Daniela Silvestre. Evolução do genoma mitocondrial e. relações filogenéticas entre. abelhas da subfamília Apinae

Transcrição

1 1 Daniela Silvestre Evolução do genoma mitocondrial e relações filogenéticas entre abelhas da subfamília Apinae São Paulo 2006

2 2 Daniela Silvestre Evolução do genoma mitocondrial e relações filogenéticas entre abelhas da subfamília Apinae Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Doutor em Ciências, na Área de Genética e Biologia Evolutiva. Orientador(a): Dra. Maria Cristina Arias São Paulo 2006

3 3 Silvestre, Daniela Evolução do genoma mitocondrial e relações filogenéticas entre abelhas da subfamília Apinae 111p. Tese (Doutorado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva. 1. DNA mitocondrial 2. ordem gênica 3. Subfamília Apinae I. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva. Comissão Julgadora: Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a). Maria Cristina Arias Orientadora

4 4 À minha mãe, em memória, que redefiniu "dificuldades", "superação" e, principalmente, "AMOR" no dicionário da minha vida. Dedico.

5 5 Era um conceito extremamente simples, mas capaz de explicar com naturalidade toda a infinita e desconcertante complexidade da vida. A admiração reverencial que experimentei fez com que o êxtase que as pessoas descrevem em relação à experiência religiosa parecesse francamente simplório em comparação. Eu escolhi o êxtase do conhecimento em vez do deslumbramento da ignorância, quaisquer que fossem as circunstâncias. Douglas Adams

6 6 Agradecimentos À minha orientadora Cristina, por todos esses anos de orientação extremamente competente e segura, seja para os experimentos, relatórios, artigos, prévias... E por estar sempre presente. Aos mestres, especialmente à Dra. Lyria Mori, Dra. Eliana Dessen, Dra. Maria Elena Infante- Malachias e Dr. Luís Netto, pelo conhecimento e pela amizade ao longo destes anos. À maravilhosa Susy, por ótimas conversas! E pela enorme competência técnica também... Aos alunos (atuais e ex ) do Lab: Leila, Flávio, Dani Lambda, Rute, Geraldo, Christiana, Dani Zoo, Lia, André, Alisson e os filhos adotivos que passaram mais rapidamente. A cara do laboratório sempre foi mudando, ao longo dos vários anos em que eu estive por aqui! A Elisângela, Sílvia e Luciana pelo apoio técnico no seqüenciamento das minhas muitas amostras. Aos funcionários do Departamento de Biologia, da Biblioteca e da Seção de Pós-Graduação, pela dedicação e trabalho indispensáveis. A todos os coletores dos exemplares utilizados neste projeto: não poderia ter sido realizado sem vocês. À FAPESP, pela bolsa concedida e pelo apoio financeiro. Ao assessor anônimo, que avaliou meu projeto e relatórios e sempre me incentivou. A todos os meus amigos, que já me ouviram falar tanto das mitocôndrias, da ordem gênica e das minhas abelhinhas incomuns que vivem solitárias no meio do mato, e que finalmente pararam de me censurar duramente quando eu explico que tenho que congelar os pobres bichinhos pelo bem da ciência! Eu continuo agradecendo ao meu ônibus fretado, que me trouxe até o Departamento nos últimos onze anos... De coração, à minha família, por ser tão unida e ter tanto amor. Especialmente, aos meus irmãos-padrinhos, por serem tão fortes e me apoiarem tanto! À minha segunda família, Alves: antes só no coração, hoje também no nome. Ao meu Drigo, por ser um homem maravilhoso, um companheiro para todas as horas, por ser meu esposo sem ter deixado de ser meu amigo. Com amor!

7 7 Índice 1. INTRODUÇÃO O DNA MITOCONDRIAL ANIMAL REARRANJOS E INFERÊNCIA FILOGENÉTICA O PROBLEMA DAS ABELHAS SISTEMÁTICA DE ABELHAS ESTUDOS TRADICIONAIS E MOLECULARES JUSTIFICATIVA DESCRIÇÃO DOS TÁXONS ESTUDADOS APINI BOMBINI CENTRIDINI EMPHORINI ERICROCIDINI EUCERINI EUGLOSSINI MELIPONINI TAPINOTASPIDINI TETRAPEDIINI XYLOCOPINAE: XYLOCOPINI MEGACHILIDAE: MEGACHILINAE: ANTHIDIINI HALICTIDAE: HALICTINAE: AUGOCHLORINI GRAUS DE COMPLEXIDADE E ROTAS DE EVOLUÇÃO DO COMPORTAMENTO SOCIAL COMPORTAMENTO SOLITÁRIO 26

8 COMPORTAMENTO SUBSOCIAL COMPORTAMENTO COMUNAL COMPORTAMENTO QUASISSOCIAL COMPORTAMENTO SEMISSOCIAL COMPORTAMENTO EUSSOCIAL PRIMITIVO OU SIMPLES COMPORTAMENTO EUSSOCIAL AVANÇADO OU COMPLEXO COMPORTAMENTO SOLITÁRIO E ESTRATÉGIA DE COLETA OBJETIVO MATERIAIS E MÉTODOS MATERIAL BIOLÓGICO METODOLOGIA COLETA POR NINHOS-ARMADILHA EXTRAÇÃO DE DNA POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) CLONAGEM DOS PRODUTOS DE PCR SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁTICO ANÁLISES COMPARATIVAS/FILOGENÉTICAS RESULTADOS E DISCUSSÃO I: SEQÜENCIAMENTO PARCIAL DE GENES MITOCONDRIAIS SUBUNIDADE MAIOR DO RNA RIBOSSÔMICO (16S) CITOCROMO C OXIDASE SUBUNIDADE I 51

9 CITOCROMO B EVIDÊNCIA TOTAL ANÁLISES MOLECULARES CONTEÚDO DE A+T RESULTADOS E DISCUSSÃO II: SEQÜENCIAMENTO DE REGIÕES MITOCONDRIAIS COM GENES PARA RNAT E ORDEM GÊNICA ORDENS GÊNICAS MITOCONDRIAIS DESENHO E ANÁLISE DAS ESTRUTURAS SECUNDÁRIAS DOS RNAT RNAT-ALA (A) RNAT-LYS (K) RNAT-MET (M) RNAT-VAL (V) A ORDEM GÊNICA NA ÁRVORE DE MICHENER (2000) RESULTADOS E DISCUSSÃO III: ANÁLISES DA TRIBO MELIPONINI SEQÜÊNCIAS PARCIAIS DO GENE COI ORDEM GÊNICA DO CLUSTER CONCLUSÕES CONSIDERAÇÕES FINAIS 95 RESUMO 98

10 10 ABSTRACT 99 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 100

11 11 1. Introdução 1.1. O DNA mitocondrial animal O DNAmt animal possui genes codificadores para 2 subunidades ribossômicas (12S e 16S), 22 RNA transportador (RNAt), 3 subunidades da enzima citocromo c oxidase (COI, COII e COIII), citocromo B (cytb), subunidades 6 e 8 da ATPase e sete subunidades da NADH desidrogenase (ND1, ND2, ND3, ND4, ND5, ND6 E ND6L), além de uma região rica em A+T (em vertebrados, é chamada D- loop) não codificadora e que parece conter o controle da replicação e transcrição do DNAmt. A região rica em A+T é muito variável entre os organismos, em relação à sua seqüência de bases e tamanho. Ao contrário dessa região, os genes apresentam-se similares em tamanho em uma ampla gama de espécies, entre invertebrados e vertebrados (Brown, 1983; Moritz et al., 1987). Quanto à seqüência de nucleotídeos, o grau de variabilidade depende muito do gene em questão (Simon et al., 1994). As seqüências completas ou de regiões dos genomas mitocondriais dos metazoários têm sido muito utilizadas para a inferência de relações filogenéticas (Avise, 1994; Sunnucks, 2000). Apesar de sua ampla aplicação, essa metodologia apresenta problemas que precisam ser melhor equacionados, como: evolução convergente dos nucleotídeos, taxas diferenciais de substituição entre os sítios, saturação de mutações em sítios altamente variáveis, substituições não-independentes por seleção na estrutura secundária, e restrições funcionais em termos moleculares (Rokas e Holland, 2000). Além disso, alguns grupos de organismos apresentam evolução muito rápida em sua seqüência de nucleotídeos, o que pode levar a

12 12 ambigüidades quando as seqüências são alinhadas, levando a uma falsa associação entre grupos não-monofiléticos (Boore e Brown, 1998). O advento da era genômica trouxe a oportunidade de evidenciar e comparar caracteres mais raros, como alterações na ordem gênica, em estudos evolutivos e filogenéticos. Tais marcadores parecem evitar os equívocos acima mencionados. Da mesma forma que o conteúdo gênico, a ordem dos genes nos genomas mitocondriais é notavelmente conservada entre os animais, principalmente quando consideramos táxons superiores (Moritz et al., 1987). Rearranjos têm sido descritos entre ordens taxonômicas diferentes, porém são eventos raros, e normalmente apenas os genes para RNAt estão envolvidos (Gray, 1989). Estes são considerados mais móveis por sua similaridade estrutural com os elementos de controle da replicação (Cantatore et al., 1987; Jacobs et al., 1988). A ocorrência dos eventos de translocação varia muito conforme o grupo estudado. Como exemplo, temos o primeiro rearranjo detectado entre ordens de insetos: a comparação da ordem gênica de Drosophila yakuba (Diptera) e Locusta migratoria (Orthoptera), onde apenas uma troca na ordem de dois genes para RNAt é observada (Haucke e Gellissen, 1988). Dentro da Ordem Diptera, por outro lado, apenas três alterações foram detectadas quando as espécies são comparadas. Esses resultados demonstram que, embora os genes para RNAt sejam mais susceptíveis a sofrerem transposições, esses eventos não são muito comuns. A ordem dos demais genes (codificadores de proteínas e RNAr) é conservada entre praticamente todos os invertebrados (Moritz et al., 1987) Rearranjos e inferência filogenética o problema das abelhas

13 13 A constatação desses eventos raros de translocação abriu uma nova perspectiva em estudos filogenéticos, onde seqüências completas de DNAmt podem ser comparadas entre grupos distantes enfocando a ordem gênica mitocondrial (Boore et al., 1995). O grande número de rearranjos potenciais faz com que a convergência seja raríssima; é um caráter seletivamente neutro e a homologia é quase sempre assegurada (Boore e Brown, 1998). Raros casos de homoplasia são descritos, como por exemplo uma translocação dentro da Ordem Orthoptera. Nesse caso, há trocas de posição entre os RNAt para os aminoácidos lisina e ácido aspártico. Essas alterações parecem ter ocorrido muitas vezes de maneira independente dentro dessa Ordem (Flook et al., 1995). Numerosos trabalhos têm obtido resultados relevantes empregando a análise da ordem gênica. O aumento do número de organismos cuja ordem gênica é conhecida provavelmente ajudará a estabelecer caracteres robustos e diagnósticos para ordens, famílias e até mesmo gêneros (Rawlings et al., 2001). A importância dessas evidências moleculares no entendimento da evolução do genoma mitocondrial, e também da evolução dos táxons animais, nos incitou a utilizá-las em uma tentativa de resolver questões controversas quanto à classificação e filogenia das abelhas (Família Apidae). Esses insetos, pertencentes à ordem Hymenoptera, têm importância fundamental na polinização da vegetação natural e das plantas cultivadas. Além disso, ainda fornecem produtos bastante valorizados pelo homem, como cera, própolis, geléia real e principalmente mel, um dos poucos alimentos impossíveis de serem sintetizados (Grimaldi e Engel, 2005). Em muitos países, as populações apícolas naturais têm sido destruídas pela atividade humana, muitas vezes antes de serem estudadas e conhecidas (Michener, 2000).

14 14 Adotaremos nesse trabalho a classificação publicada recentemente por Charles D. Michener (2000), pela qual a Família Apidae fui subdividida em três subfamílias: Xylocopinae, Nomadinae e Apinae. O enfoque deste projeto será a Subfamília Apinae, composta atualmente por 19 tribos (Tabela I). Tabela I Tribos pertencentes à subfamília Apinae segundo Michener (2000) e indicação se presentes ( ) ou não (-) na região neotropical. As quatro tribos em destaque são as Apidae corbiculadas. Tribos Região neotropical 01- Isepeolini 02- Osirini 03- Protepeolini 04- Exomalopsini 05- Ancylini - 06-Tapinotaspidini 07- Tetrapediini 08- Ctenoplectrini Emphorini 10- Eucerini 11- Anthophorini 12- Centridini 13- Rhathymini 14- Ericrocidini 15- Melectini Euglossini 17- Bombini 18- Meliponini 19- Apini (introduzida) Dentre estas, encontram-se as quatro tribos (Apini, Bombini, Euglossini e Meliponini) chamadas de Apidae corbiculadas, as quais definiam a subfamília antes de Michener (2000), e que têm especial importância nesse trabalho por serem as únicas que apresentam espécies com diferentes níveis de comportamento social. Fazem parte também dessa subfamília as tribos que antigamente compunham a Família Anthophoridae. Das 19 tribos de Apinae, 16 estão presentes na região Neotropical, sendo 15 tribos nativas e uma tribo introduzida, Apini (representada pela espécie Apis mellifera).

15 15 A classificação das abelhas e as relações filogenéticas entre elas sempre foram questões muito controversas, sofrendo alterações freqüentes conforme o autor e os métodos adotados. As análises comparativas do genoma mitocondrial (por seqüências e através da ordem gênica) podem constituir fontes de caracteres para a inferência de uma filogenia entre as tribos acima apresentadas, que pode ou não confirmar as relações sugeridas por Michener (2000). Por exemplo, uma questão a ser analisada é a polêmica inclusão das tribos da antiga família Anthophoridae no mesmo grupo tradicionalmente restrito às Apidae corbiculadas (Apini, Bombini, Euglossini e Meliponini) Sistemática de abelhas estudos tradicionais e moleculares As Apidae corbiculadas são um grupo tropical de abelhas com quase 1000 espécies (Roubik, 1989) que formam um clado dentro de Apinae (Roig-Alsina e Michener, 1993). Este é sustentado por vários caracteres, mas o mais conspícuo é a modificação da escopa (conjunto de pelos na perna posterior, responsável pela coleta de pólen e óleos) em uma reentrância com estrutura diferenciada, a corbícula (Figura 1), o que dá o nome ao grupo. Conforme comentado acima, esse grupo recebe especial atenção dos pesquisadores, porque duas tribos (Apini e Meliponini) apresentam um dos mais intrigantes comportamentos animais, a eussocialidade. Uma filogenia robusta entre essas tribos é de suma importância para resolver a dúvida sobre a origem e a evolução desse comportamento.

16 16 (A) (B) Figura 1 - Escopa (A) e corbícula (B), onde a seta aponta a reentrância que é preenchida de pólen ou óleos. (retiradas de Assim, a reconstrução da filogenia dessas abelhas tem sido motivo de vários estudos. Apesar de ser característica exclusiva de poucos grupos, a eussocialidade pode ter oferecido enormes vantagens competitivas às abelhas que a apresentam (Michener, 2000). Porém, há controvérsias até nesse ponto: Engel (2001) e Grimaldi e Engel (2005) afirmam que a eussocialidade não seria responsável pela irradiação das abelhas, pois não seria uma característica suficiente para dominância ecológica. Os estudos de sistemática clássica de abelhas baseiam-se primordialmente em caracteres morfológicos e também comportamentais. Quando procuram esclarecer a questão da evolução do comportamento social no grupo, geralmente os resultados desses trabalhos apontam para uma origem única do comportamento eussocial, pois consideram que as duas tribos eussociais (Apini e Meliponini) compartilham um ancestral comum exclusivo. Darwin, na sua Origem das Espécies, afirma que Meliponini seria intermediário ente Bombini e Apini, ressaltando portanto a origem única do comportamento eussocial no grupo. Essa visão tradicional foi mantida por muito tempo, baseada principalmente nas seguintes características comuns às duas tribos: formação de colônias grandes e perenes; castas morfologicamente

17 17 diferenciadas; e sistemas elaborados de comunicação entre os indivíduos (Koulianos et al., 1999). Em 1977 foi publicado o trabalho de Winston e Michener, baseado em morfologia externa e caracteres comportamentais, que foi inovador em concluir que a eussocialidade surgiu duas vezes independentemente nesses grupos. O argumento central era que Meliponini tinha caracteres que sugeriam uma diferenciação antiga, muito divergente das demais tribos. Bombini e Euglossini foram considerados grupos-irmãos, e Apini seria irmão desse clado. O trabalho de Kimsey (1984) corroborou essa árvore com base em outros caracteres de morfologia externa e também interna. Na década de 90, outros trabalhos (Prentice, 1991; Roig-Alsina e Michener, 1993) com caracteres morfológicos diferentes voltaram a considerar a origem única da eussocialidade, sugerindo que seria um comportamento muito complexo para surgir paralelamente em dois grupos. Ao mesmo tempo, na década de 90, diversos trabalhos foram feitos baseados em caracteres moleculares. Foram seqüenciados fragmentos dos genes 16S, 18S e 28S (Cameron, 1991 e 1993; Sheppard e McPheron, 1991) e todas essas análises chegaram à conclusão de que o advento da eussocialidade ocorreu duas vezes, pois Apini e Meliponini não são posicionados como grupos irmãos. Bombini aparece consistentemente como irmão de Meliponini, mas a relação entre Apini e Euglossini não é bem definida. Nos trabalhos citados, foram utilizados vários marcadores moleculares diferentes, como o gene mitocondrial para a subunidade maior do RNA ribossômico - 16S (Cameron, 1993). Porém, a própria autora cita que o 16S tem algumas desvantagens, como: (1) dificuldade no alinhamento por apresentar grandes indels;

18 18 (2) saturação de substituições; (3) estrutura secundária do produto gênico, que prejudica a independência entre os caracteres; e (4) um alto grau de polimorfismo ancestral. Para superar essas dificuldades, foram feitos estudos com outros genes. Koulianos et al. (1999) utilizaram seqüências do gene mitocondrial para o citocromo B. Genes nucleares também foram seqüenciados, como o 28S e o gene para a opsina (Mardulyn e Cameron, 1999). Há também tentativas de unir dados moleculares de todos esses genes em busca de árvores mais consistentes (Cameron e Mardulyn, 2001). Todos esses trabalhos associam Meliponini com Bombini, separadamente de Apini, indicando que o comportamento eussocial dos dois grupos evoluiu independentemente. Cameron e Mardulyn (2001) acreditam que essas análises seriam mais precisas do que as análises morfológicas, visto que as características de morfologia que são analisadas podem estar convergindo devido ao comportamento comum aos dois grupos, levando assim a acreditar que Apini e Meliponini são grupos irmãos. Além disso, os dados moleculares apresentam um volume maior de caracteres do que os morfológicos e comportamentais, a homologia é mais facilmente assegurada e a evolução dos caracteres segue modelos relativamente simples (Koulianos et al., 1999). Alguns autores procuram compilar dados morfológicos com moleculares, dando a eles novos tratamentos e interpretações, em uma abordagem chamada de evidência total. No caso das abelhas, as árvores filogenéticas obtidas dessa maneira sempre combinaram com as árvores originais dos trabalhos de morfologia. Dois desses trabalhos (Chavarría e Carpenter, 1994; Schultz et al., 1999) afirmam que os dados moleculares somente acrescentam ruído às análises conjuntas, portanto os

19 19 dados conclusivos seriam os morfológicos, já que a árvore de genes nem sempre equivale à filogenia das espécies. As árvores que ilustram as relações filogenéticas dentro das Apidae corbiculadas sugeridas em cada um dos trabalhos citados acima estão representadas na Figura 2. E B M A M A B E (A) (B) E B M A A E M B (C) (D) E B M A (E) Figura 2 Relações entre as Apidae corbiculadas resultantes de cada um dos trabalhos citados no texto. Os táxons nos terminais estão representados por letras (A = Apini; B = Bombini; E = Euglossini e M = Meliponini) Os ramos pontilhados são relações que os trabalhos correspondentes não conseguiram resolver. (A) Árvore baseada em morfologia, chamada de visão tradicional (Michener, 1944 e 1974); (B) Dados morfológicos e comportamentais (Winston e Michener, 1977 e Kimsey, 1984); (C) Novos dados morfológicos (Prentice, 1991 e Roig-Alsina e Michener, 1993); (D) Dados moleculares (Cameron, 1993 e Sheppard e McPheron, 1991); e (E) Evidência total (Chavarría e Carpenter, 1994). Não há, portanto, um consenso sobre o assunto, e nenhum marcador se mostrou suficientemente conclusivo, principalmente devido à alta variabilidade e

20 20 homoplasias. Dentro desse contexto problemático, todas as tentativas de resolver o clássico problema da sistemática das abelhas podem ser consideradas válidas Justificativa Dentro desse panorama complexo sobre a evolução das abelhas e do comportamento eussocial dentro do grupo, insere-se este trabalho. Um fato importante que nos levou a propor esse projeto foi a verificação, em produtos de PCR e posterior seqüenciamento, de alterações na ordem gênica quando regiões específicas do genoma mitocondrial de Melipona bicolor (tribo Meliponini) foram comparadas com Apis mellifera (Tribo Apini). Durante o mestrado, 77% do genoma mitocondrial de M. bicolor, contendo todos os 13 genes mitocondriais codificadores para proteínas, 18 dos 22 genes para RNAt e os dois genes para RNAr (sendo um integral e o outro parcialmente seqüenciado). O viés para o uso de bases A+T, bastante evidente em A. mellifera, mostrou-se ainda mais acentuado em M. bicolor. Foram encontradas diferenças no tamanho e composição dos genes. As diferenças mais significativas foram aquelas encontradas nas comparações da ordem gênica: pelo menos nove rearranjos na ordem gênica mitocondrial foram observados entre as duas espécies de abelhas, um fenômeno raro entre organismos tão próximos (Silvestre, 2002). A raridade de tais mudanças em outros grupos de organismos foi instigadora a estudos mais aprofundados do genoma mitocondrial das abelhas. Considerando que as duas tribos, Apini e Meliponini, são justamente aquelas que compartilham um comportamento intrigante, a eussocialidade, foi levantada a hipótese de que esses rearranjos poderiam servir como um excelente marcador para estudar a origem e a

21 21 evolução desse comportamento no grupo. Para tanto, foram estudados representantes das outras tribos de Apinae, em uma tentativa de reconstruir a história filogenética e o padrão de evolução de algumas características do DNAmt dentro do grupo. Este trabalho consistiu, portanto, de uma análise da evolução do genoma mitocondrial entre as abelhas da subfamília Apinae, visto as evidências de translocações de genes para RNAt, tidas na literatura como eventos raros, e, a partir desses resultados e de seqüenciamento de regiões desse genoma, uma tentativa de estabelecer as relações filogenéticas desse grupo. Como conseqüência, esses dados têm o potencial de fornecer maiores informações sobre o surgimento (único ou duplo) do comportamento social. A baixa ocorrência dos eventos de translocações dentro de grupos próximos aumenta sua importância evolutiva, podendo servir como um excelente marcador molecular. Além disso, seqüenciar parcialmente um gene mitocondrial pode ter alto valor filogenético, contanto que a região seja bem escolhida e apresente uma variação mais adequada do que aquelas que foram verificadas nos trabalhos citados acima. A ordem gênica mitocondrial é citada por diversos autores como um marcador molecular promissor para estudos de filogenia entre grupos distantes (Boore et al., 1995). Ainda não foram realizados trabalhos nesse sentido com a subfamília Apinae, mas existem alguns estudos promissores com ordens de insetos. Dowton e Austin (1999) encontraram um hot spot de translocações de genes para RNAt no genoma mitocondrial de diversos Hymenoptera, porém essencialmente vespas. No entanto, utilizar somente essa região poderia ser um problema devido à alta variabilidade e, portanto, alto grau de homoplasia (Dowton et al., 2002). Outro grupo que parece ter uma alta taxa de translocações e inversões no DNAmt são os hemipteróides (Shao et al., 2001a), e os autores indicam que pretendem ampliar esse estudo a fim de

22 22 estudar a filogenia das famílias. A experiência obtida com base nesses trabalhos será certamente de grande ajuda para tentar estudar a evolução dentro da subfamília Apinae Descrição dos táxons estudados Serão apresentadas pequenas descrições das tribos e gêneros dos exemplares estudados neste projeto. Todas as informações abaixo foram retiradas de Michener (2000) e de Silveira et al. (2002): Apini Esta tribo apresenta apenas um gênero, Apis, originário do Velho Mundo e posteriormente introduzido em todos os continentes para a produção de mel. Todas as espécies são eussociais e fazem ninhos em cavidades pré-existentes. O genoma mitocondrial da espécie A. mellifera foi completamente seqüenciado em 1993 (Crozier e Crozier, 1993), e foi utilizado neste trabalho Bombini São as mamangabas sociais (bumble bees), pertencentes a um único gênero muito diversificado e rico em espécies, Bombus; sua distribuição é quase cosmopolita, excetuando-se a Austrália, porém são mais bem adaptadas ao clima frio. Tem espécies primitivamente sociais, além de algumas parasitas (que não ocorrem no Brasil). A espécie coletada, Bombus morio, ocorre no Brasil desde o Rio Grande do Sul até a Bahia.

23 Centridini Sua distribuição restringe-se à região Neotropical, com alguns grupos nas regiões subtropicais e temperadas da América. São abelhas médias a grandes, coloridas, solitárias, que nidificam plesiomorficamente no solo, freqüentemente em grandes agregações. Inclui dois gêneros, Centris e Epicharis, ambos presentes no Brasil. O gênero coletado, Centris, reúne muitas espécies, mais abundantes nas regiões tropicais úmidas Emphorini Espécies robustas, muitas especialistas em pólen de algumas espécies de plantas, sendo todas solitárias. Esta é uma tribo exclusiva das Américas (do Chile e Argentina até o Canadá, mas sendo mais diversificada nas regiões temperadas da América do Sul). O exemplar, da espécie Melitoma segmentaria, foi coletado em Santa Catarina, que não fazia parte dos locais de coleta desta espécie descritos na lista de Silveira et al. (2002) Ericrocidini Tribo que ocorre somente nas Américas, sendo que no Brasil estão representadas por nove gêneros. São abelhas médias ou grandes, todas cleptoparasitas de espécies da tribo Centridini. O gênero coletado, Mesocheira, distribui-se por toda a região neotropical Eucerini São abelhas médias a grandes, pilosas, sendo que os machos de muitas espécies são facilmente reconhecidos pelas longas antenas. Quase todas as espécies

24 24 são solitárias e constroem ninhos no solo. Distribui-se por todo o mundo, exceto Austrália, sendo mais abundantes na América do Sul; no Brasil ocorrem 19 gêneros. O gênero do exemplar que foi coletado, Thygater, é exclusivo da região neotropical Euglossini São chamadas abelhas das orquídeas (orchid bees), com cinco gêneros amplamente distribuídos na região neotropical, principalmente nas florestas úmidas. Os machos são polinizadores de muitas espécies de orquídeas, que visitam em busca de substâncias aromáticas. São solitárias, geralmente grandes e de colorido metálico e vistoso. Geralmente, fazem ninhos em cavidades pré-existentes em barrancos ou árvores. O gênero coletado foi Eufriesea, que tem diversas espécies que ocorrem no Brasil, relativamente raras e freqüentemente sazonais Meliponini São as abelhas indígenas sem ferrão, representadas por muitas espécies em toda a região tropical e também na região subtropical do hemisfério sul. Além de Apini, é o único grupo que exibe comportamento eussocial, que pode ser observado em todas as espécies (apesar de algumas delas sobreviverem à custa de alimento roubado de outras colônias). Os ninhos são geralmente instalados em cavidades préexistentes. A espécie Melipona bicolor já tem seu genoma mitocondrial quase totalmente seqüenciado, e esses dados foram utilizados neste trabalho. Além disso, foram incluídas outras espécies da tribo para comparação de uma região específica do genoma mitocondrial.

25 Tapinotaspidini Tribo exclusivamente neotropical, composta por espécies solitárias, coletoras de óleo, que antes eram consideradas parte de Exomalopsini. A maioria das espécies nidifica no solo, como o gênero estudado, Lanthanomelissa. A exceção é o outro gênero que foi coletado, Paratetrapedia, que utiliza orifícios pré-existentes na madeira Tetrapediini São abelhas pequenas e esguias, ocorrendo nas regiões tropicais das Américas. A tribo inclui apenas dois gêneros, sendo Coelioxoides cleptoparasita dos ninhos do outro gênero, Tetrapedia Xylocopinae: Xylocopini Abundantes nas regiões mais quentes, são chamadas de abelhas carpinteiras porque, à exceção de um subgênero paleártico, costumam nidificar em madeira. O gênero estudado, Xylocopa, é solitário e compõe-se de abelhas grandes e robustas Megachilidae: Megachilinae: Anthidiini A subfamília possui duas características distintivas: as fêmeas carregam pólen apenas em uma escopa ventral, e utilizam-se de material coletado para construção de ninhos (folhas e resinas vegetais). Solitárias, estão representadas aqui pelo gênero Dianthidium.

26 Halictidae: Halictinae: Augochlorini Abelhas pequenas a médias, de coloração metálica, geralmente com ninhos no solo ou em madeira podre. Há diversos graus de comportamento social, que evoluíram independentemente dentro do grupo por diversas vezes, inclusive com a ocorrência de reversão da socialidade para comportamento solitário. A tribo é predominantemente neotropical e certamente monofilética. Foram estudadas duas espécies: Augochlora sp. e Neocorynura sp Graus de complexidade e rotas de evolução do comportamento social As abelhas são um grupo muito diverso quando observamos o grau de socialidade de suas espécies. O comportamento social dos animais apresenta diversos graus de complexidade, que podem ser classificados em uma escala que vai do comportamento solitário até o eussocial avançado, conforme a presença de certas características etológicas e morfológicas. Será apresentada aqui uma classificação desse comportamento (Michener, 1969), para facilitar o entendimento posterior dos termos relacionados com esse assunto. acasalamento Comportamento solitário Os membros da espécie não interagem, exceto para corte e

27 Comportamento subsocial Os adultos cuidam da própria prole por algum tempo, de forma a aumentar sua sobrevivência. É amplamente encontrada nos artrópodes: crustáceos, aranhas, ácaros, escorpiões, centopéias, baratas, grilos, besouros e hemípteros, além de várias espécies de Hymenoptera Comportamento comunal Membros da mesma espécie coabitam (mesmo ninho ou próximos), mas não têm cuidado cooperativo das proles. Além de muitas abelhas, também ocorre em aranhas Comportamento quasissocial Membros da mesma espécie coabitam (mesmo ninho ou próximos), com cuidado cooperativo das proles. Ocorre em abelhas e aranhas Comportamento semissocial Membros da mesma espécie coabitam (mesmo ninho ou próximos), com cuidado cooperativo da prole, mas nesse caso há diferenciação de castas (operárias estéreis e rainha fértil). Não há, porém, sobreposição entre as gerações, pois a colônia não é perene, desfazendo-se após a reprodução. Muitas abelhas e vespas apresentam esse comportamento Comportamento eussocial primitivo ou simples Cuidado cooperativo da prole, diferenciação de castas e sobreposição de gerações, com baixo grau de diferenciação (e, portanto, maior flexibilidade no

28 28 papel de cada indivíduo). Também ocorre em muitas abelhas e vespas. Há um caso descrito em mamíferos: o rato-toupeira sem pelos (Heterocephalus glaber), o único eussocial não-pertencente ao Filo Arthropoda (Grimaldi e Engel, 2005) Comportamento eussocial avançado ou complexo Há cuidado cooperativo da prole, diferenciação de castas e sobreposição de gerações, com um altíssimo grau de diferenciação. Isso faz com que o papel de cada indivíduo seja considerado irreversível. Ocorre em todas as espécies de cupins (Ordem Isoptera), que compartilham um ancestral comum eussocial que surgiu há 140 milhões de anos (Grimaldi e Engel, 2005). Dentro de Hymenoptera, muitas formigas, abelhas (Apinae e Meliponinae) e vespas (Vespinae) apresentam esse grau de comportamento. Assim, em insetos a eussocialidade é restrita a essas duas ordens, além de um único caso em Coleoptera, o besouro eussocial Austroplatypus incompertus (Kent e Simpson, 1992). A partir da observação desses comportamentos na natureza, foram idealizadas duas hipóteses a respeito da rota que a socialidade teria tomado ao longo da evolução. A primeira é a rota subsocial, em que um adulto solitário teria começado a cuidar de sua prole (apresentando comportamento subsocial), fenômeno que seria seguido de sobreposição de gerações e posteriormente culminaria com o desenvolvimento de uma casta estéril, até o nível eussocial avançado. A rota parassocial inclui mais passos evolutivos para a formação do comportamento eussocial avançado: haveria uma agregação de irmãs da mesma geração (comportamento comunal), em seguida haveria cuidado cooperativo da prole (quasissocial), com posterior diferenciação de castas (semissocial) e por último, a

29 29 sobreposição de gerações e a total perda da capacidade reprodutiva das operárias, gerando o comportamento eussocial avançado. Não há provas concretas de qual seria a rota verdadeira, mesmo porque ambas podem ter ocorrido em diferentes grupos animais Comportamento solitário e estratégia de coleta Apesar de as abelhas apresentarem todos os graus de comportamento social existentes, conforme explicação acima, o comportamento solitário é o mais comum entre elas: 85% das cerca de espécies são solitárias. Essas abelhas são muito importantes na polinização de plantas cultivadas e principalmente das plantas selvagens, e estão ameaçadas pelas monoculturas, já que nesse caso o alimento só está disponível (em grande quantidade) em uma pequena época do ano, durante a floração daquela planta específica (Batra, 1984). Cada fêmea dessas espécies solitárias se acasala, faz seu ninho, procria e estoca alimento independentemente, sendo portanto de difícil coleta em campo. Para minimizar essa dificuldade em encontrar e capturar as abelhas diretamente com a rede entomológica, podem ser utilizados ninhos-armadilha para tentar atraí-las, baseandose no fato de que muitas espécies utilizam cavidades pré-existentes para nidificar, como buracos de besouros. Essa técnica foi popularizada por Karl V. Krombein, na década de 50, e desde então são utilizados ninhos de diversos tipos de materiais, como bambu, papel e madeira ( No entanto, com toda sua experiência no estudo das abelhas, Michener (2000) afirma ter se impressionado com a escassez de abelhas não-eussociais em coletas nas regiões tropicais. Há diversas explicações possíveis para esse fato: a maioria das

30 30 espécies solitárias faz ninhos no solo, onde a alta umidade dos trópicos seria catastrófica para a comida e para a larva, tanto por liquefazer a comida quanto pela quantidade de fungos que podem atacá-la. Além disso, a predação por formigas é muito mais intensa; e por fim, a competição com as abundantes Apini e Meliponini seria muito difícil, já que estas forrageiam o ano todo e são muito mais ativas. Há, inclusive, um exemplo prático desse fato na Guiana Francesa: no continente, há muitos meliponíneos, e pouquíssimas abelhas de espécies solitárias; nas ilhas, para onde os meliponíneos não conseguem se dispersar, há somente solitárias, muito abundantes (Michener, 2000). Esses fatos podem dificultar a coleta de exemplares solitários pertencentes a todas as tribos.

31 31 2. Objetivo O objetivo deste trabalho foi procurar estabelecer relações filogenéticas entre as espécies pertencentes a tribos da Subfamília Apinae que habitam a região neotropical. Considerando que a Subfamília Apinae inclui quatro tribos com diferentes graus de comportamento social, essa filogenia poderia ajudar a compreender melhor a origem e evolução desse comportamento no grupo. Na busca desse objetivo, foram escolhidas duas categorias de dados moleculares para a obtenção de caracteres filogenéticos: 1. seqüências parciais de genes mitocondriais; 2. seqüências das regiões mitocondriais onde há genes para RNAt, buscando comparar as variações na ordem gênica mitocondrial;

32 32 3. Materiais e Métodos 3.1. Material biológico Os dados de duas tribos, Apini e Meliponini, já haviam sido obtidos previamente: o genoma mitocondrial de Apis mellifera está seqüenciado totalmente (Crozier e Crozier, 1993) e o de Melipona bicolor foi seqüenciado quase integralmente no mestrado (Silvestre, 2002; Silvestre e Arias, in prep). Para a realização deste projeto, foram coletados e analisados os dados de dez tribos diferentes dentro da subfamília Apinae. Além disso, diversos táxons de subfamílias e famílias diferentes de abelhas foram analisados, para possibilitar o uso de gruposexternos (Tabela II). Foram utilizados indivíduos criados em cativeiro e também espécimes coletados diretamente do ambiente natural, por meio de rede entomológica ou ninhos-armadilha. Em qualquer um dos casos, as amostras obtidas foram imediatamente armazenadas a -80 C até a extração do DNA. Todas as abelhas foram identificadas por uma especialista (Dra. Isabel Alves dos Santos ou Dra. Favízia Freitas de Oliveira) antes de serem analisadas com as técnicas moleculares.

33 33 Tabela II - Dados dos exemplares de abelhas estudados. Os asteriscos (*) indicam as espécies cujos dados foram retirados da literatura. Ordem Família Subfamília Tribo Espécie(s) Coletor Cidade de coleta Data de coleta Hymenoptera Apidae Apinae Apini Apis mellifera * * * Bombini Bombus morio Isabel Alves dos Santos São Paulo, SP 01/10/2001 Centridini Centris sp. Rute Magalhães Brito Sinop, MT 22/06/2001 Centris tarsata Christiana Klingenberg Boracéia, SP 25/01/2003 Emphorini Melitoma segmentaria Thiago de Souza Criciúma, SC 01/03/2005 Ericrocidini Mesocheira sp. Rute Magalhães Brito Cuiabá, MT 25/08/2002 Eucerini Thygater sp. Maria Cristina Arias São Roque, SP 29/05/2001 Euglossini Eufriesea sp. Marilda Cortopassi-Laurino e Márcia F. Ribeiro Mogi das Cruzes, SP 27/11/2001 Meliponini Melipona bicolor * * * Tapinotaspidini Lanthanomelissa sp. Isabel Alves dos Santos Içara, SC 20/10/2004 Tetrapediini Coelioxoides sp. Isabel Alves dos Santos São Paulo, SP 17/03/2001 Tetrapedia sp. Christiana Klingenberg Boracéia, SP 09/02/2003 Xylocopinae Xylocopini Xylocopa sp. Flávio de Oliveira Francisco São Paulo, SP 10/10/2001 Halictidae Halictinae Augochlorini Augochlora sp. Favízia Freitas de Oliveira São Paulo, SP 27/05/2004 Neocorynura sp. Daniela Silvestre São Paulo, SP 27/05/2004 Megachilidae Megachilinae Anthidiini Dianthidium sp. Daniela Silvestre São Paulo, SP 27/05/2004

34 34 No decorrer do projeto, foram amostradas outras espécies da tribo Meliponini de diversas regiões de sua área de distribuição para verificar a possibilidade de generalização dos resultados obtidos com Melipona bicolor. Assim, foram coletadas mais espécies de meliponíneos brasileiros, principalmente de gêneros considerados distantes de Melipona, antes considerados outra tribo (Trigonini). Além disso, foram obtidos exemplares de um meliponíneo proveniente da Índia e de duas espécies da Tailândia. Espécies australianas foram analisadas pelo Dr. Mark Dowton, da Wollongong University, colaborador dessa parte do projeto. A Tabela III apresenta as espécies analisadas e suas regiões de origem dentro da região neotropical. Tabela III - Espécies de Meliponini coletadas. Espécie Origem do ninho Coletor Data Lestrimellita limao São Sebastião, SP, Brasil Rute Magalhães Brito 14/03/01 Plebeia remota Prudentópolis, PR, Brasil Flávio de Oliveira Francisco 31/03/98 Scaptotrigona xantotricha Viçosa, MG, Brasil Patrícia Drummond 28/09/99 Schwarziana quadripunctata Cunha, SP, Brasil Maria Cristina Arias 12/07/99 Tetragonisca angustula Sinop, MT, Brasil Rute Magalhães Brito 23/06/01 Heterotrigona iridipennis Índia Meiyappan Muthuraman 01/09/04 Austroplebeia australis Austrália Patrícia Drummond Austroplebeia symei Austrália Patrícia Drummond Tailândia sp1. Tailândia Tailândia sp2. Tailândia Trigona carbonaria Austrália Patrícia Drummond Trigona hockingsi Austrália Patrícia Drummond 3.2. Metodologia Coleta por ninhos-armadilha Foram instalados ninhos-armadilha para a coleta das tribos solitárias. Para aumentar as chances de obter abelhas de diferentes ambientes, foram colocados conjuntos de armadilhas em diversas cidades do estado de São Paulo: São Paulo (Jardim do Departamento de Botânica do IBUSP), São Roque, Jaguariúna, Suzano e

35 35 São Pedro. Cada um desses pontos de coleta recebeu um conjunto de ninhosarmadilha, de dois tipos: Ninhos de madeira: pequenas caixas de madeira com orifícios de diferentes tamanhos, que são fechadas com fita crepe e podem ser abertas longitudinalmente (Figura 3). Os ninhos foram emprestados pelo Prof. Dr. Carlos Brandão, do Museu de Zoologia da USP. Foram pendurados em maços, cada um com diversos tamanhos de orifícios (profundidade x diâmetro, em cm): 16 x 1,2; 16 x 1,0; 16 x 0,8; 16 x 0,4; e 8 x 0,2. Essa variedade é importante para tentar atrair o maior número de espécies possível. Ninhos de cartolina em tronco: tubos confeccionados com cartolina preta, medindo 8 x 0,5 cm (profundidade x diâmetro). Foram coletados troncos de árvores velhos na Composteira da USP, cada tronco foi perfurado com furadeira elétrica em cerca de 12 pontos de sua lateral, e os canudos de cartolina foram inseridos nesses furos (Figura 4). As armadilhas foram deixadas nos locais por períodos longos, maiores do que um ano, para abranger todas as possíveis épocas de nidificação. Contudo, eram verificadas mensalmente em busca de amostras. Quando um dos orifícios se encontrava fechado por algum material (cera, argila, terra etc.), o tubo (de madeira ou cartolina) era trazido para o laboratório e aguardava-se o surgimento dos adultos para identificação e posterior congelamento do espécime. Para tanto, foram montadas incubadoras, com segmentos de 20 cm de mangueira de plástico (5 cm de diâmetro), cujas extremidades foram fechadas com tela de arame (malha de 2 mm) amarrada com barbante (Figura 5). As armadilhas foram mantidas dentro dessas incubadoras, em local iluminado e à temperatura ambiente, e vistoriadas diariamente.

36 36 (A) 2 cm (B) Figura 3 - Ninhos-armadilha de madeira. Em (A) a armadilha está aberta, com a seta mostrando um resto de cera de uma nidificação. Em (B), pode-se observar um maço de armadilhas de diversos tamanhos, tais como foram colocadas nos locais de coleta. (A) 2 cm 2 cm (B) Figura 4 - Tronco-armadilha, com tubos de cartolina. Em (A), um tronco com diversos tubos encaixados e um tubo (indicado pela seta) em detalhe. Em (B), um tronco e um maço de ninhos de madeira. 2 cm (A) (B) Figura 5 - Incubadoras para ninhos-armadilha. Em (A), uma incubadora aberta, durante a colocação de um ninho-armadilha. Em (B), a incubadora já fechada com tela de arame e barbante, aguardando a emersão dos adultos.

37 Extração de DNA Foram adotados dois métodos de extração de DNA, conforme a disponibilidade de indivíduos de cada espécie. Para espécies com mais de um indivíduo coletado, o método escolhido foi o descrito por Sheppard e McPheron (1991). Esse método, em estudos prévios com diversas espécies de abelhas, se mostrou o mais eficiente em termos de rendimento de ácidos nucléicos por tórax macerado e qualidade do DNA obtido, e nos forneceu resultados positivos em reações de PCR e RFLP (Francisco et al., 2001). Não foi possível preservar os espécimes após a extração, visto que esta foi feita a partir do tórax do indivíduo, mas os abdomens e cabeças foram guardados a -80 C para o caso de necessitarmos de mais DNA do mesmo indivíduo na finalização das análises. No caso das espécies com apenas um indivíduo coletado, foi realizada uma extração através do método Chelex (Walsh et al., 1991), a partir de uma perna de um indivíduo. Apesar do DNA resultante ser menos purificado e concentrado, o método foi escolhido porque rende um volume final maior, pois essas abelhas foram coletadas na natureza e não haveria mais indivíduos disponíveis para realizar outras extrações Polymerase chain reaction (PCR) Para amplificar diversas regiões do DNAmt, foram testados primers derivados de Apis mellifera, Melipona bicolor e outros considerados universais para o genoma mitocondrial dos insetos (Hall e Smith, 1991; Simon et al., 1994; Arias et al., 1998, Castro et al., 2002). Para cada espécie estudada, procurou-se amplificar quatro fragmentos de genes mitocondriais: subunidade maior do RNA ribossômico (16S),

38 38 citocromo B (cytb), citocromo c oxidase subunidade I (COI) e NADH desidrogenase subunidade 2 (ND2). Todos esses genes já foram utilizados com sucesso em diversos trabalhos com insetos, sendo que os dois primeiros genes apresentam seqüência mais conservada e o último é mais variável (Simon et al., 1994). Os genes escolhidos serão testados individualmente, pois é necessário se determinar qual deles apresenta um grau de variação adequado para resolver as relações dentro da subfamília. Além disso, foram feitas amplificações de regiões entre os genes maiores (codificadores de proteínas e RNAr), procurando determinar a ordem dos genes de RNAt nos genomas. Esse tipo de amplificação é um pouco mais difícil, já que é necessário, em muitos casos, combinar primers derivados de organismos diferentes para se chegar a uma combinação eficaz para amplificar essas regiões variáveis. Roehrdanz et al. (2002) afirma que, em insetos, é impossível prever se um par de primers funciona de uma espécie para outra, o que leva a um enorme número de testes. Todos os primers que geraram amplificação em pelo menos uma das espécies testadas estão na Tabela IV.

39 39 Tabela IV - Primers utilizados para a amplificação de regiões do genoma mitocondrial das abelhas estudadas. Primer Seqüência Referência 16SF CACCTGTTTATCAAAAACATGTCC Hall e Smith, SR CGTCGATTTGAACTCAAATCATG Hall e Smith, R GAAATTAATATAACATGACCACC Arias et al., R TTATATATCTAATTCTAT (desenhado no laboratório) AMB 01 TGATAAAAGAAATATTTTGA Arias et al., 1998 AMB 03 TTTAAAAACTATTAATCTTC Arias et al., 1998 AMB 04 GAAAGTTAGATTTACTCC Arias et al., 1998 ATP8 CTTATAGGTACTATTTGWGG Castro et al., 2002 COX2 ATTGGACATCAATGATATTGA Castro et al., 2002 Mel 2 TGGAAAAATAATAATTG (desenhado no laboratório) mtd 07 GGATCACCTGATATAGCATTCCC Simon et al., 1994 mtd 08 CAACATTTATTTTGATTTTTTGG Simon et al., 1994 mtd 09 CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC Simon et al., 1994 mtd 10 TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT Simon et al., 1994 mtd 12 TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA Simon et al., 1994 mtd 19 GAAATTTGTGGAGCAAATCATAG Simon et al., 1994 mtd 22 TCAACAAAGTGTCAGTATCA Simon et al., 1994 mtd 26 TATGTACTACCATGAGGACAAATATC Simon et al., 1994 mtd29 GGTCCCTTAGGAATTTGAATATATCCT Simon et al., 1994 NAD3 ATNTTTTTAATTTTTGAYGT Castro et al., 2002 NAD5a GYTGGNTWTTATTCWAARGA Castro et al., 2002 ND4F ATAAATTATGAACTTGGTCATCA (desenhado no laboratório) Seq 07 GGAATAAGTCGTAACATAG (desenhado no laboratório) Seq 13 CCCTGATACAAAAGGTAC (desenhado no laboratório) Seq 18 GAACTATCAATTTGATATTG (desenhado no laboratório) Seq 19 TGGGATTGAATCCATATTC (desenhado no laboratório) Seq 21 CTATTAAAACAATTGGTCATC (desenhado no laboratório) Seq 30 TCGAGTTCCATTTGATTT (desenhado no laboratório) Seq 32 AATGCAGTTGCTATTGATA (desenhado no laboratório) Seq 33 TTTTGATGGACCCAAATTC (desenhado no laboratório) Seq 34 TCTACATTAAGACAATTAGG (desenhado no laboratório) Seq 48 ATTACATTTAATTTCCAA (desenhado no laboratório) Seq 50 TAGAATATTAATAATTTGAAA (desenhado no laboratório) Seq 51 AATCCTCCAATTAAAAATGG (desenhado no laboratório) Seq 52 ATTGGACATCAATGATATTG (desenhado no laboratório) Seq 53 CTTATAGGTACTATTTGWG (desenhado no laboratório) Seq 56 TATGTACTACCATGAGGACAAATAT (desenhado no laboratório) Seq 57 GTAGCATTTTTAACTTTATTAGAAC (desenhado no laboratório) Seq 58 TTGAGGAGCAACAGTTATTAC (desenhado no laboratório) Seq 59 AAATATCATTCAGGTTTAATRTG (desenhado no laboratório) Seq 60 GAAATATTTTGATAAAATATT (desenhado no laboratório) Seq 61 GGTTCATACCCTGTCGATAAAT (desenhado no laboratório) Seq 63 TGCATGACTAGTAACAATTG (desenhado no laboratório) Seq 65 ATAGGTACTATTTGWGGAAT (desenhado no laboratório) Seq 66 TAATTTTTGAYGTTGAAATT (desenhado no laboratório) TpheF GCGTAATATTGAAAATATTAATGA (desenhado no laboratório) Para as reações de PCR foram utilizados 1 µl do DNA extraído por um dos métodos acima; 5 µl de tampão de PCR; 1,5 µl de MgCl 2 100mM; 1,5 µl de cada primer 20 µm; 5 µl de dntps 2 mm cada e 2,5 U de Taq DNA polimerase

40 40 (Invitrogen), em um volume final de 50 µl. As condições de amplificação inicialmente utilizadas foram: desnaturação inicial por 5 min. a 94 C, seguida por 35 ciclos (desnaturação a 94 C/1 min.; anelamento a 42 C/1min. e 20 seg. e elongação a 64 C/2 min) e de um passo extra de extensão a 64 C por 10 min. Os produtos amplificados foram analisados eletroforeticamente em gel de agarose 0,8%, corado com brometo de etídeo e os fragmentos visualizados através de luz ultravioleta (UV). Nos casos em que a amplificação não ocorreu, foram realizadas tentativas posteriores, aumentando a concentração de MgCl 2 em até 10% ou diminuindo a temperatura de anelamento em até 4 C, a fim de diminuir a estringência das condições e aumentar a chance de amplificação. Nos casos de amplificação com baixo rendimento, uma estratégia utilizada foi a adição de Betaína (USB), à concentração final de 1M (Hengen, 1997). Por outro lado, se a amplificação dava origem a bandas extras, a banda correta foi excisada do gel e purificada com o Purelink Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) conforme instruções do fabricante, para poder ser submetida à clonagem sem problemas Clonagem dos produtos de PCR Os fragmentos resultantes da reação de PCR foram ligados em plasmídeos específicos para essa finalidade, utilizando o kit pgem-t Easy (Promega) ou o T.A. Cloning Kit (Invitrogen), conforme as instruções dos fabricantes. Células competentes de Escherichia coli foram preparadas de acordo com o método descrito por Sambrook et al. (1989) e transformadas com os plasmídeos recombinantes de acordo com o seguinte protocolo: 100 µl de células foram incubados com 2 µl de plasmídeo recombinante por 15 minutos no gelo, em seguida a

41 41 37 C por 5 minutos e por mais 15 minutos no gelo. À temperatura ambiente, 250 µl de meio LB foram acrescentados, seguindo-se uma incubação a 37 C sob agitação por uma hora. As células transformadas foram plaqueadas em meio LB-ágar com ampicilina e X-Gal e incubadas pela noite a 37 C. Colônias brancas (contendo plasmídeos recombinantes) foram inoculadas em meio LB e incubadas pela noite a 37 C. Os plasmídeos recombinantes foram extraídos pelo método para miniprep descrito no manual Automated DNA Sequencing Chemistry Guide da Perkin Elmer Corporation, o qual pode ser encontrado no site da empresa ( Para verificar se realmente continha o inserto de tamanho esperado, uma alíquota de 10% de cada miniprep foi digerida com 5U de Eco RI. Esta enzima possui dois sítios de restrição que flanqueiam o inserto, de modo que, quando ocorre a digestão, este é isolado do plasmídeo. Ao final de uma hora, as digestões foram interrompidas e submetidas à eletroforese em gel de agarose 0,8%. Os géis foram corados com brometo de etídeo e os fragmentos visualizados através de luz UV. Os clones foram considerados positivos quando o inserto excisado do plasmídeo apresentou um tamanho compatível com o produto de PCR correspondente Seqüenciamento automático Os clones positivos foram seqüenciados utilizando-se o kit para seqüenciamento automático Big Dye Terminator (Applied Biosystems), seguindo o protocolo do fabricante. As amostras foram analisadas em seqüenciadores automáticos modelo ABI-PRISMA 310 (Applied Biosystems), do Departamento de