Gabarito. Velocidade (µmol/min)

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1 Gabarito ) A cinética de uma enzima foi medida em função da concentração de substrato na presença e ausência de mm do inibidor I. [S] µm Velocidade (µmol/min) Sem inibidor a) Quais são os valores de Vmax e KM na ausência e presença de inibidor? Quais as equações de reta? A primeira coisa a fazer é converter os dados em M e mol/s e calcular os valores recíprocos. - /[S] M I. II. Sem Inibidor /v (s/mol) /v (s/mol) 𝑦. 𝑥 +,. 0! (Equação sem inibidor) 𝑦 40. 𝑥 +,. 0! (Equação com inibidor) Uma vez que ambas as equações de reta possuem o mesmo coeficiente linear, a Vmax será igual para ambas: 𝑉# 𝑉# #!#!$%& 7,69. 0!! 𝑚𝑜𝑙. 𝑠!! 46, µ𝑚𝑜𝑙. 𝑚𝑖𝑛!!, 0! Como já fora visto anteriormente, podemos calcular Km a partir do coeficiente angular de cada equação de reta: #!#!$%& 𝟏𝟎. 𝟏𝟎!𝟔 𝑴 𝟏𝟎𝝁𝑴 (𝒄𝒉𝒂𝒎𝒂𝒅𝒐 𝑲𝒎 𝒂𝒑𝒂𝒓𝒆𝒏𝒕𝒆), 0! #!#!$%& 40 𝟑𝟎. 𝟎𝟖 𝟏𝟎!𝟔 𝑴 𝟑𝟎. 𝟖 𝝁𝑴, 0! b) Qual é o tipo de inibição? 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑒𝑡𝑖𝑡𝑖𝑣𝑎, 𝑝𝑜𝑖𝑠 𝑉# 𝑛ã𝑜 𝑠𝑒 𝑎𝑙𝑡𝑒𝑟𝑎 e #!#!$%& > #!#!$%&. c) Qual é a constante de afinidade do inibidor?

2 !#$%&$ + [𝐼] [𝐼]!#$%&$ 0 𝜇𝑀. 𝑚𝑀 0,7 𝜇𝑀 0 𝜇𝑀 𝟏𝒎𝑴 d) Se [S]0uM e [I]mM qual é a fração de moléculas de enzima ligadas ao substrato, e ao inibidor? A fração de moléculas ligadas ao substrato é dada por: 𝑓 𝑣 𝑉# [𝑆] 𝑆 + Enquanto que fei, a fração de moléculas ligadas ao inibidor, poderia ser calculada por: 0𝜇𝑀 0𝜇𝑀 𝜇𝑀 + 0𝜇𝑀 0𝜇𝑀 𝜇𝑀 𝑓 𝑠𝑒𝑚 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖𝑑𝑜𝑟 𝑓 𝑐𝑜𝑚 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖𝑑𝑜𝑟 0.4 e) Se [S]0 µm, qual fração de moléculas de enzima estariam ligadas ao substrato na presença e na ausência de mm de inibidor? 𝑆! 𝑓 𝑆 [𝑆] 𝑆 O aumento da concentração de substrato de 0 para 0 mm levou a um aumento de duas vezes da fração de moléculas de enzima ligadas ao substrato de 0.6 para 0.49, dessa forma a velocidade da reação aumentou da mesma ordem: 𝑓!! 𝑣!!! 𝑣! 𝑉# [𝑆] + [𝑆] 𝑉# 𝑆 + 𝑆 0.77𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!! 0𝜇𝑀 0.9𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!! 0.8𝜇𝑀 + 0𝜇𝑀 0.77𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!! 0𝜇𝑀 0.8𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠!! 0.8𝜇𝑀 + 0𝜇𝑀 ) A cinética de uma enzima foi medida na presença de um inibidor. A concentração do inibidor é 00 µm e os dados cinéticos são mostrados abaixo: [S] µm 0 Velocidade (µmol/min) Sem inibidor

3 a) Quais são os valores de K M e V max na presença do inibidor? Compare com os valores obtidos no exercício anterior Para obter os valores de K M e V max devemos converter os dados da tabela acima para mol/segundo, fazer o gráfico de Linewaver-Burk (duplo-recíproco) e uma regressão linear para obter os coeficientes de reta. A figura abaixo mostras um gráfico de velocidade de reação em função da concentração de substrato (esquerda) na ausência (azul) e na presença do inibidor (vermelho), e o gráfico de duplorecíproco correspondente à direita. 7 x 0 7 x x x 0 As equações de reta ajustadas para os dados obtidos na ausência e presença do inibidor são: y x +. 0! (ausência do inibidor). Os valores de K M e V max na ausência do inibidor são dados por: V # K! y 67x ! (presença do inibidor).. 0! 0.77μmols!!. 0! 0μM Os valores de K M e V max na presença do inibidor são dados por: V # K! 6.8 0! 0.μmols!! ! 0μM Claramente, ao contrário do exercício anterior este inibidor não alterou o K M, apenas a velocidade máxima.

4 b) Qual é o tipo de inibição? Observa-se que na adição do inibidor diminuiu a V max em aproximadamente cinco vezes, de 0.77 para 0. µmols -, enquanto que o K M manteve-se igual. Trata-se, portanto, de um inibidor nãocompetitivo. c) Qual é a constante de dissociação do inibidor? A constante de dissociação pode ser obtida através da V max aparente: V # V # + [I] K! K! V # I 0.μmols!! 00μM V # V # μmols!! 4.μM d) Se [S] 0 µm, qual fração das moléculas de enzima estarão em complexo com o substrato na presença e ausência de 00 µm deste inibidor? Assim como no exercício anterior, a fração de moléculas de enzima em complexo com o substrato na preseça do inibidor é dada por:! f v V # V # V # Enquanto que na ausência do inibidor podemos fazer: f v V # [S] K! + [S] [S] 0 S + K! Observa-se, portanto, que a adição de 00 µm do inibidor não competitivo não alterou a fração de moléculas em complexo com o substrato. O inibidor não-competitivo não altera a fração de moléculas de enzima em complexo com o substrato mas altera o número total de moléculas de enzima disponíveis para interagir com o substrato.. A enzima urease aumenta a velocidade da hidrólise da uréia em ph 8,0 e 0º C por um fator de 0 4. Uma dada quantidade de urease pode hidrolisar completamente uma certa quantidade de uréia em minutos a 0º C e ph 8,0. a) Quanto tempo (em anos) levaria para que essa mesma quantidade de uréia fosse hidrolisada sob as mesmas condições na ausência da urease? Se a enzima aumenta a velocidade da reação de hidrólise da uréia em um fator de 0 4, o tempo para que a reação se complete também é acelerado nesta mesma ordem de grandeza. Se a reação não for catalisada pela enzima (ausência da enzima), o tempo necessário para a reação se completar será 0 4 vezes maior, logo a resposta seria t min x 0 4 9, x 0 8 anos b) Dois tipos de urease (A e B) foram isoladas de espécies de animais diferentes. As enzimas possuem a mesma V máx, mas diferentes valores de Km. A enzima A tem K m µm e a enzima B tem K m 0, µm. Qual destas enzimas possui maior afinidade pelo substrato? Calcule a V max utilizando a Equação de Michelis-Menten. A enzima B, devido ao seu menor valor de Km, para se cacular Vmax basta montar a equação de MM para cada enzima e iguala-las. 4

5 c) Para as duas ureases (A e B) foram realizadas experimentos cinéticos e o gráfico resultante está mostrado abaixo. Aponte qual é a curva que corresponde a Urease A e qual corresponde à B, e demonstre como você chegou a esta conclusão.