A.R.Machado, L.A.Souza-Soares

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1 COMPARAÇÃO DE DOIS MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE LIPÍDIOS SOXHLET E BLIGH-DYER E TÉCNICA DE CROMATOGRAFIA EM COLUNA PARA PURIFICAÇÃO DA LECITINA DE ARROZ LOTE 2013 A.R.Machado, L.A.Souza-Soares Laboratório de Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande FURG. Avenida Itália KM.8 - Cep: Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brasil. (leonor.souzasoares@gmail.com). Fone: RESUMO- A lecitina é considerada como um surfactante atóxico, bem tolerado pelo organismo, pois é parte integral das membranas celulares e pode ser totalmente metabolizada. O trabalho teve como objetivo permitir a realização da extração lipídica por solventes comparando-os processos e a utilização da técnica cromatográfica em coluna para a purificação da lecitina de arroz bruta. A matéria-prima utilizada foi a goma proveniente da degomagem do óleo bruto de farelo de arroz (RBOS). Foram realizadas a extração de lipídios por dois métodos: soxhlet e Bligh-Dyer e os procedimentos de purificação por cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE) utilizando-se o mesmo eluente da CC e cromatoplacas de sílica gel 60 F 254. Os resultados obtidos indicam que a metodologia utilizada e os testes executados foram satisfatórios para a purificação da lecitina de arroz bruta. PALAVRAS-CHAVE: coluna, degomagem, fosfolipidios e solventes. ABSTRACT -Lecithin is regarded as a nontoxic surfactant is well tolerated by the body as it is an integral part of the cell and is completely metabolised membranes. The study aimed to enable the achievement of lipid solvent extraction comparing the process and the use of chromatographic technique column for the purification of crude rice lecithin. The raw material used was gum from the degumming of crude rice bran oil (RBOS). The extraction of lipids was performed by two methods: soxhlet and Bligh-dyer and procedures for purification by thin layer chromatography (HPTLC) using the same eluent and silica DC cromatoplacas gel 60 F254. The results indicate that the methodology used and the tests performed were satisfactory to perform the purification of crude rice lecithin. KEYWORDS: column, degumming, phospholipids and solvents. INTRODUÇÃO A lecitina corresponde a um conjunto de fosfolipídios que são extraídos do óleo de soja ou de arroz, sendo utilizada em aplicações industriais ou para fins nutricionais, apresentando-se pastosa, de cor acastanhada clara ou escura. Possui propriedades funcionais que são determinadas pelas conformações estruturais de seus principais componentes os fosfolipídios. Os efeitos da lecitina sendo um antioxidante natural ativo, ajuda no combater aos radicais livres, de forma a que as estruturas celulares possam receber mais oxigênio e, assim, obter maior

2 resistência à fadiga, ao mesmo tempo que proporciona um melhor funcionamento dessas mesmas estruturas. Desta forma, ajudam na manutenção jovem do nosso organismo, devido à melhor oxidação conseguida. A lecitina também ajuda na remoção do colesterol dos depósitos dos tecidos e inibe a agregação plaquetária, diminuindo a taxa de colesterol de forma a evitar acidentes cardiovasculares (Hasmann et al., 2007). O presente trabalho permitiu realizar a extração lipídica por solventes comparando os métodos e a utilização da técnica cromatográfica em coluna para a purificação da lecitina de arroz bruta. MATERIAL E MÉTODOS Obtenção da matéria-prima A matéria-prima utilizada na realização deste trabalho foi a goma proveniente da degomagem do óleo bruto de farelo de arroz, denominada Lecitina de arroz bruta, lote agosto de 2013, foi fornecida pela indústria de óleo de arroz, do município de Pelotas, Rio Grande do Sul. Extração de lipídios por dois métodos: Soxhlet e Bligh-Dyer Empregou-se o método de Soxhlet, segundo método IUPAC 1.122, (1979) com éter de petróleo, durante 6 horas. Foram pesados 5 g da amostra em vidro de relógio, logo depositadas em cartuchos. Após o término do período de extração e arrefecimento da miscela, foram colocados os balões em estufa até peso constante. Além da metodologia de Soxhlet (1879), foi empregado o métodos de Bligh e Dyer, com clorofórmio, metanol e água na proporção de 1:2:0,8 (v/v). Para a extração dos lipídios segundo o método de Bligh e Dyer, (1959) foram pesados aproximadamente 5 g de amostra. Em um erlenmeyer de 250 ml foram adicionados 50 ml de metanol, 25 ml de clorofórmio e 10 ml de água sobre a lecitina (umidade de 11,88%). Alíquotas das frações lipídicas obtidas das diferentes metodologias de extrações dissolvidas em éter de petróleo foram aplicadas em placas cromatográficas de silica gel 60 F 20 x 20 cm (Merck) com fase móvel éter de petróleo, éter etílico e ácido acético (80:20:2) conforme proposto por Nelson e Cox (2006). A placa cromatográfica após eluição foi revelada com vapor de iodo e o Rf das manchas dos padrões e dos componentes das amostras foram determinados. A identificação dos componentes lipídicos, nas placas cromatográficas, ocorreu por comparação dos valores de fator de retenção. Purificação da Lecitina de Arroz Para purificação da Lecitina de arroz bruta utilizou-se as técnica de extração por solventes e cromatografia em coluna de acordo com, Mertins 2008, com algumas modificações. Extração parcial por solventes A lecitina de arroz bruta (10 g) foi dissolvida em 50 ml de acetato de etila (Merck). Em seguida, lentamente e sob agitação, foram adicionados 2 ml de água destilada, ocorrendo a formação de duas fases. O sobrenadante foi separado da fase inferior e descartado. A fase inferior, com aspecto de gel, foi dispersa em 30 ml de acetona (Nuclear), formando aglomerados que foram triturados utilizando-se

3 um bastão de vidro. A seguir, a acetona foi separada por decantação e uma nova porção de 30 ml de acetona foi adicionada, repetindo-se o processo de trituração. O precipitado foi filtrado sob vácuo e seco em dessecador, fornecendo uma massa de 5,2 g. A amostra foi designada FCA. Coluna cromatográfica Utilizou-se uma massa de 10 g de sílica gel (Macherey-Nagel mesh) foi compactada com uma mistura de clorofórmio (Merck), metanol (Synth) e água (MilliQ) (7,0:3,0:1,0) em uma coluna cromatográfica de 11 cm de altura e 2,0 cm de diâmetro dotada de filtro de vidro sinterizado. A lecitina de arroz bruta (2 g) foi dissolvida em clorofórmio e eluída com clorofórmio, metanol e água (7,0; 3,0; e 1,0). As frações contendo a FCA purificada, analisadas através de cromatografia em camada delgada, empregando-se o mesmo eluente, foram misturadas em balão de vidro. Sob agitação, adicionou-se sulfato de cálcio anidro (Merck) para secagem da solução. Em seguida a mistura foi filtrada e os solventes evaporaram naturalmente em condições ambientais. Todos os procedimentos de purificação foram monitorados por cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE) utilizando-se o mesmo eluente da cromatografia em coluna e placas de sílica gel 60 F254 (Merck). As placas foram reveladas em atmosfera saturada de iodo. A Lecitina de arroz bruta foi utilizada como padrão para comparação. RESULTADOS E DISCUSSÃO Extração de lipídios por dois métodos: Soxhlet e Bligh-Dyer Os teores lipídicos obtidos durante as extrações foram para Soxhlet 68,77% e 96% Bligh-Dyer. Os procedimentos clássicos idealizados por Soxhlet em 1879, com refluxo de solvente por muitas horas, devem ser evitados, já que favorecem as reações de peroxidação e de hidrólise, podendo comprometer resultados analíticos posteriores, como a quantificação de certos componentes lipídicos (Brum, Arruda e Reginato-D Arce, 2009). Um dos procedimentos de extração mais versáteis e efetivos, que supera as dificuldades mencionadas acima, é a metodologia de Bligh & Dyer (1959). O método de Bligh-Dyer possui uma característica interessante que apresentou durante o experimento um rendimento superior ao método Soxhlet. O poder de extração também tem íntima relação com o fato de que nesse método uma quantidade insuficiente de metanol e água esteve presente para a remoção dos não-lipídios, os quais são geralmente solubilizados pelos lipídios polares na fase orgânica (Brum et al 2009). Na extração de Bligh e Dyer, (1959) a amostra também fica imersa em contato com os solventes por um período de tempo que não ultrapassa 15 min (agitação), dependendo do tipo de amostra, mas a mistura de solventes utilizada tem a capacidade de extrair um maior número de lipídios polares da amostra analisada. A vantagem do método baseada na mistura binária clorofórmio e metanol é a capacidade de extaírem tanto os lipídios neutros e lipídios polares eficientes (Brum et al., 2009). Diversos estudos mostraram que, dependendo do tipo de tecido que será analisado, a escolha do método de extração influência significativamente no método final. A insolubilidade dos lipídios em água torna possível sua separação das proteínas, carboidratos e água nos tecidos. Como os lipídios têm uma grande faixa de relativa hidrofobicidade, é praticamente inviável a utilização de um único solvente universal para a extração dos lipídios. Lipídios neutros estão ligados covalentemente e podem ser extraídos dos tecidos por solventes apolares, enquanto lipídios polares, os

4 quais estão ligados por forças eletrostáticas e pontes de hidrogênio, requerem solventes polares capazes de quebrar tais ligações e liberá-los (Brum et al., 2009). Os lipídios polares, na sua maioria fosfolipídios, são facilmente extraídos dos tecidos devido ao arranjo de bicamadas das membranas nas quais estão situados. Por conta desse arranjo, o qual expõe somente os lipídios polares, é compreensível o porquê da necessidade de solventes polares para extração. Comparação dos métodos de extração Os resultados obtidos neste trabalho, conforme a tabela abaixo, foram realizados usando como parâmetro o Fator de Retenção (RF), que é definido como a razão entre a distância percorrida pela mancha do componente e a distância percorrida pelo eluente. O RF obtido foi comparado com os padrões (substâncias puras), e foram suficientes para este trabalho. Tabela 1: Determinação do fator de correção da lecitina em Bligh-Dyer e Soxhlet. Determinações Fator de retenção(rf) Lecitina bruta (Lb) 0,119 Soxhlet 0,108 Bligh-Dyer 0,120 Conforme a tabela 1, a extração por Bligh - Dyer apresentou o maior rendimento comparado a lecitina bruta, tornando-se mais eficiente neste estudo. Schäfer (1998) comparou as misturas de solventes isopropanol-hexano e clorofórmio-metanol na extração de lipídios de tecidos animais e vegetais. Este pesquisador verificou que a mistura clorofórmio-metanol obteve um melhor rendimento em lipídios totais quando a amostra em estudo foi o peito de frango, entretanto, quando a extração foi realizada em cereais, a mistura do álcool e um hidrocarboneto foi mais satisfatória que o outro método. Tabela 2: Purificação da lecitina de arroz bruta Determinações Fator de retenção(rf) Lb* 0,119 FCA** 0,108 Lb*: Lecitina de arroz bruta; FCA**: Fosfatidilcolina de arroz purificada Purificação da lecitina de arroz bruta A tabela 2 representa dados da placa de CCD obtida pela eluição das amostras. Para a condução deste trabalho, foi realizada primeiramente a purificação parcial da lecitina através da extração por solventes primeiramente, o acetato de etila, acetona e água (50, 2 e 30mL), obtendo-se a lecitina purificada (fosfatidilcolina purificada). A purificação através da cromatografia em coluna (CC) utilizando lecitina bruta e fosfatidilcolina purificada (10g) foram realizadas com os eluentes clorofórmio, metanol e água (7:3:1 v/v/v). Os procedimentos de purificação foram monitorados por cromatografia em camada delgada de alta eficiência (CCDAE) utilizando-se o mesmo eluente da CC e cromatoplacas de sílica gel 60 F254. As cromatoplacas foram reveladas em atmosfera saturada de iodo. As cromatoplacas foram feitas com lecitina bruta como padrão e lecitina purificada (fosfatidilcolina), onde os fatores de retenção obtidos foram 0,119 e 0,108 para as lecitinas bruta e lecitina purificada, respectivamente. A CCDAE apresenta-se como uma técnica simples, barata e muito importante para a separação rápida e análise qualitativa de pequenas substâncias. E tem como

5 intuito analisar, identificar ou separar os componentes de uma mistura. Os resultados obtidos neste trabalho foram realizados usando como parâmetro o Fator de Retenção (RF), que é definido como a razão entre a distância percorrida pela mancha do componente e a distância percorrida pelo eluente. Com isso pode-se afirmar que os RFs alcançados quando comparados com o padrão (Lecitina bruta), considerando-os satisfatórios para este trabalho. CONCLUSÃO Os resultados obtidos indicam que a metodologia utilizada e os testes executados foram satisfatórios para realizar a purificação da lecitina de arroz bruta nas condições experimentais. AGRADECIMENTOS: FAPERGS através de bolsa de doutorado e recursos do Projeto aprovado pelo Edital 14 de 2012, e CNPq tendo como fonte no Edital Universal REFERÊNCIAS Bligh, E.G., Dyer, W.J. (1959). Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911. Brum, A.A.S., Arruda,L.F.de, Regitano d Arce, M.A.B. (2009). Métodos de Extração e Qualidade da Fração Lipidica de matérias-primas de origem vegetal e animal. Revista Química Nova, v.32n.4, p Hasmann, F. A., Cortez,D. V., Gurpilhares, D. B., Roberto, I. C.; Júnior, A. P.( 2007)."Micelas reversas de lecitina de soja - uma alternativa para purificação de proteínas". Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. 43 (3): International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC); Standard methods for the analysis of oils, fats and derivatives, 6th ed., Pergamon Press: Oxford, Mertins, O., Sebben,M., Schneider,P.H., Pohlmann, A.R. e Silveira,N.P. (2008).Caracterização da pureza de fosfatidilcolina da soja através de RMN de 1 H e de 31P.Quim. Nova, Vol. 31, No. 7, Nelson, D.L.; Cox, M.M. (2006). Membranas biológicas e transporte.in:lehninger:principios da Bioquimica.4ª Ed.São Paulo:Savier, v.1,p.372. Schafer, K. (1998). Anal.Chim Soxhlet, F. (1879), Dinglers' Polyt. J., 232, 461.