CLART SeptiBac + DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE BACTÉRIAS GRAM- POSITIVAS E FUNGOS CAUSADORES DE SEPTICEMIA PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO

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1 CLART SeptiBac + DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE BACTÉRIAS GRAM- POSITIVAS E FUNGOS CAUSADORES DE SEPTICEMIA PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO 1

2 CLART SeptiBac + Amplificação CLART SeptiBac + Deteção 48 testes Refª: CS testes Refª: CS CLART e CLART-Strip são marcas registadas de GENOMICA Para mais informações e questões, não hesite em visitar GENOMICA, S.A.U. Alcarria, 7, Coslada, Madrid, Espanha Tel: , Fax: Versão 1 Março de

3 ÍNDICE: 1. GLOSSÁRIO DE TERMOS 2. DESCRIÇÃO 3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DO KIT 3.1. Reagentes de extração, purificação e amplificação 3.2. Reagentes de visualização 3.3. Outros componentes 4. MATERIAL ADICIONAL 4.1. Reagentes e material 4.2. Equipamento 5. PROCEDIMENTOS E RECOMENDAÇÕES DE MANIPULAÇÃO 5.1. Recomendações gerais 5.2. Precauções para a extração 5.3. Precauções para a visualização 6. AMOSTRAS: HEMOCULTURAS 7. PROTOCOLOS DE TRABALHO 7.1. Extração automática do ADN de microrganismos presentes em hemoculturas 7.2. Reação de amplificação 7.3. Visualização do produto amplificado 8. LEITURA DE RESULTADOS 9. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS 10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE FUNCIONAMENTO 3

4 1. GLOSSÁRIO DE TERMOS Consultar Instruções de Utilização Prazo de validade Dispositivo para diagnóstico in vitro Lote 20ºC 25ºC Conservar a temperatura ambiente 4ºC 8ºC Conservar entre 4 ºC e 8 ºC - 30ºC -18ºC Conservar entre -30 ºC e -18 ºC 4

5 2. DESCRIÇÃO CLART SeptiBac + deteta a presença das seguintes bactérias Gram-positivas e fungos causadores de bacteremia, fungemia, septicemia ou choque sético. Staphylococcus aureus* Staphylococcus epidermidis* Staphylococcus hominis* Staphylococcus haemolyticus* Streptococcus pyogenes/dysgalactiae Streptococcus pneumoniae Streptococcus mitis Streptococcus agalactiae Streptococcus sanguinis/parasanguinis Streptococcus do grupo milleri (incluindo S. constellatus e S. anginosus) Deteção genérica de Streptococcus spp. Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Grupos de Cocos Gram-positivos (CGPs) Listeria monocytogenes Clostridium perfringens Candida albicans Candida glabrata Candida krusei Deteção genérica de Candida spp. (não incluída a deteção de Candida parapsilosis) Grupos de fungos universais. * Incluindo a deteção de região meca, responsável pelo aparecimento da resistência à meticilina nos Staphylococci. A deteção dos diferentes microrganismos é conseguida através da amplificação por PCR de um fragmento específico cujo tamanho oscila entre 149 e 500 pares de bases. A amplificação foi realizada em dois tipos diferentes de tubos de PCR. Os tubos Mix 1 são brancos e permitem a amplificação e subsequente deteção de bactérias Grampositivas, exceto a Clostridium perfringens. Os tubos Mix 2 são verdes e contêm tudo o que é necessário para a amplificação de fungos e de Clostridium perfringens. A plataforma baseia-se numa micro matriz de baixa densidade, fixa na base de uma tira de 8 poços (CLART Strip-CS) (Figura 1), proporcionando um meio muito eficiente e fácil de usar o sistema. Esta tecnologia permite a deteção simultânea de múltiplos marcadores moleculares para uso diagnóstico, ao mesmo tempo que proporciona os controlos necessários para assegurar a fiabilidade dos resultados. Além disso, este sistema 5

6 simplifica consideravelmente os processos de hibridização e visualização, quando comparado com os sistemas clássicos de micro matriz. Figura 1: Plataformas CLART em forma de tira de 8 poços (CS). A hibridização do produto de PCR amplificado é detetada pela criação de um precipitado insolúvel nos locais de micro matriz, onde os produtos amplificados foram recolhidos por sondas. Este facto é conseguido utilizando oligonucleotídeos marcados com biotina. Os produtos de amplificação biotinilados hibridizam-se nas suas sondas específicas, ligadas à superfície de micro matriz, e imobilizam-se. Estes produtos biotinilados imobilizados são reconhecidos pela estreptavidina de um conjugado de estreptavidina-peroxidase, proporcionando assim atividade de peroxidase aos produtos hibridizados. Posteriormente, a atividade de peroxidase metabolizará a o-dianisidina e produzirá um produto insolúvel que se precipitará nos locais onde ocorreu a hibridização (Figura 2). Matriz de sondas Marcação Biotina Hibridização Conjugação Conjugado do catalisador Reação de revelação Substrato precipitado 6

7 Figura 2: Diagrama do método de visualização. As sondas, imobilizadas sobre a superfície, captam os seus produtos amplificados complementares marcados com biotina. Com a ajuda da biotina, o conjugado liga-se, neste caso à estreptavidina-hrp (HorseRadish Peroxidase = Peroxidase de Armorácia). Devido à ação da HRP, o substrato de o- dianisidina produz uma precipitação no local de hibridização. 3. COMPONENTES E CONSERVAÇÃO DO KIT CLART SeptiBac + Kit contém reagentes suficientes para a extração e análise de ADN de 48 amostras clínicas. Estes reagentes estão acondicionados em duas caixas distintas, dependendo da temperatura a que devem ser conservados. Todos os reagentes fornecidos são estáveis nas condições adequadas até ao prazo de validade indicado Tubos de amplificação Os tubos de amplificação contêm 45 µl de mistura de reação. Estão prontos a serem utilizados e devem ser conservados a -20ºC. Só o número necessário de tubos deve ser descongelado sobre gelo quando forem precisos, enquanto os restantes devem ser mantidos a 20ºC. No kit, estão incluídos dois tubos de amplificação diferentes: - Mix 1: Tubo branco. Amplificação de Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus haemolyticus, Streptococcus pyogenes/dysgalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus sanguinis, Streptococcus do grupo milleri (incluindo S. constellatus e S. anginosus), Streptococcus spp., Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis e Listeria monocytogenes. - Mix 2: Tubo verde. Amplificação de Clostridium perfringens, Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida spp. e deteção genérica de fungos. Nota: o kit inclui uma tira adesiva indicadora de temperatura. Se aparecer uma luz vermelha na janela de visualização da tira indicadora de temperatura, o kit não deve ser utilizado porque a temperatura de conservação pode ter sido ultrapassada Reagentes de visualização ADVERTÊNCIA: Após a receção, as micro matrizes devem ser conservadas a temperatura ambiente. Micro matrizes: Tiras de poços CS (incluindo as sondas específicas). Estas são entregues num envelope selado. Após a abertura, o envelope deve ser fechado e conservado a temperatura ambiente, protegido da luz. RE (Revelador). Conservar a 4ºC. SH (Solução de hibridização). Conservar a 4ºC. DC (Solvente do conjugado). Conservar a 4ºC. CJ (Conjugado). Conservar a 4ºC. Centrifugar ligeiramente antes de utilizar. 7

8 TL (tampão de lavagem). Conservar a 4ºC. Suporte e tampa para a tira de 8 poços Outros componentes - CAR (Clinical Array Reader): o que permite a leitura e interpretação automática até 12 CS, ou seja, um total de 96 amostras. Esta plataforma é fabricada exclusivamente para a GENOMICA, para só ser utilizada com os seus kits. Adaptador do suporte para colocar sobre a bandeja do CAR, de modo a encaixar a placa de microtitulação antes da leitura. - Software: É específico para CLART SeptiBac +, desenhado e validado por GENOMICA. Instalado e pronto a utilizar. CAR (Clinical Array Reader) Figura 3: Leitor CAR 4. MATERIAL ADICIONAL 5.1. Reagentes e material Água destilada Luvas descartáveis Deslocamento positivo ou pontas de pipeta com filtro Recipiente com gelo picado Tubos Eppendorf esterilizados (1,5 ml) Suportes para tubos de 1,5 ml Suportes para tubos de 0,5 ml/0,2 ml. 8

9 5.2. Equipamentos Microcentrífuga Termociclador Três micropipetas ajustáveis (1-20 µl, µl e µl) para utilização no laboratório de extração. Três micropipetas ajustáveis (1-20 µl, µl e µl) para utilização no laboratório de visualização. Termoblocos (a 37 C, 55 C e 100ºC) com um agitador ajustável e compatível com os tubos Eppendorf. Vórtex Sistema a vácuo 5. PROCEDIMENTOS E RECOMENDAÇÕES DE MANIPULAÇÃO Muito importante: ler cuidadosamente esta secção antes de iniciar qualquer trabalho Recomendações gerais 1. O procedimento deve ser realizado em duas áreas separadas fisicamente. Isto evitará a contaminação de amostras com os produtos anteriormente amplificados. Cada área deve ter os seus próprios materiais de trabalho identificados (pipetas, pontas, tubos, suportes, luvas, etc.) que nunca devem sair da respetiva área. Área Pré-PCR: as amostras são preparadas e o ADN é extraído. Área Pós-PCR: os produtos são amplificados e, depois, visualizados. O material desta área nunca deve entrar em contacto com o material da área pré-pcr. DEPOIS DE TRABALHAR NA ÁREA PÓS-PCR, NÃO RETORNE À ÁREA PRÉ- PCR. 2. Use sempre luvas. Recomenda-se a troca frequente de luvas, embora seja obrigatório trocá-las antes de começar a trabalhar em cada uma das áreas supramencionadas. Devem ser utilizadas luvas novas para a preparação dos tubos de amplificação e sempre que se adicionar ADN aos tubos. A pessoa que estiver a trabalhar na área pré-pcr deve utilizar soluções desinfetantes da pele para evitar uma contaminação proveniente da flora epidérmica. Além disso, as luvas devem cobrir completamente a pele depois de desinfetada, sem deixar o antebraço a descoberto. 3. Limpe as áreas de trabalho (bancadas de laboratório, coberturas, grelhas, pipetas, termociclador) cuidadosamente com desinfetante diluído a 10% após o processamento de cada lote de amostra; é obrigatório desinfetar todas as áreas de trabalho para evitar contaminações. 9

10 4. Utilize sempre pontas de pipetas com filtro ou pipetas de deslocamento positivo para evitar contaminações. 5. Utilize materiais de laboratórios esterilizados (em autoclave) e descartáveis. 6. Nunca misture reagentes de dois tubos diferentes, mesmo que pertençam ao mesmo lote. 7. Feche imediatamente os tubos dos reagentes depois da utilização, para evitar a contaminação. 8. Elimine as pontas das micropipetas depois da utilização. 9. A GENOMICA não assume qualquer responsabilidade em relação aos resultados obtidos sem seguir as instruções contidas neste manual Precauções para a extração Muitos dos microrganismos no kit CLART SeptiBac + fazem parte da flora normal da pele e do trato digestivo humano, pelo que é preciso ter grandes precauções aquando da extração. Use sempre luvas. As luvas devem cobrir completamente a pele depois de desinfetada, sem deixar o antebraço a descoberto. Calce as luvas, tendo o cuidado para os dedos só tocarem nas extremidades. Limpe as superfícies de trabalho com lixívia diluída a 10%. Ligue o fluxo laminar e a luz UV, pelo menos, 20 minutos antes da extração. A preparação das amostras antes da extração deve ser feita dentro da cabina Precauções para a visualização 1. Evite que a ponta da pipeta ou o sistema a vácuo toque no fundo do tubo onde se encontra a micro matriz. 2. Recomenda-se a adição de todas as soluções sobre a parede local da CS nunca diretamente sobre o fundo. 3. Só se deve adicionar a solução de hibridização imediatamente antes de adicionar os produtos de PCR. 4. Aquando da utilização da CS, ficará um ligeiro volume residual para evitar a secagem da matriz. 5. Após a incubação com o conjugado, é muito importante lavar cuidadosamente a CS para evitar que qualquer conjugado remanescente reaja com o revelador. 6. Evite bolhas sobre a superfície da micro matriz, quando adicionar as diferentes soluções. 7. Mantenha a base da CS limpa para evitar a possível interferência, aquando da leitura dos resultados. 10

11 8. Quando visualizar a imagem no leitor, confirme o aparecimento de marcadores de posição e que não há bolhas ou manchas a interferir na leitura. Se necessário, limpe a base do tubo com papel de celulose ou tape suavemente o tubo com o dedo. 6. AMOSTRAS: HEMOCULTURAS O kit CLART SeptiBac + foi desenhado e validado para ser utilizado em amostras de hemoculturas. A GENOMICA não se responsabiliza pelos resultados quando se utilizarem outras amostras. O protocolo começa com uma hemocultura positiva, como demonstrado no equipamento de crescimento e deteção utilizado. Para o diagnóstico, a análise e extração da hemocultura devem ser feitas depois de efetuada a coloração de Gram, que confirmará a presença ou ausência de bactérias Gram-positivas e fungos. 7. PROTOCOLO DE TRABALHO 7.1. Extração Automática de ADN 1. Preparação da amostra antes da extração (realizada fora do equipamento). Recomendado para todos os equipamentos automáticos. Misture a hemocultura, mexendo. Transfira 1 ml de hemocultura para 1 tubo Eppendorf de 1,5 ml e centrifugue durante 2 minutos a rpm. Nota: As manipulações das hemoculturas devem ser feitas na cobertura de segurança. Às vezes, é difícil visualizar o agregado e, por conseguinte, o sobrenadante deve ser retirado cuidadosamente. Centrifugue a rpm durante 5 minutos, para concentrar o agregado bacteriano. Elimine o sobrenadante e ressuspenda em 1 ml de solução salina (cloreto de sódio a 0,9%). Ressuspenda vigorosamente. Transfira 1 ml para o extrator. Às vezes, o carvão ativado e as resinas criam aglomerados. Não transfira estes aglomerados para o extrator. 2. Lise interna e extração de ADN no equipamento NucliSENS TM easymag da biomérieux: seguir o guia de utilizador do computador. O volume de eluição selecionado é 80 µl. Este volume pode variar dependendo da instrumentação do extrator automático utilizado. 3. Depois da extração, retire 80 µl do ADN eluído com a micro pipeta e introduza-os nos tubos Eppendorf de 1,5 ml. Utilize 5 µl em cada tubo de amplificação e conserve o resto a -20 C Reação de amplificação 11

12 Recomendações específicas para a amplificação: Trabalhe na área de pré-pcr, utilize sempre a cobertura e siga as recomendações descritas em 5.1. Adicione o ADN aos tubos de amplificação sempre sob cobertura. Durante o processo, mantenha os tubos separados no gelo. 1. Descongele um tubo de reação Mix 1 e Mix 2 para cada amostra e mantenha-os no gelo. Não utilize temperaturas superiores a 37ºC para descongelar. 2. Centrifugue os tubos de reação numa microcentrífuga, de modo a que todo o líquido vá para o fundo (se não houver adaptadores disponíveis para segurar nos tubos de reação, estes podem ser colocados em tubos maiores sem tampas). 3. Adicione 5 µl do ADN extraído de cada amostra aos tubos Mix 1 e Mix 2 e ressuspenda várias vezes com uma micro pipeta. Deixe os tubos no gelo. 5. Programe o termociclador da seguinte forma: 1 ciclo 95ºC 15 minutos 40 ciclos 95ºC 15 segundos 55ºC 15 segundos 68ºC 45 segundos 1 ciclo 68ºC 10 minutos 4ºC (mantido) até à recolha dos tubos (opcional) 6. Inicie o programa e coloque os tubos Mix 1 e Mix 2 no termociclador quando o bloco estiver acima dos 90ºC. Isto minimiza quaisquer amplificações não específicas devido à hibridização que ocorre abaixo da temperatura de reação. O processo de amplificação dura cerca de 4 horas, embora isto possa variar dependendo do termociclador utilizado Protocolo de Visualização para CLART Strip (CS) Recomendações específicas antes de iniciar o processo de visualização: O PROTOCOLO DESCRITO ABAIXO DEVE SER REALIZADO NA ÁREA PÓS-PCR. NUNCA LEVE O PRODUTO AMPLIFICADO PARA A ÁREA PRÉ-PCR. 1. No início do ensaio: Ligue o Leitor CAR (Clinical Arrays Reader) para permitir a autocalibração do aparelho. Introduza a identificação das amostras. É importante ter o equipamento já preparado para ler as amostras no fim do ensaio, de modo a que estas fiquem expostas a um tempo de revelação excessivo. 12

13 2. Ligue o termomisturador a uma temperatura de 59ºC, pelo menos 30 minutos antes de iniciar o processo de hibridização. 3. Conserve a SH (Solução de Hibridização) à temperatura ambiente. 4. Prepare a solução de lavagem antes de cada ensaio. Não utilize soluções anteriores ou quaisquer restos de outros ensaios. 5. Antes de iniciar o programa de desnaturação, lave o termociclador com lixívia diluída a 10%. Durante o processo de desnaturação, coloque os tubos de amplificação separados no termociclador. A desnaturação não deve ultrapassar os 10 minutos. 6. Não é necessário utilizar pontas com filtro durante o processo de visualização, exceto quando se adiciona produtos amplificados a cada poço. No entanto, deve ser utilizada uma ponta diferente para cada amostra e para cada reagente. Esta precaução também se deve aplicar ao tampão TL. 7. Os pentes de 8 pontas utilizados com as bombas de aspiração devem ser eliminados após a utilização ou descontaminados com uma solução de lixívia diluída a 10% após cada ensaio. Certifique-se de que a bomba de vácuo funciona corretamente não deixe resíduos de líquido nos poços. 8. Todos os tampões devem ser aspirados cuidadosamente dos poços sem tocar no fundo. VISUALIZAÇÃO 1. Desnaturação: utilize o termociclador para desnaturar as amostras. Regule o programa para 15 minutos, a 95º C. Coloque os produtos amplificados no termociclador e incube durante 10 minutos, a 95º C. Passados 10 minutos, retire os tubos do termociclador (ainda a 95 o C) e coloque-os imediatamente no gelo. 2. Prepare a solução TL diluída: Para 8 poços (uma tira), adicione o seguinte: 1 ml de solução TL + 9 ml de água destilada. Isto constituirá os 10 ml de solução TL necessária para uma tira. 3. Pré-lavagem da CS: Adicione 200 µl de solução TL diluída a cada matriz e ressuspenda 10 a 15 vezes com a pipeta. Elimine a solução TL diluída usando uma pipeta ou, de preferência, um sistema a vácuo. 13

14 Este passo é necessário para lavar as CSs já embaladas, antes de adicionar a amostra. A CS não deve conter resíduos da solução de lavagem. Em circunstância alguma, deve deixar-se que as CSs sequem durante um longo período. 4. Hibridização: A solução de hibridização (SH) deve ser aquecida a 59 C de modo a dissolver os sais cristalizados. Adicione 100 µl de tampão SH (evitando o aparecimento de espuma) + 5 µl de produto desnaturado do tubo Mix 1 e do tubo Mix 2 a cada poço. Misture adequadamente com a pipeta evitando tocar na matriz e incube a tira, coberta por uma tampa de plástico transparente, no termomisturador durante 30 minutos, a 59 C, com uma centrifugação de 550 rpm. Para obter resultados corretos, os produtos amplificados dos tubos Mix 1 e Mix 2 devem ser visualizados na mesma matriz. Retire as CSs e elimine a solução SH usando uma pipeta ou um sistema a vácuo. Programe o bloco de aquecimento para 30 C e deixe-o a funcionar para que possa ser utilizado mais tarde no passo 6. Pode retirar a tampa do bloco de aquecimento para o deixar arrefecer mais depressa. 5. Lavagem dupla: use pontas diferentes para cada poço em ambas as lavagens. Lave duas vezes a CS com 200 µl de solução TL diluída em cada poço, misturando 10 a 15 vezes com a pipeta. Elimine a solução TL diluída usando uma pipeta ou um sistema a vácuo, não deixando um volume remanescente. No caso do bloco de aquecimento não ter atingido uma temperatura de 30 C quando chegar a este passo, deixe as CSs cheias com solução TL diluída até o bloco de aquecimento chegar à temperatura necessária. 6. Bloqueio e conjugado: Prepare a solução CJ diluída 15 minutos antes de o tempo de hibridização acabar e mantenha-a no gelo até à sua utilização. Recomenda-se a centrifugação do tampão CJ durante 10 segundos antes da utilização. Prepare o tampão CJ diluído: Para uma tira (8 poços), adicione o seguinte: 1 ml de tampão DC 7,5 µl de tampão CJ No vórtex, agitar durante breves instantes a solução CJ diluída. Retirar o tampão TL diluído sem secar a matriz e adicione 100 µl de tampão CJ diluído para cada poço. Incube a 30 C, 550 rpm, durante 10 minutos exatamente no termomisturador. Após esta incubação, pegue na tira e remova imediatamente o tampão CJ diluído com a bomba. (Regule o termomisturador para 25 C e sem centrifug ação para o passo 8. Retire a tampa para acelerar o arrefecimento). 14

15 7. Tripla Lavagem: Adicione de imediato 200 µl de solução TL diluída por poço. Misture bem 10 a 15 vezes com a pipeta e retire o tampão TL diluído com a bomba sem deixar secar a matriz. Repita esta lavagem duas vezes e deixe a CS com 200 µl de tampão TL a RT durante 5-10 minutos ou até o termomisturador atingir os 25 C. É muito importante que o tampão CJ diluído seja completamente lavado. Qualquer resíduo de tampão pode reagir com o tampão RE produzindo um sinal não específico. 8. Relevar com tampão RE: retire o tampão TL diluído sem deixar secar a matriz e adicione 100 µl de tampão RE por poço. Incube a 25 C no termomisturador durante 5 minutos sem agitação. Atenção! É muito importante utilizar o termomisturador sem agitação neste passo. 9. Após 10 minutos, retire o tampão RE com a bomba. A matriz deve ser seca, nesta altura. 10. Leitor CAR (Clinical Array Reader): De modo a analisar as amostras, um adaptador especial deve ser colocado sobre a bandeja do CAR. Depois, coloque a placa normalmente na bandeja e o CAR procederá à análise automática das matrizes. 8. LEITURA DE RESULTADOS O processamento dos dados obtidos em cada análise é completamente automático. O equipamento de leitura/análise fornecerá um relatório com os resultados. No ecrã, aparecerá uma tabela com três colunas. A coluna da esquerda mostra o grupo microbiano propício a ser detetado, a coluna central apresentará um resultado positivo ou negativo para cada grupo microbiano e a coluna da direita mostrará se os controlos da amplificação e da extração de ADN foram realizados em conformidade. 9. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Um dos principais inconvenientes da amplificação genómica é a utilização de amostras de ADN de fraca qualidade (fragmentos de ADN demasiado curtos, degradação do ADN ou perda do ADN durante a extração) ou a presença de inibidores da polimerase do ADN (como por exemplo, a hemoglobina, resíduos de cera parafina, sais, etc.) nas amostras a analisar, interferindo assim na amplificação genómica e resultando em falsos negativos. No entanto, CLART SeptiBac + elimina os falso negativos através da utilização de controlos internos nos mesmos tubos (Mix 1 e Mix 2) em que a amostra é analisada e são amplificados ao mesmo tempo que o ADN microbiano. Um controlo de extração foi incluído nos tubos Mix 2 só para detetar os falsos negativos de extrações de ADN incorretas. 15

16 Para obter resultados corretos, a amostra tem de ser amplificada nos tubos Mix 1 e Mix 2, e os produtos amplificados devem ser visualizados na mesma matriz. Em cada conjunto de análise, deve ser incluído um controlo de extração negativo para confirmar que as amostras não foram contaminadas durante a extração, amplificação e visualização, dando assim origem a um falso positivo. Cada tubo contém as seguintes bases de amplificação: Mix 1: Duas bases que amplifiquem um plasmídeo modificado, incluído no tubo de amplificação e usado como um controlo para a amplificação da reação PCR. Oligonucleotídeos específicos do alvo, concebidos para detetar agentes patogénicos microbianos. Mix 2: Duas bases que amplifiquem um fragmento do gene humano CFTR como um controlo para a extração do AND do doente. Duas bases que amplifiquem um plasmídeo modificado, incluído no tubo de amplificação e usado como um controlo para a amplificação da reação PCR. Este plasmídeo é diferente do incluído no tubo Mix 1. Oligonucleotídeos específicos do alvo, concebidos para detetar agentes patogénicos microbianos. O tubo de reação foi concebido para favorecer a amplificação de microrganismos, comparativamente aos outros dois controlos. Entre estes dois controlos, a amplificação do ADN genómico será realizada de preferência, comparando o controlo da reação de amplificação. A razão para este design é: O controlo genómico do ADN só seria essencial para confirmar um resultado negativo, visto que confirma a presença do ADN do doente na amostra, mesmo que não tenham sido encontrados microrganismos. O controlo da PCR só seria essencial quando não se encontrar amplificação no tubo porque ajudará a distinguir entre uma PCR inibida e uma amostra onde não há ADN. Há duas possibilidades que podem levar a um resultado não válido: extração não válida: A amplificação do alvo microbiano e/ou a amplificação da extração e controlos de amplificação podem ser prejudicadas devido à presença de inibidores de amplificação ou devido a um erro mecânico durante a extração. O processo terá de ser repetido na totalidade. 16

17 Amplificação não válida: A presença microbiana num tubo e a ausência de amplificação no outro indica um procedimento de extração válido, mas indica a presença de um problema durante a amplificação. A amplificação com ambos os tubos tem de ser repetida. Há três possibilidades que podem levar a um resultado inconclusivo: Nos casos em que as réplicas de uma sonda da matriz sejam muito diferentes umas das outras. Nas co-infeções com mais de 3 bactérias para Mix 1 e mais de 2 microrganismos para Mix 2. Quando a intensidade do sinal da absorção não normalizada se encontra no limite de deteção da técnica, cuja amplitude é determinada pelo software para cada tipo de microrganismo. 10. ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS E DE FUNCIONAMENTO Conhecidas fontes de interferência Certas substâncias podem interferir com o kit CLART Septibac +. São principalmente substâncias que inibem a mistura enzimática e, por conseguinte, inibem a reação de amplificação. Os fatores mais comuns são os seguintes: Utilização de amostra inadequadas. A análise de qualquer tipo de amostras clínicas diferentes das especificadas no manual do kit CLART Septibac +, assim como a recolha incorreta de amostras, pode originar um resultado de análise inconclusivo ou inválido, devido à falta de amplificação, em consequência da falta de amostra ou de reação inibida. A conservação inadequada de amostras pode influenciar o resultado da análise. Se as amostras estão sujeitas a condições que podem resultar na degradação do ADN, o resultado da análise pode levar a um falso negativo. A presença da hemoglobina, carvão ativo ou resinas após a extração do ADN pode levar a inibições da PCR Especificações técnicas: Parâmetros analíticos: Sensibilidade analítica. A sensibilidade analítica dos microrganismos apresentados na Tabela 1 foi determinada através da amplificação de uma série de diluições de ADN de plasmídeos recombinantes. Cada um deles contém o produto amplificado inserido (incluindo a parte complementar da sonda específica de deteção). O passo de visualização foi realizado em CLART Strips, obtendo os mesmos resultados agora sumarizados nesta tabela. 17

18 MICRORGANISMO Streptococcus pyogenes Streptococcus sanguinis Staphylococcus aureus Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus hominis Candida albicans Candida krusei Clostridium perfringens Enterococcus faecium Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes Streptococcus pneumoniae Streptococcus anginosus Streptococcus mitis Staphylococcus epidermidis Enterococcus faecalis meca Candida glabrata Candida spp. Fungos Nº de cópias do plasmídeo recombinante para a reação PCR Tabela 1. Número de cópias de plasmídeo recombinante necessário para obter 100% de sensibilidade na deteção de cada um dos microrganismos. Especificidade analítica. A especificidade analítica foi 100%. O kit CLART SeptiBac + não deteta quaisquer outros agentes patogénicos que possam ser encontrados em amostras sanguíneas. Parâmetros de diagnóstico Para determinar os parâmetros diagnósticos do kit CLART SeptiBac +, foram realizados estudos comparativos com a caracterização da hemocultura. Estas comparações foram feitas em colaboração com dois hospitais espanhóis e um hospital português. Serviço de Microbiologia do Hospital Universitário Germans Trías i Pujol, Badalona, Barcelona. Serviço de Microbiologia do Hospital Universitário Ramon y Cajal, Madrid. Serviço de Patologia e Medicina Laboratorial do Hospital Egas Moniz, Lisboa, Portugal. 18

19 Foi processado um total de 596 amostras de hemoculturas. A seguinte tabela ilustra os dados de sensibilidade diagnóstica e especificidade para as espécies microbianas detetadas no kit CLART SeptiBac +. Os resultados de CLART SeptiBac + foram comparados com os resultados da técnica de referência (hemocultura + caracterização). Em caso de discrepâncias, os resultados da sequenciação foram considerados como resultados válidos. Nesses casos específicos, onde esta informação não estava disponível, as discrepâncias foram avaliadas por uma Nested-PCR e posterior sequenciação do ADN. MICRORGANISMO Sensibilidade Especificidade PPV NPV Staphylococcus aureus 97,9 100,0 100,0 99,6 Staphylococcus epidermidis 98,0 100,0 100,0 99,3 Staphylococcus hominis 92,0 100,0 100,0 99,3 Staphylococcus haemolyticus 100,0 100,0 100,0 100,0 meca (resistência à meticilina) 100,0 100,0 100,0 100,0 Streptococcus pneumoniae 100,0 100,0 100,0 100,0 Streptococcus pyogenes/dysgalactiae 100,0 100,0 100,0 100,0 Streptococcus agalactiae 92,9 100,0 100,0 99,8 Streptococcus mitis 84,2 100,0 100,0 99,5 Streptococcus sanguinis/parasanguinis 100,0 100,0 100,0 100,0 Streptococcus do grupo milleri (S. constellatus, S. anginosus) 100,0 100,0 100,0 100,0 Streptococcus spp. 96,0 100,0 100,0 98,4 Enterococcus faecium 94,4 100,0 100,0 99,6 Listeria monocytogenes 100,0 100,0 100,0 100,0 Enterococcus faecalis 100,0 100,0 100,0 100,0 Clostridium perfringens 100,0 100,0 100,0 100,0 Candida albicans 93,3 100,0 100,0 99,8 Candida glabrata 100,0 100,0 100,0 100,0 Candida krusei 100,0 100,0 100,0 100,0 Candida spp. 96,7 100,0 100,0 99,8 Fungos 89,2 99,8 97,1 99,3 Cocos Gram-positivos (GPCs) 97,7 100,0 100,0 84,2 Tabela 2. Sensibilidade e especificidade diagnóstica de CLART SeptiBac + para cada microrganismo. PPV: valor previsto positivo. NPV: valor previsto negativo. Especificidade diagnóstica A técnica também foi validada com hemoculturas negativas e com a presença de outros organismos, cuja deteção não esteja abrangida pelo kit (como por exemplo, bactérias Gram-negativas) e os resultados não revelaram reatividade cruzada. Reprodutibilidade e repetibilidade diagnóstica Os dados obtidos são os seguintes: Reprodutibilidade: 95,4% (n= 44 amostras) Repetibilidade: 96,9% (n= 44 amostras) As amostras foram processadas desde o passo da extração. 19