH 3 ) 19,03 21,20 18, ,85(CH 2 ) 138,42(CH) 33,85(CH 2 ) 33,94 138,40 33, ,70(CH 2 ) 129,36(CH) 28,81(CH 2 ) 39,12 129,27 28, ,77(CH) 51,19(CH) 56,01(CH) 45,83 51,23 56, ,00(CH) 31,82(CH) 29,06(CH) 26,03 31,89 29, ,66(CH 3 ) 19,22(CH 3 ) 18,66(CH 3 ) 18,76 19,00 18, ,70(CH 3 ) 19,22(CH 3 ) 19,70(CH 3 ) 19,81 19,00 19, ,95(CH 3 ) 25,30(CH 2 ) 18,66(CH 2 ) 23,06 25,42 18, ,72(CH 3 ) 12,12(CH 3 ) 11,99 12,27 a- RMN de 13 C (CDCl 3, 75MHz); b- RMN de 13 C (CDCl 3, 50,3MHz); c- RMN de 13 C (CDCl 3, 75,5MHz);

73 Os epímeros correspondentes de a, b e c podem ser diferenciados através dos dados de RMN de 1 H dos metilas. Nas Tabelas 17, 18 e 19, estão os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1 H dos metilas da mistura LC-2 e os dados da literatura para o 24α- metil- colest- 5 enol(campesterol) e 24β- metilcolest- 5 enol(22,23-diidrobrassicasterol) (Rubinstein e col., 1976), do 24α- etilcolest- 5,22-dienol(estigmasterol) e 24β- etil- colest- 5,22- dienol(poriferasterol) (Akihisa e col., 1988), e do 24α- etil- colest- 5- enol(sitosterol) e 24β- etil- colest- 5- enol(clionasterol) (Thompson e col., 1972), respectivamente. Tabela 17: Dados de RMN de 1 H para os metilas de LC-2(I) e do 24α- metil- colest- 5 enol(campesterol) e 24β- metil- colest- 5 enol(22,23-diidrobrassicasterol) (Rubinstein e col., 1976). Metila LC-2(I) a 24α b 24β b δ 1 H, mult. (J) δ 1 H δ 1 H 18 0,680 0,680 0, ,010 1,007 1, ,911, d (J= 6,3) 0,911 0, ,846, d (J= 6,6) 0,850 0, ,803, d (J= 6,6) 0,802 0, ,772, d (J= 6,6) 0,773 0,775 a-rmn de 1 H (CDCl 3, 300MHz); b- RMN de 1 H (CDCl 3, 200MHz); As constantes de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz.

74 Tabela 18: Dados de RMN de 1 H para os metilas de LC-2(II) e do 24α- etil- colest- 5,22-dienol(estigmasterol) e 24β- etil- colest- 5,22- dienol(poriferasterol) (Akihisa e col., 1988). Metila LC-2(II) a 24α b 24β b δ 1 H, mult. (J) δ 1 H, mult. (J) δ 1 H, mult. (J) 18 0,699 0,697, s 0,695, s 19 1,033 1,021, s 1,021, s 21 1,033 1,021, d (J= 6,6) 1,025, d (J= 6,6) 26 0,846, d (J= 6,6) 0,846, d (J= 6,6) 0,844, d (J= 6,0) 27 0,786, d (J= 6,6) 0,796, d (J= 7,1) 0,792, d (J= 6,6) 29 0,803, d (J= 6,6) 0,805, t (J= 7,4) 0,812, t (J= 7,4) a-rmn de 1 H (CDCl 3, 300MHz); b- RMN de 1 H (CDCl 3, 400MHz); As constantes de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz. Tabela 19: Dados de RMN de 1 H para os metilas de LC-2(III) e do 24α- etil- colest- 5- enol(sitosterol) e 24β- etil- colest- 5- enol(clionasterol)(thompson e col., 1972). Metila LC-2(III) a 24α b 24β b δ 1 H, mult. (J) δ 1 H, mult. δ 1 H, mult. 18 0,680 0,678 0, ,010 1,010 1, ,911, d (J = 6,3) 0,922 0, ,825, d (J = 6,3) 0,834 0, ,825, d (J = 6,3) 0,834 0, ,846, d (J = 6,6) 0,846 0,747 a-rmn de 1 H (CDCl 3, 300MHz); b- RMN de 1 H (CDCl 3, 400MHz); As constantes de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz.

75 O sinal do metila 27 de LC-2(I) ocorre em δ 0,803, Tabela 17, enquanto que para o 24α- metil- colest- 5 enol(campesterol) encontra-se em δ 0,802, e para o e 24β- metil- colest- 5 enol(22,23-diidrobrassicasterol) em δ 0,783 (Rubinstein e col., 1976), sugerindo que LC-2(I) pode ser o campesterol. Para o 24α- etil- colesta- 5,22-dienol(estigmasterol), o sinal do metila 29 é observado em δ 0,805, Tabela 18, e para o 24β- etil- colest- 5,22- dienol(poriferasterol) em torno de δ 0,812 (Akihisa e col., 1988), enquanto que o metila 29 de LC-2(II) ocorre em δ 0,803, portanto semelhante ao estigmasterol. Os deslocamentos dos metilas 21 (δ 0,911) e 29 (δ 0,846) de LC-2(III), ao serem comparados com os dos esteróides 24α- etil- colest- 5- enol(sitosterol) e 24β- etil- colest- 5- enol(clionasterol), metila 21 (24α- δ 0,922, 24β- δ 0,929) e metila 29 (24α- δ 0,846, 24β- δ 0,747) (Garg & Nes, 1986), Tabela 19, apresentaram semelhanças com o sitosterol.

76 4.2.3 Substância LC-3 A substância LC-3 (37) (12,0mg) foi isolada da fração clorofórmica (LCG-4) como um sólido branco solúvel em clorofórmio CH 2 OH OH (37) O espectro no IV apresentou uma banda forte de absorção em 3407cm -1 e outra fraca em 3076cm -1, indicando a presença de dois grupos hidroxila. Na região de 2942 a 2869 cm -1 apresentou deformação axial de ligação C-H, em 1455 cm -1 uma banda de deformação angular de grupo metileno, em 1375 cm -1 uma banda de deformação angular de grupo metila, e na região de 1106 a 1033 cm -1 apresentou estiramento de grupo vinílico (=C-H) (Figura 15).

77 FIGURA 15 Espectro no IV de LC-3 O espectro de massas obtido na análise por CG/EM, apresentou o pico do íon molecular em m/e 456 [M.+ ] (Figura 16), e o pico base em m/e 207 [M ] +, o qual sugere uma clivagem nos carbonos C-8/C-14 e C-9/C-11. FIGURA 16 Espectro de massas (70 ev) de LC-3 O espectro de RMN de 1 H (Figura 17) de LC-3 apresentou em δ 4,58 e δ 4,68, sinais de hidrogênios vinílicos referentes aos hidrogênios H-29 da ligação dupla terminal. O sinal na região de δ 3,18 (dd; 5,1 e 10,8 Hz) é relativo ao hidrogênio carbinólico H-3, cujos acoplamentos indicaram a presença de β- configuração, e os dos metilas ocorrem entre δ 0,97 a δ 1,68. Os dois dubletos de dubletos em δ 3,78 (dd; 10,2 e 3,9 Hz) e δ 3,31 (dd;10,8 e 3,0 Hz), e a desproteção nos hidrogênios H-16 (δ 1,20 e 1,92) e H-22 (δ 1,02 e 1,84 ), em relação aos de LC-1, evidenciam a presença de um metileno carbinólico em LC-3 no lugar do metila-28 de LC-1. Os dados de RMN de 1 H de LC-3 foram comparados com os dados da literatura para a betulina, isolado da espécie Salacia cordata, (Tinto e col. 1992) (Tabela 20).

78 Tabela 20: Dados de RMN 1 H de LC-3 e da betulina (Tinto e col. 1992) Hidrogênio LC-3 a δ 1 H, mult. (n o H, J) Betulina b δ 1 H, multiplicidade H-1 1,64, m (1H); 0,89, m (1H) 1,65; 0,89 H-2 1,58, m (2H) 1,58 H-3 3,18, dd (1H; 5,1 e 10,8) 3,18 H-5 0,67, d (1H; 9,0) 0,67 H-6 * 1,52; 1,38 H-7 1,39, m (2H) 1,39 H-9 1,26, m (1H) 1,27 H-11 1,42, m (1H); 1,18, d (1H; 4,2) 1,41; 1,19 H-12 1,63, m (1H); 1,05, m (1H) 1,63; 1,03 H-13 1,62, m (1H) 1,64 H-15 1,68, m (1H); 1,04, d (1H; 2,7) 1,70; 1,04 H-16 1,92, m (1H); 1,20, d (1H; 4,2) 1,93; 1,20 H-18 1,57, m (1H) 1,57 H-19 2,38, m (1H) 2,38 H-21 1,95, m (2H) 1,95; 1,40 H-22 1,84, d (1H; 3,3); 1,02, m (1H) 1,86; 1,02 H-23 0,97, s (3H) 0,96 H-24 0,76, s (3H) 0,76 H-25 0,82, s (3H) 0,82 H-26 1,02, s (3H) 1,02 H-27 0,98, s (3H) 0,98 H-28 3,78, dd (1H;3,9 e 10,2); 3,31, dd (1H;3,0 e 10,8) 3,77; 3,31 H-29 4,68, m (1H); 4,58, m (1H) 4,68; 4,58 H-30 1,68, s (3H) 1,68 a-rmn de 1 H (CDCl 3, 300MHz); b- RMN de 1 H (CDCl 3, 400MHz); As constantes de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz. * sinal encoberto

79 FIGURA 17 Espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-3 Os assinalamentos dos deslocamentos químicos destes hidrogênios de LC-3 podem ser confirmados pelos dados obtidos no experimento COSY ( 1 Hx 1 H) (Figura 18) (Tabela 21)., onde observa-se as correlações entre o duplo dubleto em δ 3,18 (H-3) e o metileno em δ 1,58 (H-2), o metila em δ 0,82 (H-25) e o metileno em δ 1,64 (H-1) e o metino em δ 1,26 (H-9), e entre H-9 e o metila (H-26). Destaca-se também as correlações entre os hidrogênios vinílicos H-29 da dupla terminal (δ4,68 e δ 4,58), o sinal em δ 4,58 (H-29) e o metila em e δ 1,68 (H-30) e o sinal dos metilas em δ 0,97 (H-23) com δ 0,76 (H-24).

80 FIGURA 18 Mapa de contornos 1 Hx 1 H COSY (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-3 Tabela 21: Correlações observadas nos mapas de contorno HETCOR ( 13 C x 1 H) e COSY ( 1 H x 1 H) da substância LC-3. Carbono LC-3 δ 13 C (DEPT) HETCOR ( 13 C x 1 H) δ 1 H COSY ( 1 H x 1 H) δ 1 H C-1 38,6 (CH 2 ) 1,64; 0,89 0,89; 1,64; 0,82 C-2 27,2 (CH 2 ) 1,58 3,18 C-3 78,9 (CH) 3,18 1,58 C-5 55,2 (CH) 0,67 C-7 27,2 (CH 2 ) 1,39 C-9 50,3 (CH) 1,26 0,82; 1,02 C-11 20,7 (CH 2 ) 1,42; 1,18 C-12 25,0 (CH 2 ) 1,63; 1,05 C-13 37,2 (CH) 1,62 C-15 26,9 (CH 2 ) 1,68; 1,04 1,92 C-16 29,0(CH 2 ) 1,92; 1,20 1,20; 1,92; 1,68 C-18 48,6 (CH) 1,57 2,38 C-19 47,7 (CH) 2,38 1,57 C-21 29,6 (CH 2 ) 1,95 C-22 33,8 (CH 2 ) 1,84; 1,02 1,02; 1,84 C-23 27,8 (CH 3 ) 0,97 0,76 C-24 15,2 (CH 3 ) 0,76 0,97 C-25 15,2 (CH 3 ) 0,82 1,64; 1,26 C-26 15,8 (CH 3 ) 1,02 1,26 C-27 14,6 (CH 3 ) 0,98 C-28 60,5 (CH 2 ) 3,78; 3,31 3,31; 3,78 C ,7 (CH 2 ) 4,68; 4,58 4,58; 4,68 C-30 18,9 (CH 3 ) 1,68 4,58 No espectro de RMN de 13 C e DEPT (Figura 19) observa-se os sinais em δ 109,7 referente ao metileno C-29 da dupla terminal, em δ 78,9 ao metino

81 carbinólico C-3, em δ 60,5 ao metileno carbinólico C-28 e na região entre δ 14,6 a 27,8, aos metilas. Os dados de RMN de 13 C foram comparados com os dados da literatura para a betulina, segundo Tinto e col., (1992), (Tabela 22). Tabela 22: Dados de RMN de 13 C / DEPT de LC-3 e da betulina (Tinto e col.1992). Nº carbono (DEPT) LC-3 a δ 13 C Betulina b δ 13 C 1(CH 2 ) 38,6 38,7 2(CH 2 ) 27,2 27,2 3(CH) 78,9 78,9 4(C) 38,7 38,8 5(CH) 55,2 55,3 6(CH 2 ) 18,1 18,3 7(CH 2 ) 34,1 34,3 8(C) 40,8 40,9 9(CH) 50,3 50,4 10(C) 37,0 37,2 11(CH 2 ) 20,7 20,8 12(CH 2 ) 25,0 25,3 13(CH) 37,2 37,3 14(C) 42,6 42,7 15(CH 2 ) 26,9 27,0 16(CH 2 ) 29,0 29,2 17(C) 47,7 47,8 18(CH) 48,6 48,8 19(CH) 47,7 47,8 20(C) 150,6 150,6 21(CH 2 ) 29,6 29,8 22(CH 2 ) 33, (CH 3 ) 27,8 27,9 24(CH 3 ) 15,2 15,4 25(CH 3 ) 15,9 16,1 26(CH 3 ) 15,8 15,9 27(CH 3 ) 14,6 14,8 28(CH 2 ) 60,5 60,2 29(CH 2 ) 109,7 109,6 30(CH 3 ) 18,9 19,1 a- RMN de 13 C (CDCl 3, 75MHz); b- RMN de 13 C (CDCl 3, 100,6MHz)

82 No mapa de contornos HETCOR ( 13 C x 1 H) foram verificadas as correlações entre o metileno carbinólico C-28 (δ 60,5) e os dois dubletos de dubleto em δ 3,78 e δ 3,31; entre o metileno C-29 (δ 109,7) da ligação dupla terminal e os hidrogênios em δ 4,68 e δ 4,58; entre o metino carbinólico C-3 (δ 78,9) e o duplo dubleto em δ 3,18 (Figura 20). As demais correlações dos mapas de contornos COSY e HETCOR estão representadas na Tabela 21. FIGURA 19 Espectro de RMN de 13 C e DEPT 90 o e 135 o (75 MHz, CDCl 3 ) de LC-3

83 FIGURA 20 Mapa de contornos 1 Hx 13 C HETCOR (75 MHz, CDCl 3 ) de LC-3 Após análise dos dados espectrais e comparação com os dados da literatura, conclui-se que a substância (37) trata-se de um triterpeno da série dos lupanos, a betulina (3β,28-Diidróxilup-20(29)-ene).

84 4.2.4 Substância LC-4 A substância LC-4 (38) foi isolada da fração LCG-5 como um sólido branco (18,0 mg), solúvel em clorofórmio HO HO 6' 5' 4' HO 3' O 2' 1' OH O (38) No espectro de RMN de 1 H (Figura 21), observa-se os sinais referentes aos metilas entre δ 0,64 a 0,98. Os sinais dos hidrogênios carbinólicos da unidade glicosídica foram observados na região entre δ 3,91 a 4,98. Em δ 5,07 encontra-se um dubleto largo atribuído ao hidrogênio anomérico (H-1 ), com constante de acoplamento de 7,8 Hz, indicando a β-configuração. O dubleto em δ 5,35 corresponde ao hidrogênio H-6 da dupla ligação, e o sinal do hidrogênio carbinólico H-3α encontra-se na região de δ 3,91 a 4,09, entre os sinais dos hidrogênios do açúcar. Os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1 H de LC-4 foram comparados com os dados da literatura (Matida e col., 1996) para o glicopiranosilsitosterol, (Tabela 23).

85 Tabela 23: Dados de RMN de 1 H de LC-4 e do glicopiranosilsitosterol (Matida e col., 1996) Hidrogênio LC-4 a δ 1 H, mult. (n o H, J) Glicopiranosilsitosterol b δ 1 H, mult. (n o H, J) H-6 5,35, d (1H) 5,36, d (1H) H-18 0,64, s (3H) 0,66, s (3H) H-19 0,92, s (3H) 0,93, s (3H) H-1 5,07, d (1H, 7,8) 5,04, d (1H, 7,6) H-3 4,56, dl (1 H, 9,3) 4,56, dl (1H, 10,8) H-6 b, H-4, H-2 4,45 4,25, m 4,48 4,21, m H-6 a, H-5, H-3α 4,09 3,91, m 4,17 3,82, m a- RMN de 1 H (CDCl 3, 300MHz); b- RMN de 1 H (C 5 D 5 N, 200MHz); Constante de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz. FIGURA 21 Espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CDCl 3 ) de LC-4

86 Os espectros de RMN de 13 C e DEPT (Figura 22) mostram os sinais dos carbonos insaturados em δ 140,9 (C) e δ 121,8 (CH). A posição da ligação dupla Δ 5 foi confirmada pela absorção do carbono C-19 em δ 19,2, enquanto que para os esteróides Δ 7 o deslocamento químico do carbono C-19 ocorreria em δ 13,0 (Goulart e col., 1993). O deslocamento químico em δ 102,5 é característico de carbono anomérico (CH-1 ) e os sinais em δ 78,5 (CH), δ 77,9 (CH), δ 71,5 (CH) e δ 62,6 (CH 2 ) são atribuídos aos carbonos da unidade glicosídica C-3, C-5, C-2, C-4 e C-6, respectivamente. Os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 13 C obtidos para a substância LC-4 foram comparados com os valores dos deslocamentos químicos encontrados na literatura (Matida e col., 1996) para o 3-O-β-Dglicopiranosilsitosterol, (Tabela 24).

87 Tabela 24: Dados de RMN de 13 C / DEPT de LC-4 e do 3-O-β-Dglicopiranosilsitosterol (Matida e col., 1996) nº carbono (DEPT) LC-4 a δ 13 C 3-O-β-D-glicopiranosilsitosterol b δ 13 C 1(CH 2 ) 37,3 37,2 2(CH 2 ) 30,0 29,9 3(CH) 78,4 78,2 4(CH 2 ) 39,1 39,0 5(C) 140,9 140,6 6(CH) 121,8 122,6 7(CH 2 ) 31,9 31,9 8(CH) 31,8 31,8 9(CH) 50,1 50,0 10(C) 36,7 36,6 11(CH 2 ) 21,0 21,0 12(CH 2 ) 39,7 39,6 13(C) 42,3 42,2 14(CH) 56,6 56,5 15(CH 2 ) 24,3 24,2 16(CH 2 ) 28,3 28,2 17(CH) 56,0 55,9 18(CH 3 ) 11,7 11,7 19(CH 3 ) 19,,2 19,1 20(CH) 36,2 36,1 21(CH 3 ) 18,9 18,9 22(CH 2 ) 34,0 33,9 23(CH 3 ) 26,1 26,1 24(CH) 45,8 45,7 25(CH) 29,2 29,2 26(CH 3 ) 18,7 18,7 27(CH 3 ) 19,7 19,7 28(CH 2 ) 23,1 23,1 29(CH 3 ) 11,9 11,9 1 - (CH) 102,5 102,2 2 - (CH) 75,2 75,0 3 - (CH) 77,9 77,0 4 - (CH) 71,5 71,3 5 - (CH) 78,3 78,1 6 - (CH 2 ) 62,6 62,5 a- RMN de 13 C (CDCl 3, 75MHz); b- RMN de 13 C (C 5 D 5 CN, 75,5MHz)

88 FIGURA 22 Espectro de RMN de 13 C e DEPT 90 o e 135 o (75 MHz, CDCl 3 ) de LC-4 Considerando que os deslocamentos químicos de RMN de 13 C/DEPT da substância LC-4 mostraram coerência com os dados do 3-O-β-Dglicopiranosilsitosterol (3-β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5-enol), pode-se concluir que trata-se da mesma substância.

89 4.2.5 Substância LC-5 A substância LC-5 (34) foi isolada da fração LCG-6 (Tabela 4) como um sólido marrom (9,0mg), solúvel em metanol. HO OH O ' 2 1' OH (34) OH 3' 6' 4' 5' OH O espectro no I V (Figura 23) apresenta uma banda larga em 3324 cm -1 característica de estiramento de grupo hidroxila. Observa-se também a presença de uma banda de absorção referente a deformação axial de ligação C=C em 1628 cm -1 e uma banda de absorção relativa a estiramento de ligação C-O em 1148 cm -1. FIGURA 23 Espectro no IV de LC-5

90 O espectro de massas de baixa resolução, obtido na análise por CG/EM apresentou o pico do íon molecular em m/e 290 [M.+ ] (Figura 24), o pico base em m/e 139, que sugere uma clivagem β ao anel A, com a perda do fragmento m/e 152 (C 8 H 8 O 3 ), e ainda o fragmento em m/e 123 [139 - OH/ +H], sugerindo a perda de um grupo hidroxila e transferência de um hidrogênio através de rearranjo. FIGURA 24 Espectro de massas (70 ev) de LC-5 No espectro de RMN de 1 H (Figura 25) observa-se cinco sinais característicos de hidrogênios aromáticos em δ 6,76(d; H-5 ), δ 6,80(dd; H-6 ), δ 6,96(d; H-2 ), δ 5,93(d; H-8), δ 5,91(d; H-6). O dubleto em δ 6,76 (J= 8,1 Hz), revelou padrão de acoplamento orto com H-6. O duplo dubleto em δ 6,80 (J=1,8 e 8,1Hz), demonstrou padrão de acoplamento meta com H-2 e orto com H-5, e o dubleto em δ 6,96 (J=1,8 Hz) confirmou acoplamento meta com H-6. As constantes de acoplamento dos hidrogênios H-6 e H-8 em δ 5,91 (d, 2,4 Hz), e 5,93 (d, 2,4 Hz) revelaram padrão de acoplamento meta. A presença dos hidrogênios em δ 2,87 (H-4b, dd, 4,5 e 16,8 Hz) e δ 2,69 (H-4a, dd, 3,0 e 16,8 Hz) indicou que LC-5 poderia pertencer à classe dos flavan- 3-ol, e os sinais de H-2 e H-3 em δ 4,80 (s) e 4,17 (m) evidenciaram a presença de

91 heteroátomo ligado ao carbono C-2 e de um grupo hidroxila ligado ao carbono C-3. Na Tabela 25 estão comparados os dados de RMN de 1 H de LC-5 com os dados da literatura para a (-)-epicatequina, isolado da espécie Licania pittieri por Mendez e col. (1995). Tabela 25: Dados de RMN de 1 H de LC-5 e da (-)-epicatequina (Mendez e col. 1995) Hidrogênio LC-5 a (-)-epicatequina b δ 1 H, mult. (nº H, J) δ 1 H, mult. (nº H, J) H-2 4,82, s (1H) 4,80 (1H) H-3 4,17, m (1H) 4,10 (1H) H-4 a 2,69, dd (1H; 3,0 e 16,8 ) 2,78, dd (1H; 5,6 e 16,0) H-4b 2,87, dd (1 H; 4,5 e 16,8 ) 2,68, dd (1H; 8,1 e 16,0) H-6 5,91, d (1H; 2,4) 5,91, d (1H; 1,9) H-8 5,93, d (1H; 2,4) 5,93, d (1H; 1,9) H-2 6,96, d (1H; 1,8) 6,84, d (1H; 1,7) H-5 6,76, d (1H; 8,1) 6,75 H-6 6,80, dd (1H; 1,8 e 8,1) 6,75 a RMN de 1 H (CD 3 OD, 300 MHz); b RMN de 1 H (CD 3 OD, 200,13 MHz); As constantes de acoplamento J entre parênteses estão em Hertz A substância LC-5 foi comparada com a (-)- epicatequina isolada da espécie L. divaricata por Tanaka (2002). No trabalho citado a técnica de diferença de NOE foi utilizada para confirmação da estereoquímica dos hidrogênios H-4a, H- 4b, H-3 e H-2, os quais encontram-se em δ 2,72, δ 2,86, δ 4,17 e δ 4,81, respectivamente. Os deslocamentos químicos dos hidrogênios H-4a, H-4b, H-3 e H-2 de LC-5 ocorrem em δ 2,69, δ 2,87, δ 4,17, e δ 4,82, respectivamente, portanto semelhante à (-)- epicatequina.

92 No espectro de RMN de 13 C e DEPT (Figura 26) observou-se os sinais em δ 132,2; 115,4; 145,9; 146,1; 116,0 e 119,5 relativos aos carbonos aromáticos C-1 a C-6. Os sinais em δ 157,8; 96,4; 158,2; 95,9; 157,5 e 100,1, também característicos para aromáticos são relativos aos carbonos C-5 a C-10. A presença de um sinal referente a CH 2 saturado em δ 29,2, atribuído ao C-4 e os sinais em δ 79,9 e 67,5, referentes aos carbonos C-2 e C-3, confirmaram que LC-5 tratava-se de um flavonol. Os dados de RMN de 13 C foram comparados com os dados da literatura para a (-)-epicatequina, segundo Agrawal e col.(1989), conforme Tabela 26. Tabela 26: Dados de RMN 13 C / DEPT de LC-5 e da (-)-epicatequina (Agrawal e col. 1989). Nº carbono (DEPT) LC-5 a δ 13 C (-)-epicatequina b δ 13 C 2 (CH) 79,9 79,4 3 (CH) 67,5 66,9 4 (CH 2 ) 29,2 29,1 5 (C) 157,8 157,4 6 (CH) 96,4 96,2 7 (C) 158,2 157,4 8 (CH) 95,9 95,7 9 (C) 157,5 157,0 10 (C) 100,1 99,7 1 (C) 132,2 132,1 2 (CH) 115,4 115,2 3 (C) 145,9 145,2 4 (C) 146,1 145,2 5 (CH) 116,0 115,5 6 (CH) 119,5 119,4 a RMN de 13 C (CD 3 OD, 75,5 MHz); b RMN de 13 C [(CD 3 ) 2 CO]

93 FIGURA 25 Espectro de RMN de 1 H (300 MHz, CD 3 OD) de LC-5

94 FIGURA 26 Espectro de RMN de 13 C e DEPT 90 o e 135 o (75 MHz, CD 3 OD) de LC-5 Após a análise dos dados espectrais e da comparação com os dados da literatura, conclui-se que LC-5 é um flavonóide, pertencente à classe dos flavan-3- ol, a (-)-epicatequina (2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-benzopiran-3,5,7-triol).

95 4.2.6 Substância LC-6 A substância LC-6 (39) foi isolada da fração LCG-7 (fração CHCl 3 / MeOH 75%) como um sólido branco, solúvel em água. OCH 3 HO HO 3" OH 5" O H 3 CO 1" O OH H 3 CO 5 3 H O 7' 8 O 8' 9 ' 1' H 5' 3' O HO 1"' O 5"' OCH 3 HO 3"' OH OH (39) O espectro de massas de baixa resolução, obtido na análise por CG/EM (Figura 27), não exibiu o pico do íon molecular e apresentou o pico base em m/e 75 [C 6 H 3 ] +. Os principais fragmentos apresentados são m/e 135[(C 6 H 2 (OCH 3 ) 2 ) + H], 60, 45 e 43. FIGURA 27 Espectro de massas (70 ev) de LC-6

96 O espectro de RMN de 1 H (Figura 28) apresentou um singleto em δ 6,82, com integração para dois hidrogênios aromáticos, um singleto em δ 3,88, com integração para seis hidrogênios, correspondendo a dois grupos metoxilas. Os sinais em δ 4,92 (1H) e δ 3,32 (m,1h) são referentes a dois hidrogênios metilenicos e os sinais em δ 4,35 (dd, J= 6,7 e 2,5 Hz, 1H b ) e δ 4,00 (dd, J=6,7 e 2,5 Hz, 1H a ) a hidrogênio metilenico. O dubleto em δ 5,03 (J= 7,2 Hz), relativo a hidrogênio anomérico, e os dois duplo dubletos em δ 3,82 (dd, J=12,0 e 2,7 Hz, 1H b ) e δ 3,72 (dd, 12,0 e 4,8 Hz, 1H a ) indicaram a presença de uma unidade glicosídica. Os sinais referentes aos demais hidrogênios carbinólicos foram observados na região entre δ 3,35 a 3,57. FIGURA 28 Espectro de RMN de 1 H (300 MHz, D 2 O) de LC-6 Os espectros de RMN de 13 C e DEPT (Figura 29) apresentaram sinais de quatro carbonos aromáticos, sendo um relativo a dois CH e três a carbonos não hidrogenados em δ 107,0, δ 136,1, 141,1 e 155,8, juntamente com sinais referentes a dois grupos metoxilas em δ 59,3, dois metinos em δ

97 88,8 e 56,2, e um metileno em δ 74,7. Também foram observados seis sinais referentes a unidade glicosídica, em δ 106,0, correspondente ao carbono anomérico (CH), e os demais sinais de carbonos carbinólicos em δ 79,4 (CH), 78,7 (CH), 76,6 (CH), 72,3 (CH) e 63,5 (CH 2 ). FIGURA 29 Espectro de RMN de 13 C e DEPT 90 o e 135 o (75 MHz, D 2 O) de LC-6 As correlações observadas nos mapas de contornos HMQC, COSY, NOESY e no mapa de contornos HMBC encontram-se nas Tabelas 27 e 28. O mapa de contornos HMQC permitiu correlacionar os sinais de CH e CH 2 com os respectivos hidrogênios, destacando-se as correlações do metino carbinólico em δ 88,8 com δ 4,92, do metileno carbinólico em δ 74,8 com δ 4,35 e 4,00 e também a do metileno da unidade glicosídica em δ 63,4 com δ 3,72 e 3,82 (Figura 30). A correlação entre os hidrogênios em δ 5,03 e 3,57, e as demais correlações observadas no mapa de contornos COSY (Figura 31) entre os hidrogênios