Avaliação do swab conjuntival para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral em inquéritos caninos rotineiros. Rodrigo Souza Leite

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1 Avaliação do swab conjuntival para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral em inquéritos caninos rotineiros Rodrigo Souza Leite Tese apresentada como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Doutor em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais 2015

2 Comissão Nacional de Energia Nuclear CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais AVALIAÇÃO DO SWAB CONJUNTIVAL PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM INQUÉRITOS CANINOS ROTINEIROS Rodrigo Souza Leite Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, como requisito parcial à obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Ciência e Tecnologia das Radiações Orientador: Prof. Dr. Antero Silva Ribeiro de Andrade Belo Horizonte 2015

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4 4 DEDICATÓRIA A todos os que lutam para que os benefícios da ciência sejam de todos e para todos.

5 5 AGRADECIMENTOS A Deus pela vida; Aos meus pais pela dedicação e esforço na minha criação. Às minhas irmãs: Juliana, Adriana e Mariana. À Minha sobrinha, Maria Eduarda. A Washington, companheiro e amigo de todas as horas. Ao Centro de Desenvolvimento da Energia Nuclear pela oportunidade de concluir mais esta etapa da minha formação profissional. Ao meu orientador Dr. Antero Silva Ribeiro de Andrade pela orientação e condução desta tese. Aos professores do Programa de Pós-Graduação do CDTN, pelo ensino e dedicação na minha formação. A Amanda Duarte, médica veterinária e amiga, pela ajuda no trabalho de campo e pela brilhante atuação na avaliação clínica dos cães. A Aline Leandra, companheira e amiga, pela ajuda incalculável nos trabalhos de campo e laboratório. A Natália Souza, nossa aluna de iniciação científica, pela ajuda e dedicação ao nosso trabalho. A Camila Lacerda, amiga e companheira desde o mestrado. Cristiane Corrêa, pela amizade e pelas ajudas nos momentos estratégicos. Aos demais colegas do Laboratório de Radiobiologia do CDTN. À Fundação Ezequiel Dias pelo incentivo e apoio. Aos meus colegas de trabalho Marcelo, Maria Helena, Raquel e Silvia. À Secretaria de Saúde de Belo Horizonte pela colaboração neste trabalho. Aos colaboradores da Secretaria de Saúde de Belo Horizonte pelo incansável apoio na realização dos trabalhos de campo.

6 6 Na vida, não existe nada a temer, mas a entender. Marie Curie As coisas encobertas pertencem ao Senhor, o nosso Deus, mas as reveladas pertencem a nós e aos nossos filhos para sempre [...] Deuteronômio 29:29

7 7 AVALIAÇÃO DO SWAB CONJUNTIVAL PARA O DIAGNÓSTICO MOLECULAR DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM INQUÉRITOS CANINOS ROTINEIROS RESUMO O diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) é uma etapa importante do programa de controle da leishmaniose visceral no Brasil uma vez que o cão é o principal reservatório de Leishmania (Leishmania) infantum, agente etiológico da doença. O objetivo deste estudo foi avaliar o swab conjuntival (SC) como uma ferramenta de triagem em massa para o diagnóstico molecular da LVC em uma área endêmica classificada como prioritária para as ações de vigilância do Ministério da Saúde. Um total de cães domiciliados foi envolvido neste estudo. Os animais foram avaliados por testes sorológicos (ELISA como triagem e IFI para confirmação) e moleculares. A PCR em tempo real, tendo como alvo os minicírculos do kdna, foi o principal teste molecular utilizado para análise das amostras de SC. Dos cães triados 369 (27,3%) foram positivos no SC-PCR em tempo real e 126 (9,3%) obtiveram resultado positivo por ELISA. Trinta e um por cento (39/126) dos cães positivos no teste de ELISA foram confirmados pelo IFI, enquanto que comparativamente 83,3% (105/126) obtiveram resultados positivos no método SC-PCR em tempo real. Entre os cães avaliados, um subgrupo de 484 animais foi adicionalmente submetido à avaliação clínica e diagnóstico molecular através do SC associado ao ITS-1 nested PCR. Neste subgrupo o número de animais positivos por SC-PCR em tempo real foi 156/484 (32,2%), por SC-ITS-1 nested PCR 44/484 (9,0%) e por ELISA 52/484 (10,7%). SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar infecção em cães, independentemente do grau de sintomatologia (p> 0,05), enquanto ELISA foi mais sensível no grupo de cães que apresentavam três ou mais sinais clínicos relacionados à LVC (SII). Cães infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis e L. (L.) amazonensis foram também identificados neste estudo através de RFLP (Restriction Fragment

8 8 Lenght Polymorphism) dos amplicons obtidos por ITS-1 nested PCR. Os resultados do presente estudo demonstraram que o SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar um maior número de cães infectados que o ELISA e que a prevalência de infecções caninas tem sido subestimada pelos testes sorológicos. A utilização de métodos diagnósticos altamente sensíveis como SC-PCR em tempo real, principalmente em áreas endêmicas, poderia dar uma contribuição significativa para o controle da enfermidade. Palavras-chave: Leishmaniose Visceral. Cão. Diagnóstico. PCR. PCR em tempo real. Swab Conjuntival.

9 9 EVALUATION OF CONJUNCTIVAL SWAB AS MASS-SCREENING TOLL FOR MOLECULAR DIAGNOSIS OF CANINE VISCERAL LEISHMANIASIS ABSTRACT The canine visceral leishmaniasis (CVL) diagnosis is an important step of visceral leishmaniais control program in Brazil once the dog is the main animal reservoir host of Leishmania (Leishmania) infantum, the etiologic agent of the disease. The aim of this study was to evaluate conjunctival swab (CS) as a mass-screening tool for CVL molecular diagnosis in an endemic area classified as priority for the Brazilian Ministry of Healthy for surveillance action. A total of 1,350 domiciled dogs were screened. The animals were evaluated by the serological tests (ELISA as screening and IFI for confirmation) and by CS associated to realtime PCR using kdna minicircles as targets. Of the 1,350 dogs screened 369 (27.3%) were positive by CS real-time PCR and 126 (9.3%) tested positive by ELISA. Thirty one percent (39/126) of the ELISA positive dogs were confirmed by IFI, while 83.3% (105/126) tested positive in the CS real-time PCR assay. Among the dogs screened, a sub-group of 484 animals were also submitted to clinical evaluation and molecular diagnosis using CS associate to ITS-1 nested PCR. In this sub-group the number of animais positive by CS real-time PCR was 156/484 (32.2%), by CS ITS-1 nested PCR 44/484 (9.0%) and by ELISA 52/484 (10.7%). The CS real-time PCR was able to detect infection in dogs independently of the symptomatology degree (p > 0.05), while ELISA was more sensitive in the group of dogs that present three or more clinical signs related to CVL (SII). Dogs infected by L. (Viannia) braziliensis and L. (L.) amazonensis were also found in this study by means of RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) analysis of ITS-1 nested PCR amplicons. The results of present study demonstrated that CS real-time PCR was able to detected a higher number of infected dogs than ELISA and that the prevalence of canine infections has been

10 10 underestimated by the serological assays. The use of sensitive molecular diagnostic methods like CS real-time PCR, mainly in endemic areas, could greatly contribute to disease control. Keywords: Visceral Lleishmaniasis. Dog. Diagnosis. PCR. Real-time PCR. Conjunctival Swab.

11 11 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Sinais Clínicos da Leishmaniose Figura 2 - Distribuição mundial da Leishmaniose Visceral (LV) Figura 3 - Áreas com transmissão de LV no Brasil. Mapa de estratificação de LV segundo o município de residência e média de casos de 2009 a 2011 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012) Figura 4 - Sinais clínicos aparentes associados à LVC em cães infectados com L. infantum.. 34 Figura 5 - Mapa da cidade de Belo Horizonte com seus distritos sanitários e as correspondentes áreas de abrangência de seus centros de saúde. Destaque para o Distrito Sanitário Norte Figura 6 - Mapa da cidade de Belo Horizonte com suas regionais. Destaque para a Regional Norte com suas áreas de assentamentos Figura 7 Imagens representativas do trabalho de coleta de amostras dos animais durante o inquérito canino censitário anual Figura 8 - Análise por PCR em tempo real de amostras de swab conjuntival pelo método SYBR Green Figura 9 - Análise por ITS-1 npcr de amostras de swab conjuntival Figura 10 Análise por RFLP de amostras de cães positivos no ITS-1 npcr e negativos no PCR em tempo real Figura 11 - Gráfico com a frequência relativa de cães positivos nos métodos de diagnóstico ELISA e SC-PCR em tempo real... 96

12 12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Comparação dos resultados obtidos nos testes ELISA e SC-PCR em tempo real nos cães avaliados para LVC Tabela 2 - Comparação entre os resultados obtidos na IFI e no SC-PCR em tempo real em cães avaliados para LVC Tabela 3 Classificação clínica dos cães positivos nos testes de ELISA, IFI, PCR em tempo rela e ITS-1 npcr Tabela 4 - Distribuição dos sinais clínicos observados em relação ao método diagnóstico avaliado Tabela 5 Comparação entre ELISA e ITS-1 npcr com SC-PCR em tempo real no subgrupo dos cães submetidos à avaliação para LVC... 93

13 13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS DNA Desoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico) dntp Desoxirribonucleotídeos trifosfato dttp Desoxitimina tri-fosfato EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid (Ácido etilenodiaminotetracético) ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay gp63 Glicoproteína de 63 KDa gp70 Glicoproteína de 70 KDa HIV Human Immunodeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana) hsp70 70 KDa Heat shock protein (Proteína de Choque Térmico de 70 KDa) IFI Reação de Imunofluorescência Indireta Ig Imunoglobulina ITS-1 Internal transcribed spacer 1 (região espaçadora interna transcritível 1) kdna DNA de cinetoplasto LC Leishmaniose cutânea LV Leishmaniose visceral LVC Leishmaniose visceral canina npcr Nested PCR pb Pares de base PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism RNA ácido ribonucleico SC Swab conjuntival SC-ITS-1 npcr Swab Conjuntival associado a ITS-1 nested PCR SC-PCR Swab Conjuntival associado a PCR TBE Tris Borato EDTA

14 14 LISTA DE SÍMBOLOS m/v min ml mm ng nm massa/volume Minutos Mililitros Milimolar Nanograma Nanômetro ºC Graus Celsius pg ph pmol RCF rpm s V v/v μg μl Picograma Potencial Hidrogeniônico Picomol Força Centrífuga Relativa Rotações por minuto Segundos Volt Volume /volume Micrograma Microlitros

15 15 ÍNDICE AGRADECIMENTOS... 5 RESUMO... 7 ABSTRACT... 9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS EM HUMANOS EPIDEMIOLOGIA A LEISHMANIOSE VISCERAL NO BRASIL RESERVATÓRIOS DA LEISHMANIOSE VISCERAL E O PAPEL DO CÃO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA DIAGNÓSTICO CLÍNICO DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) TESTE IMUNOENZIMÁTICO DE ELISA (ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY) TESTES RÁPIDOS DIAGNÓSTICO MOLECULAR SWAB CONJUNTIVAL JUSTIFICATIVA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 67

16 16 5 METODOLOGIA ÉTICA NA EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL AVALIAÇÃO CLÍNICA COLETA DE AMOSTRAS Swab conjuntival Sangue DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Exame sorológico Diagnóstico molecular A) EXTRAÇÃO DE DNA B) REAÇÃO DA CADEIA DE POLIMERASE (PCR) C) ITS-1 NESTED PCR (INTERNAL TRANSCRIBED SPACER 1 NESTED PCR) D) RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) E) ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE F) PCR EM TEMPO REAL G) AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE DAS AMOSTRAS DE DNA ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA APÊNDICE A FICHA DE CAMPO

17 17 ANEXO A CERTIFICADO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL DA UFMG ANEXO B PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ENVOLVENDO SERES HUMANOS DA SECRETARIA DE SAÚDE DE BELO HORIZONTE

18 18 1 INTRODUÇÃO

19 19 Este trabalho investiga o swab conjuntival (SC) como um método de amostragem para o diagnóstico da leishmaniose visceral (LV) canina por Reação da Cadeia da Polimerase (PCR) em inquérito canino censitário rotineiro na cidade de Belo Horizonte, uma importante área endêmica para LV. Para isto foram avaliados 1350 cães domiciliados. Primeiramente, as amostras de SC foram analisadas por PCR em tempo real e os resultados comparados com o diagnóstico sorológico realizado pelo Laboratório do Centro de Zoonoses de Belo Horizonte (LABZOO). Um subgrupo de 484 animais, selecionados dentre os 1350, foi avaliado clinicamente por uma médica veterinária. As amostras de SC neste subgrupo foram adicionalmente avaliadas por um segundo método molecular: o ITS-1 nested PCR. Os iniciadores utilizados na PCR em tempo real são específicos para Leishmania (Leishmania) infantum, enquanto que os iniciadores do método ITS-1 nested PCR são específicos para o gênero Leishmania. Devido a maior sensibilidade verificada para PCR em tempo real foi inesperado que cinco animais apresentassem resultado negativo para este método e positivo para o método ITS-1 npcr. A análise por RFLP foi conduzida para identificar as espécies de Leishmania que infectavam estes cinco animais. Todos os resultados foram avaliados estatisticamente e comparados. Vale ressaltar que este estudo é inédito visto que a metodologia do SC nunca havia sido antes testada em um estudo de triagem em larga escala de cães com diagnóstico desconhecido em uma área endêmica de alta transmissão. Este estudo visa contribuir para validação de uma ferramenta de diagnóstico que possa ser útil e relevante no controle da leishmaniose visceral.

20 20 2 REFERENCIAL TEÓRICO

21 21 A leishmaniose é uma doença parasitária de caráter zoonótico e representa hoje um grande problema de saúde pública mundial. Seus aspectos epidemiológicos são complexos, dada a grande variedade de fatores envolvidos. Exemplos destes fatores são: a diversidade de hospedeiros, as diferentes espécies do agente etiológico e a dinâmica dos processos ecológicos e sociais que determinam a distribuição geográfica dessa enfermidade. Em relação ao agente etiológico, são conhecidas cerca de 30 espécies heteroxênicas pertencentes ao gênero Leishmania sendo que pelo menos 22 espécies são causadoras de leishmaniose em humanos e animais. Em mamíferos, as Leishmania são parasitos intracelulares obrigatórios que sobrevivem dentro de fagolisossomas de células fagocitárias mononucleares. Estes parasitos produzem um largo espectro de doenças, que dependem tanto das espécies infectantes quanto do status imunológico do hospedeiro, além de outros fatores. A doença apresenta alta morbidade nos casos de leishmaniose tegumentar e alta mortalidade na leishmaniose visceral (OMS, 2014). O modo mais importante de sua transmissão se dá através da picada de insetos fêmeas da ordem Díptera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, conhecidos como flebotomíneos. No Velho Mundo, as espécies transmissoras do parasito se incluem no gênero Phlebotomus, enquanto que, no Novo Mundo, predomina o gênero Lutzomyia (OMS, 2014) (GRIMALDI et al., 1993) (DESJEUX, 1996). As espécies Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi estão diretamente relacionados com a transmissão da doença no Brasil. A primeira é considerada a principal transmissora de L. infantum no Brasil. A segunda espécie foi posteriormente apontada como vetor nos estados do Mato Grosso e Mato Grosso do Sul (BRITO, et al., 2014), (BRITO et al., 2014) e (ALMEIDA et al., 2010).

22 Manifestações clínicas em humanos As leishmanioses são um conjunto de doenças polimórficas para os humanos apresentando diferentes manifestações clínicas (Figura 1). As principais formas da doença são: Leishmaniose tegumentar: Existem três formas principais que dependem da espécie do agente etiológico e da resposta imune do hospedeiro: Leishmaniose cutânea (LC): Nesta forma, uma lesão bem delimitada, ulcerada ou não, se desenvolve no local da picada do inseto vetor com lesões de pele que geralmente aparecem na parte exposta do corpo, como o rosto, braços e pernas. A doença pode evoluir para cura espontaneamente, deixando cicatriz, ou persistir por longo tempo. Em algumas situações, a lesão pode se difundir especialmente nos pacientes imunodeprimidos. Leishmaniose mucocutânea (LMC): Essa manifestação caracteriza-se por progressão lenta e crônica. Implica em metástases da lesão primária, que podem atingir as mucosas nasobucal e faringiana, causando destruição extensiva e desfigurante de tecidos moles e cartilagens, o que pode incapacitar o indivíduo para o trabalho e o convívio social. Essa forma da doença é de difícil tratamento. Leishmaniose Cutânea Difusa (LCD): apresenta múltiplos nódulos não ulcerativos. É uma forma rara da doença, porém com complicação mais graves que ocorre quando o sistema imune não consegue reagir eficazmente à infecção. Leishmaniose visceral (LV): Chamada também de Calazar é considerada uma doença crônica e sistêmica. Nesta modalidade, os parasitos demonstram tropismo pelas células do sistema fagocitário mononuclear do fígado, baço, medula óssea e tecidos linfoides. Os sintomas clássicos que podem ocorrer nos indivíduos afetados são acessos febris irregulares, palidez cutâneo-mucosa, hepatoesplenomegalia, perda de peso e anemia. A LV é considerada a forma mais grave da doença, nos casos não tratados pode levar à morte em 95 a 100% dos casos em dois anos.

23 23 Leishmaniose dérmica pós Calazar (LDPC): é uma complicação da LV em áreas onde a Leishmania (Leishmania) donovani é endêmica. A LDPC é caracterizada por uma hipopigmentação macular, maculopapular e erupção cutânea nodular geralmente em pacientes que tenham se curado da LV. É comum aparecer seis meses a um ano ou mais após a cura aparente da LV, mas pode ocorrer mais cedo ou até mesmo simultaneamente com a LV, especialmente no Sudão. A LDPC cicatriza espontaneamente na maioria dos casos na África, mas raramente em pacientes na Índia. Considera-se que esta forma tenha um papel importante na manutenção da doença e contribua para a sua transmissão, particularmente em períodos interendêmicos de LV, pois o portador atua como um reservatório para a doença. Todas as formas da enfermidade podem começar com uma pequena lesão cutânea, mas o subsequente desenvolvimento e prognóstico são determinados, em grande parte, pela espécie de Leishmania envolvida (OMS, 2014) e (OMS, 2013).

24 24 Figura 1 - Sinais Clínicos da Leishmaniose a) Leishmaniose cutânea; b) Leishmaniose mucocutânea; c) Leishmaniose visceral; d) Leishmaniose dérmica pós-calazar (CHAPPUIS et al., 2007)

25 Epidemiologia Em termos globais, as leishmanioses são a terceira moléstia mais importante dentre as veiculadas por vetores, ficando aquém apenas da malária e da filariose linfática. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a leishmaniose afeta principalmente as populações pobres na África, Ásia e América Latina, sendo associada à má nutrição, processos migratórios, habitação precária e baixa imunidade. Dados recentes mostram que 98 países e territórios, em seis continentes, são endêmicos para leishmaniose (Figura 2). Estima-se que aproximadamente 200 a 400 mil novos casos de LV e 700 mil a 1,2 milhões de novos casos LC ocorrem a cada ano em todo mundo. Mais de 90% dos casos mundiais de LV ocorrem em seis países: Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Sudão do Sul e Sudão. Já a LC é mais amplamente distribuída, com um terço dos casos ocorrendo nas Américas, Bacia Mediterrânea e Ásia Ocidental, do Oriente Médio a Ásia Central. Os 10 países com maior número de casos estimados são: Argélia, Brasil, Colômbia, Costa Rica, Etiópia, Irã, Peru, Sudão e Síria juntos correspondem de 70 a 75% da incidência mundial estimada de LC (OMS, 2014), (OMS, 2013) e (ALVAR et al., 2012). A LV pode ser provocada por duas espécies. No Sudão, Kênia, Nepal, Bangladesh, China Oriental, Paquistão e Índia, predomina a L. donovani e nessas regiões a doença tem caráter antroponótico. No sudeste asiático, nordeste da China, norte da África, Europa mediterrânea e Américas prevalece a L. infantum. Neste caso, a LV assume um perfil zoonótico (KUHLS et al., 2011) e (TAVARES et al., 2003). Dada a ampla abrangência e o significativo aumento de casos da doença, o Programa Especial de Pesquisas e Treinamento em Doenças Tropicais (TDR), vinculado à OMS, considera as leishmanioses uma prioridade em suas pesquisas dentre as 10 principais endemias tropicais do mundo (OMS, 2014).

26 26 Figura 2 - Distribuição mundial da Leishmaniose Visceral (LV) A maioria dos casos ocorre em apenas seis países - Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e Sudão (OMS, 2013)

27 A leishmaniose visceral no Brasil O Brasil detém a maior parte de casos registrados de LV na América Latina (MILES et al., 1999), sendo o comportamento epidemiológico da enfermidade cíclico, com elevação do número de casos em intervalos médios de 5 anos (ELKHOURY, 2005). A LV demonstra ampla distribuição atingindo todas as cinco regiões brasileiras (Figura 3). Por isso, a doença possui aspectos geográficos e sociais bem diferenciados e complexos. Das 27 unidades federativas do país, 21 possuem casos autóctones registrados. A região Nordeste concentrou mais de 90% dos casos humanos na década de 1990 e atualmente responde por 47,1% do total de casos no país, seguida pela região Norte (18%), Sudeste (17,8%), Centro-Oeste (8,6%) e Sul (0,1%) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012). Em 1913 foi descrito o primeiro caso em necropsia de paciente oriundo de Boa Esperança, Mato Grosso. Em 1934, 41 casos foram identificados em lâminas de viscerotomia praticadas post-mortem, em indivíduos oriundos das Regiões Norte e Nordeste, com suspeita de febre amarela. A doença, desde então, vem sendo descrita em vários municípios brasileiros, apresentando mudanças importantes no padrão de transmissão, inicialmente predominando em ambientes silvestres e rurais e mais recentemente em centros urbanos e periurbanos. Em média, cerca de casos são registrados anualmente e o coeficiente de incidência é de 2,0 casos/ habitantes. Nos últimos anos, a letalidade vem aumentando gradativamente, passando de 3,1% em 2000 para 7,1% em 2012 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012). A enfermidade vem se urbanizando cada vez mais. Isto se deve a diversos fatores como a globalização econômica, a concentração de riquezas, êxodo rural proveniente de regiões mais pobres, desmatamentos, alta densidade populacional e a grande susceptibilidade da população humana à infecção pelo parasito. Em 1950, menos de um terço da população mundial vivia nas cidades. Hoje, mais de 50% desta está nas grandes metrópoles, e é estimado que mais de 5 bilhões de pessoas estejam nas regiões urbanas em menos de 40 anos

28 28 (DAULAIRE, 1999). Na América do Sul, mais de 70% da população é urbana. Isto tende a levar endemias rurais para áreas metropolitanas onde a concentração humana e a presença de vetores aumentam a incidência de doenças. Ao mesmo tempo, houve grande proliferação de subúrbios pobres onde os cães vadios são numerosos e as condições sanitárias e nutricionais são precárias. As restrições alimentares graves associadas à presença de indivíduos imunossuprimidos, como os portadores do vírus HIV, expõem uma parcela significativa de pessoas extremamente vulneráveis ao avanço da leishmaniose (DESJEUX et al., 2003), (DESJEUX, 2004), (ALVAR et al., 2012). Um relatório da OMS (OMS, 2010) indicava que indivíduos com AIDS tornaram-se um grupo de maior risco para a LV no sudeste europeu, e que a co-infecção era esperada como um problema crescente em áreas onde HIV e LV se sobrepunham, especialmente no Brasil, África e Índia (OMS, 2014). Paralelamente, o flebótomo acabou por encontrar no ambiente urbano um habitat favorável à sua reprodução. Como resultado, Lutzomyia longipalpis, por exemplo, tornou-se muito numeroso nessas regiões, o que tem aumentado o número de casos da doença. Todo esse panorama se deve a mudanças comportamentais de caráter socioambiental, as quais têm provocado impactos sem precedentes. O aumento e a expansão da LV para áreas urbanas e periferias estão também relacionados às migrações humanas, envolvendo o transporte de cães infectados para regiões onde o inseto vetor já existia (ARIAS et al., 1996). A partir disso, criaram-se condições concretas para a transição efetiva do ciclo rural da doença para o ciclo em grandes metrópoles e regiões periféricas. A adaptação do vetor aos ambientes urbanos foi concretamente comprovada no Brasil no final da década de Nesse cenário, os flebotomíneos passaram a ser encontrados em paióis, canis e também no ambiente intradomiciliar. Desde então, muitas cidades brasileiras como Fortaleza (CE), Aracaju (SE), Santarém (PA), Corumbá (MS), Palmas (TO), Araçatuba (SP), Teresina (PI), Natal (RN), São Luís (MA), Campo Grande (MS), Montes Claros e Belo

29 29 Horizonte (MG) vêm apresentando, de maneira preocupante, mais casos autóctones da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012). O Ministério da Saúde classifica as áreas de transmissão com base na média de casos notificados dos últimos três anos em: esporádica (<2,4 casos), moderada (>2,4 e <4,4 casos) e intensa (>4,4 casos). Belo Horizonte, com base na média de casos humanos de leishmaniose no período de 2008 a 2010, foi classificada como um dos municípios prioritários para ações de vigilância e controle. As ações recomendadas são: diagnóstico oportuno e tratamento adequado dos casos humanos; vigilância e monitoramento canino, com eutanásia de cães sororreativos; vigilância entomológica; manejo ambiental e controle químico (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012).

30 30. Figura 3 - Áreas com transmissão de LV no Brasil. Mapa de estratificação de LV segundo o município de residência e média de casos de 2009 a 2011 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2012)

31 31 O estabelecimento de uma doença parasitária em uma determinada região depende fundamentalmente da presença de hospedeiros e vetores igualmente susceptíveis. No passado, a leishmaniose possuía um caráter essencialmente silvestre, uma vez que o vetor vive naturalmente em regiões de matas e florestas. No entanto, a colonização humana abrupta, descontrolada e intensa reduziu drasticamente o hábitat natural dos flebotomíneos bem como a disponibilidade de seus hospedeiros naturais. Tais fatores somados a uma adaptação bem sucedida dos insetos vetores ao ambiente peridomiciliar permitiram que ele passasse a infectar, via repasto sanguíneo, o cão e o homem. Isto fez com que a leishmaniose adquirisse um caráter tipicamente rural. Desde 1993, Belo Horizonte vem sofrendo com o acréscimo de casos humanos e caninos da LV. Sabe-se hoje que a doença foi introduzida nessa capital a partir de um município vizinho, Sabará (GONTIJO et al., 2004). De fato, na região metropolitana de Belo Horizonte, houve um aumento no número de municípios com notificação da doença de 6 no biênio 94/95 para 15 no biênio 98/99 (LUZ et al., 2001) e (SILVA et al., 2001). De acordo com dados da Secretaria de Vigilância em Saúde, Belo Horizonte é hoje o terceiro município brasileiro mais afetado pela LV, ficando atrás somente de Fortaleza e Campo Grande (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). 2.4 Reservatórios da leishmaniose visceral e o papel do cão A L. infantum possui como reservatórios silvestres algumas espécies de canídeos e marsupiais. Estes animais possuem hábitos sinantrópicos e isto provavelmente está relacionado à ligação entre os ciclos silvestre e doméstico da doença. Entretanto, mais estudos são necessários para elucidar o real papel desses animais no ciclo de transmissão da LV. No ambiente domiciliar, o cão é o principal hospedeiro de L. infantum (SANTOS et al., 1998). O conceito de que cães são o principal reservatório doméstico de L. infantum em áreas urbanas é sustentada por fatos que incluem: casos de LVC foram relatados em 50 dos 88

32 32 países endêmicos para LV (ALVAR et al., 2004); casos caninos da doença precedem a ocorrência de casos humanos ( BEVILACQUA et al., 2001); alta prevalência em cães e alta taxa de parasitos na pele destes animais (DEANE et al., 1955), (DYE, 1996), (MOLINA et al., 1994) e (GRAMICCIA et al., 2005). Em relação aos diversos hospedeiros da L. infantum, o cão assume um papel central na manutenção do ciclo da enfermidade dada a grande susceptibilidade desse animal e a sua proximidade com o homem. Nas regiões brasileiras endêmicas da doença, os cães são muito expostos aos flebótomos, pois frequentemente dormem ao relento e próximos às aves domesticadas, que são refratárias à moléstia, mas atraem fortemente os insetos vetores (NEVES, 2009). Em geral a doença no cão é crônica e sistêmica. Porém, a forma aguda e grave pode ocorrer levando o animal à morte em poucas semanas. Após a infecção da pele em cães susceptíveis, há a disseminação do parasito para vários órgãos e posteriormente surgem os sintomas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). As manifestações clínicas clássicas (Figura 4) incluem: lesões na pele como dermatite exfoliativa e ulcerações, alopécia, perda de peso, caquexia, onicogrifose, linfadenopatia, esplenomegalia e falência renal sendo esta última uma das principais causas de óbito (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013), (ALVAR et al., 2004) e (MORENO et al., 2002). A alopecia gerada pela infecção expõe maiores áreas da pele extensamente parasitadas o que facilita ainda mais a infecção de outros flebotomíneos. A extensão dos sinais clínicos está intimamente relacionada com o tipo de resposta imunológica apresentada pelo animal infectado. Estudos com infecções experimentais em cães mostraram que o período de incubação é bastante variável, girando em torno de três meses a vários anos (ANDRADE, 2000). Então, é comum muitos animais infectados não apresentarem sintomas clínicos durante um longo tempo, o que prejudica os levantamentos epidemiológicos e o combate à doença. De acordo

33 33 com dados estatísticos, cerca de 52% dos cães infectados assintomáticos podem evoluir para cura espontânea, 12% permanecem longo tempo parasitados e sem sintomas e 36% manifestam a doença mais tarde. Tem sido amplamente relatado que o fluxo de transmissão da LV é independente da extensão dos sintomas apresentados pelo cão. Há relatos de ocorrência de transmissão do parasito de cães soropositivos assintomáticos para flebotomíneos (SOLANO-GALLEGO et al., 2001), (PALATNIK-DE-SOUZA et al., 2001) e (ALVAR et al., 2004). Assim, os cães são um reservatório competente e importante do protozoário em questão. Esta relevância foi confirmada mediante observações especialmente nas zonas urbanas com transmissão recente onde os casos caninos da doença precederam os casos humanos. Nestas regiões foi comprovada uma associação na distribuição espacial da LV em cães e no homem (DI LORENZO et al., 2002). Tendo em vista a recomendação para a eliminação de cães infectados o diagnóstico da leishmaniose canina é uma etapa fundamental no controle da enfermidade e inquéritos extensivos para a sondagem de animais contaminados têm sido preconizados. O diagnóstico deve ser feito, de preferência, de uma maneira precoce através de um método suficientemente confiável e robusto. Ainda hoje, o desenvolvimento e a padronização de uma técnica enquadrada nestes critérios e que seja rápida, barata e de simples manuseio permanecem como objetivos a serem alcançados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).

34 34 Figura 4 - Sinais clínicos aparentes associados à LVC em cães infectados com L. infantum (VERAS et al., 2014) A: alopecia, B: dermatite periocular com ceratoconjuntivite e hiperqueratose; C: hiperqueratose da mucosa nasal; D: dermatite exfoliativa generalizada não prurítica; E: lesão ulcerada na orelha; F: crosta com lesão na ponta da orelha; G: linfoadenopatia do nódulo linfático poplíteo; H: caquexia; I: onicogrifose.

35 Diagnóstico da leishmaniose visceral canina Para o diagnóstico da LVC é recomendável a associação entre os dados clínicos, laboratoriais e epidemiológicos. O diagnóstico clínico é problemático e difícil para os médicos veterinários realizarem devido à grande variabilidade de sinais clínicos que os cães infectados podem apresentar, além das semelhanças com o quadro clínico de outras doenças. Na prática clínica, a identificação de manifestações características da LVC deve ser confirmada por técnicas laboratoriais, que variam de precisão (GRIMALDI et al., 1993) e (GONTIJO et al., 2004). Há vários métodos de diagnóstico laboratorial para LVC tais como: 1) métodos parasitológicos (detecção do parasita), 2) métodos sorológicos (detecção de anticorpos anti- Leishmania), 3) métodos moleculares (amplificação de DNA do parasito). Embora haja uma grande variedade de métodos de diagnóstico para LVC, nenhum deles oferece 100% de sensibilidade e/ou especificidade (MAIA et al., 2008) e (SRIVASTAVA et al., 2011). Embora os métodos sorológicos, como o ensaio imunoenzimático (ELISA) e o teste rápido (DPP), sejam utilizados em inquéritos caninos rotineiros no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011), os métodos parasitológicos, tais como exame direto de lâminas e o isolamento de culturas de tecidos, permitem que o parasito seja detectado e poderiam ser usados como métodos de diagnóstico e de confirmação para LVC (BARROUNI-MELO et al., 2004). Nas últimas décadas, os métodos moleculares, como a reação da cadeia da polimerase (PCR), têm sido introduzidos para o diagnóstico da LVC, apresentando alta sensibilidade e especificidade (MIRÓ et al., 2008), (GRAMICCIA et al., 2005), (ALMEIDA et al., 2010) e (SOLCÀ et al., 2012). Estes métodos de detecção do material genético do parasito podem ser utilizados como métodos de confirmação em casos de animais recentemente infectados ou assintomáticos, que tendem a não ser diagnosticados sorologicamente, e na maioria dos casos, não apresentam soroconversão, por terem uma baixa carga parasitária (SOLANO-GALLEGO et al., 2011) e (SOLCÀ et al., 2012). Um estudo realizado em Belo Horizonte avaliou 1443

36 36 cães, 15,3% deles eram soropositivos, enquanto que 84,7% apresentaram sorologia negativa. Curiosamente, entre os cães negativos na sorologia, 24,4% eram PCR positivos, sendo que a maioria deles (97,6%) não seria diagnosticada por serem animais assintomáticos com sorologia negativa (COURA-VITAL et al., 2011). 2.6 Diagnóstico clínico Cães de áreas endêmicas considerados resistentes permanecem clinicamente normais e assintomáticos sem apresentar os sinais clínicos da LVC. No entanto, em animais susceptíveis, um grande número de parasitos é detectado em tecidos infectados. Nestes animais, a presença dos parasitos pode ocorrer em múltiplos órgãos, acompanhada por uma reação inflamatória granulomatosa e produção de fenômenos imuno-mediados, provavelmente responsáveis pelo aparecimento de diversos tipos de sinais clínicos (SARIDOMICHELAKIS, 2009). Os sinais clínicos da LVC são: hipertrofia dos gânglios linfáticos, mudanças nos anexos da pele, tais como onicogrifose, inchaço da pata, alopecia localizada, úlceras de pele e nasal e dermatite periocular, perda de peso também pode estar presente, assim como caquexia, anorexia e conjuntivite. Os órgãos internos, tais como o baço, o fígado, rins e gânglios linfáticos, também podem ser afetados. Lesões nos rins, quando estão presentes podem levar à morte (ALVAR et al., 2004). Febre, apatia, diarreia, epistaxe, sangramento intestinal, hepatoesplenomegalia, hiperqueratose, ceratoconjuntivite também são encontrados em animais infectados (CIARAMELLA et al., 1997) e (MENDONÇA et al., 1998). Alguns sinais clínicos são mais frequentes do que outros; lesões de pele são as manifestações mais frequentes que afetam cerca de 50 a 90% dos cães sintomáticos (SHAW et al., 2009) e (SOLANO-GALLEGO et al., 2011). (SHAW, et al., 2009). Outros sinais muito comuns são a perda de peso, observada em 25 a 80% dos casos de LVC, onicogrifose em 30 a 75% e anormalidades oculares em 16 a 24% (ALMEIDA et al., 2005).

37 37 Finalmente, sinais não específicos da LVC que são confundidos com outras doenças, como a babesiose, erliquiose e tripanossomíase canina, também contribuem para tornar o diagnóstico clínico da LVC impreciso e de difícil execução (ALVAR et al., 2004). Os sinais clínicos mais comuns de LVC estão apresentados na Figura Diagnóstico parasitológico A detecção por microscopia óptica do parasito por observação direta de esfregaços corados de aspirado de baço, linfonodo e tecidos da medula óssea apresenta alta especificidade, permitindo a confirmação do diagnóstico da LVC. No entanto, a sensibilidade deste método é inferior a 30%, uma vez que a identificação direta do parasito pode ser limitada, especialmente em cães ligeiramente assintomáticos que têm baixa carga parasitária, produzindo resultados falso negativos (GOMES et al., 2008), (BARROUIN-MELO et al., 2004), (PASSOS et al., 1996) e (REIS et al., 2006). Outro tipo de método parasitológico que pode identificar parasitos é a cultura de tecidos ou fragmentos de aspirados. Este método de diagnóstico parasitológico oferece uma elevada especificidade, permitindo o isolamento e caracterização de parasitos, assim como a determinação de quais espécies e / ou variações estão em circulação em áreas endêmicas (PALMA et al., 1991). No entanto, a cultura é teste indireto, uma vez que os parasitas são isolados a partir de vários tecidos, onde estão presentes as formas amastigotas de Leishmania. Durante o cultivo, as amastigotas transformam-se em promastigotas. Este processo pode ficar prejudicado em função da morte de parasitos devido a falhas no controle de temperatura durante o transporte da amostra ou de contaminação durante a coleta ou cultivo dos tecidos (ALVAR et al., 2004). Além disso, a cultura é demorada e pode levar até 4 semanas de observação para o diagnóstico definitivo (ALVAR et al., 2004) e (de ALMEIDA, et al., 2011). Soma-se a isso que os meios específicos para o isolamento de promastigotas não são facilmente obtidos, sendo uma técnica restrita a laboratórios especializados (SOLANO-

38 38 GALLEGO et al., 2011). Outro fator limitador é que o resultado depende da experiência do observador (MOREIRA et al., 2007) e (MAURYA et al., 2010). Em resumo, técnicas parasitológicas têm alta especificidade, mas baixa sensibilidade, especialmente para a detecção em cães recém-infectados, assintomáticos ou que apresentem baixa carga parasitária. A necessidade de pessoal qualificado e os longos prazos para obtenção dos resultados tornam os métodos parasitológicos pouco práticos para utilização em levantamentos epidemiológicos (SOLANO-GALLEGO et al., 2001), (BARROUQUIN- MELO et al., 2004), (FRAGA et al., 2012), (da SILVA et al., 2010) e (DOS-SANTOS et al., 2008). E ademais, as amostras são invasivas. 2.8 Diagnóstico sorológico Os métodos serológicos são baseados na presença de resposta imune humoral específica contra o agente, fracção purificada ou proteínas recombinantes do patógeno investigado. Estes métodos permitem a detecção de imunoglobulina (Ig), tornando-se uma ferramenta essencial para o diagnóstico da LVC. Estes métodos são simples de realizar e são frequentemente usados para determinar a prevalência da leishmaniose em estudos epidemiológicos (BADARÓ, 1988) e (ALMEIDA et al., 2005). Existe uma grande variedade de métodos sorológicos para o diagnóstico de LVC, apresentando variações de sensibilidade e especificidade. O desempenho destas técnicas de diagnóstico varia dependendo do tipo de antígeno utilizado e do sistema de detecção de anticorpo anti-leishmania. Os métodos sorológicos mais comumente utilizados, incluindo o ELISA, reação de imunoflorescência indireta (IFI) e teste de aglutinação direta (DAT), usam parasito ou extrato bruto de Leishmania, como fonte de antígeno. Mais recentemente, métodos sorológicos baseados em ELISA ou testes rápidos foram desenvolvidos utilizando uma fracção purificada

39 39 do parasito ou uma proteína recombinante purificada específica, tal como rk39 ou uma proteína quimérica como rk28. Apesar da praticidade e simplicidade dos métodos sorológicos, eles não têm 100% de sensibilidade, por isso alguns cães, especialmente aqueles que são resistentes ou que estão nas fases iniciais da doença, tem resultados negativos. Assim, os resultados desses métodos devem ser avaliados com cuidado, sempre associando os resultados do teste com a história epidemiológica, o estado clínico do animal e o resultado de um teste de diagnóstico mais específico (da SILVA et al., 2006) Imunofluorescência Indireta (IFI) A IFI é um método em que anticorpos anti-imunoglobulina marcados com fluocromos reagem com parasitos fixados em uma lâmina. A IFI é uma técnica laboriosa que apresenta dificuldades para padronização e interpretação de resultados. Além disso, a detecção da reação antígeno-anticorpo no microscópio de imunofluorescência depende da interpretação de um observador experiente e a reprodutibilidade entre diferentes laboratórios é baixa. Portanto, não é uma técnica considerada simples e prática para avaliação canina em larga escala (GONTIJO et al., 2004). Apesar destas limitações, a IFI foi utilizada por muitos anos como um método em triagens em massa de cães infectados. Este método varia no seu desempenho, com uma sensibilidade que varia de 68 a100% e especificidade de 60 a 90% (LIRA et al., 2006) e (ALVES et al., 2006). (Dados sustentam que a sensibilidade e especificidade baixas da IFI, levariam à manutenção de cães falso-negativos em áreas endêmicas e que a baixa especificidade pode levar à eutanásia de cães falso-positivos (FIGUIREDO et al., 2010) Teste imunoenzimático de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Métodos sorológicos baseados no ELISA sejam utilizando parasitos inteiros ou antígeno bruto para o diagnóstico da LVC não apresentam resultados satisfatórios por vários

40 40 motivos, tais como: reação cruzada com outras espécies de Leishmania ou com outros tripanossomatídeos como Trypanosoma cruzi e Trypanosoma caninum (FERREIRA et al., 2007) e (ALVES et al., 2012) ; há relatos da baixa reprodutibilidade de lotes de ELISA baseadas em parasitos inteiros ou antígeno bruto, uma vez que foram usados diferente isolados de Leishmania sp. e dependendo do lote da cultura, diferentes composições antigênicas podem ser detectadas (NOLAN et al., 1985). Desse modo, a procura de ensaios com maior sensibilidade e especificidade para cães tornou-se necessária para o controle da LVC, o que pode levar a uma redução de erros em medidas tomadas para o tratamento ou controle. Em países que adotam a eutanásia de cães soropositivos como medida de controle, a baixa sensibilidade de testes de diagnósticos pode levar à manutenção de cães infectados e a falta de especificidade pode resultar na eutanásia de cães saudáveis. A identificação de novas proteínas de Leishmania sp a fim de compor os testes de diagnóstico para LVC pode melhorar a sensibilidade e especificidade das técnicas de diagnóstico e permitir que os cães infectados sejam diferenciados dos não infectados (FERREIRA et al., 2007), (FARIA et al., 2011) e (OLIVEIRA et al., 2011). Outros ensaios de ELISA baseados em antígenos recombinantes, tais como ra2 de L. donovani, rk26 ou rk39 de L. infantum, têm sido desenvolvidos. Quando comparado com um teste ELISA baseado em antígeno bruto, tendo IFI como o padrão de referência (padrão ouro) e testados contra os soros de cães sintomáticos, a sensibilidade foi maior para o ELISA baseado em rk26 ou rk39 de L. infantum, respectivamente, de 94% e 100%, em comparação com 88% para o ELISA de antígeno bruto e 70% para o ELISA baseado em ra2 a partir de L. donovani (PORROZZI et al., 2007). Embora suficientemente bom para o diagnóstico de cães sintomáticos, a utilização de testes ELISA com base em antígenos recombinantes para o diagnóstico de animais assintomáticos é um objetivo ainda a ser conquistado.

41 41 Sendo assim, a maioria dos estudos utilizando ELISA sugere que, em comparação com métodos baseados no antígeno bruto, aqueles baseados em antígenos recombinantes apresentam uma melhora na precisão, aumentando a sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de cães sintomáticos. Embora melhorada, a precisão do método ainda é baixa para a detecção de animais assintomáticos (VERAS et al., 2014) Testes rápidos Recentemente, testes rápidos de imunodiagnósticos começaram a ser empregados como testes laboratoriais de rotina para a detecção de doenças tais como a leishmaniose. Os antígenos recombinantes do parasito são impregnados em membranas de nitrocelulose e as amostras de soro são aplicadas na plataforma de teste rápido. Antígenos impregnados em membranas de nitrocelulose são reconhecidos pela imunoglobulina específica presente no soro dos cães infectados. A utilização de ensaios imunocromatográficos como métodos de diagnóstico tem como principais vantagens a rapidez (completado em cerca de 15 minutos) facilidade de realização e dispensar a necessidade de equipamento para leitura dos resultados (de LIMA et al., 2010). Além disso, estes testes são facilmente armazenados, tanto o material de teste quanto as amostras não precisam ser mantidos em baixas temperaturas e pode ser executado no local de coleta. Para o diagnóstico da LVC e VL humana, entre as proteínas recombinantes testadas e disponíveis comercialmente, a mais amplamente utilizada para compor os testes imunocromatográficos é a proteína recombinante rk39 (QUINNELL et al., 2013), (GRIMALDI et al., 2012) e (LIMA et al., 2010). Estudos têm sustentado a ideia de que testes rápidos baseados em rk39 são úteis para confirmar a doença em cães com suspeita clínica. No entanto, dada a sua baixa sensibilidade para o diagnóstico de cães assintomáticos, seu uso não é recomendado para estudos epidemiológicos de grande escala ou programas de controle de LV (QUINNELL et al., 2013). A mais nova plataforma para diagnóstico sorológico pela tecnologia imunocromatográfica é a

42 42 DPP (Dual Path Platform) que foi recentemente incorporado ao programa de controle de leishmaniose visceral no Brasil. O DPP é atualmente utilizado como método de triagem no diagnóstico da LVC e o ELISA é utilizado com método confirmatório (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011). 2.9 Diagnóstico molecular Outro tipo de diagnóstico é baseado em testes moleculares os quais permitem a detecção de sequências de DNA específicas do parasito. A Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) é um importante exemplo e é um procedimento que permite a amplificação de segmentos de DNA em até 1 milhão de vezes. Existem diferentes alvos de amplificação no genoma de Leishmania que já foram descritos para diagnóstico. Esses são normalmente sequências repetitivas e/ou polimórficas. Como exemplos, tem-se os genes para o RNA ribossomal (rrna) e seus espaçadores, -tubulina, locus gp63, hsp70, cisteino proteinases e minicírculos do DNA de cinetoplasto (kdna) (REITHINGER et al., 2007) e (SINGH, 2006). Este último tem sido considerado um dos melhores alvos para PCR sendo que podem ser amplificados os minicírculos completos ou somente suas regiões conservadas (GONTIJO et al. 2004). Na era pós genômica, vem ocorrendo a identificação e a caracterização de um número cada vez maior de sequências nucleotídicas de Leishmania com potencial para novos alvos de PCR. Isto contribui para aumentar a versatilidade dessa técnica. Vários sistemas de detecção baseados na PCR foram desenvolvidos (SCHALLIG et al., 2002) e a busca de sua padronização é tida como um importante objetivo para os programas de controle da leishmaniose (OMS, 2014). Muitos trabalhos já demonstraram a aplicabilidade da PCR para o diagnóstico da leishmaniose canina, indicando ser, esta, uma técnica mais sensível e específica do que os métodos tradicionais (MANNA et al., 2004), (REALE, S. et al., 1999), (SILVA, E. S. et al., 2001), (STRAUSS-AYALI, D. et al., 2004),

43 43 (LEITE et al., 2010), (LEITE, et al., 2011), (CARVALHO FERREIRA, et al., 2014) e (FERREIRA, et al., 2012). Nos anos 2000, a PCR quantitativa em tempo real (qpcr) se popularizou. Ela utiliza um sistema de quantificação que permite acompanhar em tempo real a amplificação do fragmento alvo de DNA usando fluoróforos que se ligam à dupla fita de DNA ou usando sondas. O método mais usado é o SYBR Green: o fluoróforo se liga à dupla fita de DNA formada durante amplificação do fragmento alvo, levando à emissão da fluorescência durante a PCR. A desvantagem deste método é não permitir descriminar diretamente a amplificação de fragmentos de DNA inespecíficos, problema normalmente resolvido pela análise da curva de dissociação. Por outro lado, o método TaqMan usa sondas, contendo entre 13 e 30 nucleotídeos, específicas para sequência alvo e combinada com o um fluoróforo e um inibidor de fluorescência. Durante a polimerização do fragmento alvo, a DNA polimerase degrada a sonda e a fluorescência é emitida. O uso desta técnica possibilita um aumento na especificidade deste método. As vantagens da PCR incluem: a possibilidade do uso de quantidades muito pequenas de amostras, a detecção rápida de Leishmania em todo tipo de material usado para diagnóstico, incluindo biópsia de pele, esfregaços, aspirados de linfonodo, medula óssea, baço, creme leucocitário, sangue em papel de filtro e pode ser utilizada para detecção e tipagem simultânea do parasito (TAVARES et al., 2003). Diferentes estudos demonstraram um alto índice de positividade na PCR para amostras de pele de cão com diferentes sinais clínicos e tem sido sugerido que as técnicas que utilizam pele da orelha poderiam ser o melhor procedimento para o diagnóstico da LVC. A coleta desta amostra, no entanto, é dolorosa, provoca sangramento e é invasiva, requerendo anestesia local e manipulação asséptica. Já a PCR utilizando medula óssea apresenta alta sensibilidade (FISA et al., 2001), mas o procedimento de coleta é muito invasivo e traumático. É necessária

44 44 a anestesia geral do animal, que geralmente resulta na oposição do responsável por ele. Os linfonodos são um dos tecidos internos preferidos para a multiplicação da L. infantum e aspirados de linfonodo também apresentam sensibilidade alta para PCR (FISA et al., 2001) e (ALMEIDA et al., 2013), mas o procedimento de coleta é invasivo, oferecendo riscos para o animal demandando pessoal especializado para o procedimento. Estas limitações tornam estas amostras inviáveis para inquéritos em larga escala. O sangue é considerado uma amostra menos invasiva. A avaliação da utilização do sangue para diagnostico da LVC é muito contraditória. Muitos estudos apresentaram evidências de que esta amostra clínica apresenta bom desempenho para PCR (MAIA et al., 2009), (MANNA et al., 2004) e (MOHAMMADIHA et al., 2013). Em contraste, outros autores encontraram problemas com uso de sangue relativos a preparação do DNA, a alta frequência de inibidores da PCR no sangue canino, a variações da carga parasitária no curso da infecção e baixa sensibilidade (LEITE et al., 2010), (FERREIRA et al., 2008), (ALMEIDA et al., 2013) e (STRAUSS- AYALI et al., 2004). Além de proporcionar sensibilidade alta, a fonte ideal de material biológico para o diagnóstico molecular da LVC deveria ser não invasiva, indolor, de fácil obtenção, aceita pelos responsáveis pelos cães e que pudesse ser obtida fora de centros veterinários. A amostra de swab conjuntival (SC) é obtida por procedimento não invasivo que usa um swab para amostragem na conjuntiva de cães e atende estes critérios Swab conjuntival Estudos preliminares já haviam inicialmente apontado que a conjuntiva de cães infectados seria uma boa fonte de DNA de Leishmania. Berrahal et al. (1996) investigando animais assintomáticos foi capaz de identificar 15 dos 16 cães (93,8%) por PCR usando 5mg de biópsia de conjuntiva. No mesmo estudo 9 de 14 cães assintomáticos (64,3%) foram positivos para amostras de pele na PCR. Todos os cães foram negativos para ELISA e IFI,

45 45 que não detectou anticorpos específicos em 66% dos animais. Solano-Gallego et al. (2001) haviam identificado por PCR 32 de 100 cães (32%) utilizando biópsia de conjuntiva enquanto no mesmo grupo de 17 dos 95 animais (17,8%) tiveram a medula óssea positiva e 51 de 100 (51%) apresentaram pele positiva. Reithinger et al. (2002) estudaram o tropismo tecidual e disseminação do parasita em dois cães domésticos. Neste estudo Leishmania (Viannia) spp foi detectada por PCR e histologia em biópsia de conjuntiva de ambos os animais. O primeiro trabalho utilizando o swab conjuntival foi realizado por Strauss-Ayali et al. (2004). Noventa e oito cães foram examinados neste estudo e divididos em quatro grupos. O grupo A incluiu 24 animais sintomáticos soropositivos; no grupo B foram incorporados 65 cães soronegativos; o grupo C foi formado por seis cães beagle machos de cinco meses de idade que foram infectados experimentalmente com L. infantum; e o grupo D incluiu nove cães beagle soronegativos, sem sinais clínicos de leishmaniose. No grupo A, 83% das amostras de conjuntiva direita ou esquerda foram positivas por PCR-ITS1 e 92% dos cães foram positivos quando o resultado de ambas as oculares foi combinado. Raspagens de pele obtidas a partir de duas zonas das costas e de lesões cutâneas foram positivas para 29%, 41% e 46% das amostras, respectivamente. Sessenta e cinco por cento dos cães foram positivos quando todos os testes cutâneos foram combinados. O ITS1-PCR, a partir de buffy coat e sangue, foi positivo para 57% e 17% dos cães nesta ordem. Baço e aspirados de nódulos linfáticos foram positivos na PCR para 77% e 67% dos cães, respectivamente. Culturas positivas foram obtidas a partir de 61% e 37% das amostras de baço e nódulos linfáticos e 74% dos cães foram positivos considerando a soma dos resultados de ambas as culturas. Todos os cães soronegativos do grupo B foram considerados negativos por ITS1-PCR em ambas as amostras de conjuntiva e creme leucocitário. Neste estudo sensibilidade de 92% e especificidade de 100% foram encontradas para a detecção de DNA de L. infantum a partir de swab conjuntival em cães sintomáticos naturalmente infectados. Os cães experimentalmente

46 46 infectados (grupo C) foram avaliados a cada duas semanas, durante 90 dias. Quarenta e cinco dias após a infecção 5 (83%) dos 6 cães tinha pelo menos uma amostra de conjuntiva positiva por PCR enquanto que os valores da densidade óptica correspondentes para ELISA estavam ainda abaixo do valor de corte. Após 60 dias de infecção o número de cães positivos na PCR conjuntival permaneceu o mesmo, mas todos os cães se tornaram soropositivos. Aos 75 e 90 dias após a infecção, pelo menos, uma amostra de conjuntiva de 100% dos cães foi positiva. Amostras da conjuntiva, baço e creme leucocitário foram PCR negativas para os animais controle do grupo D (cães beagle soronegativos) e culturas de baço também foram negativas para L. infantum. O estudo demonstrou que a sensibilidade obtida pelo SC-PCR foi superior a obtida por cultura ou por PCR utilizando amostras obtidas de forma invasiva. O trabalho também mostrou que a SC-PCR foi positiva antes da soroconversão nos cães infectados experimentalmente e foi superior ao teste sorológico para o diagnóstico precoce. Ferreira et al. (2008) realizaram um estudo que avaliou o swab conjuntival para o diagnóstico da LVC pelo método de kdna-pcr-hibridização em uma região endêmica para leishmaniose em Belo Horizonte. No método de kdna-pcr-hibridização os produtos amplificados por PCR (120pb) da região conservada dos minicírculos do kdna foram hibridizados com sondas de minicírculos clonados marcados com o radionuclídeo 32 P. O estudo também avaliou dois procedimentos de extração de DNA a partir de esfregaços conjuntivais: fenol-clorofórmio e fervura. A eficiência dos dois métodos de extração de DNA foi avaliada em primeiro lugar, in vitro, usando cotonetes contaminados com diferentes números de promastigotas de L. infantum. Ao utilizar o método do fenol-clorofórmio para a extração do DNA, o procedimento de kdna-pcr-hibridação foi capaz de detectar até um único parasito por swab, enquanto que o limite de detecção do processo de fervura foi de 25 parasitos por swab. Depois disso, foram avaliados dois grupos de 23 cães sintomáticos soropositivos. Amostras de swab conjuntival foram obtidas a partir de ambas as oculares de

47 47 cada animal. A extração de DNA foi realizada pelo método de fenol-clorofórmio no grupo 1 e por fervura no grupo 2. Amostras de sangue também foram coletadas de cada animal: 3 L foi impregnado em papel filtro e 1,0ml foi processado para se obter o creme leucocitário. As extrações de DNA a partir do creme leucocitário e papel filtro foram realizadas por procedimentos idênticos em ambos os grupos, utilizando-se kits comerciais. Após a etapa de hibridização, as positividades foram calculadas para o swab conjuntival combinando-se os resultados da conjuntiva esquerda (CE) e direita (CD) de cada animal, e foram 91,3% e 65,2% para os grupos 1 e 2, respectivamente. As positividades do kdna-pcr-hibridização foram calculadas para CD e CE separadamente, sendo 73,9% (17/23) para CD e 91,3% (21/23) para a CE no grupo 1, 52,2% (12/23) para CD e 56,5% (13/23) para CE no grupo 2. Os resultados obtidos para o creme leucocitário e papel de filtro foram 21,7% (5/23) e 30,4% (7/23) no grupo 1, 34,8% (8/23) e 43,5% (10/23) no grupo 2, respectivamente. Todos os cães soronegativos do controle negativo foram negativos para o ensaio de kdna-pcrhibridização no swab conjuntival, papel de filtro e creme leucocitário. A maior positividade foi obtida pela associação entre swab conjuntival e extração de DNA por fenol-clorofórmio. Di Muccio et al. (2008) avaliaram a swab conjuntival para a detecção precoce de Leishmania em um grupo de cães na Itália. As amostras a seguir foram também examinadas: sangue periférico para IFI, medula óssea e aspirados de linfonodos para a cultura, medula óssea e creme leucocitário de sangue periférico para o diagnóstico molecular. Cinquenta e três amostras foram obtidas a partir de 38 cães. A PCR de swab conjuntival de ambas as oculares, foi positiva para 50 amostras (94,3%), enquanto a PCR de medula óssea positiva para 41 amostras (77,4%). A IFI e culturas (medula óssea e gânglios linfáticos) foram positivas para 66% e 38,9% das amostras, respectivamente. A sensibilidade obtida na PCR de swab conjuntival provou ser superior à obtida na PCR das demais amostras e aos métodos sorológicos.

48 48 Pilatti et al. (2009) comparam a sensibilidade de quatro métodos moleculares em amostras de esfregaço de conjuntiva em um grupo de animais soropositivos e sintomáticos. Foram utilizados os seguintes métodos: kdna-pcr-hibridização, kdna semi-nested PCR (kdna snpcr), ITS-1 nested PCR (ITS-1 npcr) e Leishmania nested PCR (LnPCR). Todos os métodos possuíam duas etapas: amplificação seguida de hibridização ou por uma nova amplificação (nested ou semi-nested). Para todos os métodos foram utilizadas amostras de DNA de 1,0μl. O kdna-pcr-hibridização foi positivo para 22/23 cães (95,6%) e para 40/46 (86,9%) amostras considerando-se as conjuntivas direita e esquerda, respectivamente. O kdna snpcr foi positivo para 21/23 cães (91,3%) e para 40/46 amostras (86,9%). O ITS 1 npcr e o LnPCR foram capazes de detectar os parasitos em 17/23 (73,9%) e 29/46 (63%) cães, respectivamente, e 30/46 (65,2%) das amostras. As positividades dos métodos baseados no alvo kdna foram significativamente maiores. Os autores creditaram este resultado ao fato de que existem aproximadamente 10 mil minicírculos de kdna por parasito, ao passo que os alvos SSU rrna e ITS-1 possuem aproximadamente 200 cópias por célula. Neste estudo o swab conjuntival associado com os ensaios baseados em kdna-pcr mostraram sensibilidades acima de 90% para os cães sintomáticos. O primeiro estudo a investigar a eficácia do swab conjuntival para o diagnóstico por PCR da leishmaniose visceral em cães assintomáticos naturalmente infectados foi realizado por Leite et al. (2010). Animais assintomáticos podem representar uma percentagem elevada de cães infectados em áreas endêmicas e servem como reservatório para a transmissão vetorial para animais sensíveis e humanos. Cães sintomáticos geralmente produzem altos níveis de anticorpos específicos que podem ser facilmente detectados, mas a sensibilidade da detecção de anticorpos é geralmente mais baixa no início das infecções ou em animais assintomáticos. Neste trabalho, a sensibilidade do swab conjuntival foi comparada a de duas amostras menos invasivas, potencialmente úteis para a triagem em massa de cães: sangue e biópsia de pele. O

49 49 estudo foi realizado com 30 cães assintomáticos, todos apresentando diagnósticos sorológico e parasitológico positivos. As amostras foram analisadas por dois métodos moleculares: kdna-pcr-hibridização e ITS-1 npcr. Quando as amostras de swab conjuntival foram analisadas por kdna-pcr-hibridização, o método foi capaz de detectar parasitos em 24/30 (80%) cães em amostras da conjuntiva direita (CD) e 23/30 cães (76,6%) em amostras da conjuntiva esquerda (CE). A positividade obtida combinando ambas as conjuntivas foi de 90% (27/30 cães). Um total de 17/30 (56,7%) e 04/30 cães (13,3%) foram positivos quando amostras de biópsias de pele e de sangue foram usadas, respectivamente. O ITS-1 npcr de swab conjunctival revelou que 25/30 cães (83,3%) foram positivos ao usar CD e 20/30 cães (66,6%) foram positivos ao usar CE. A positividade do swab conjuntival obtida pelo método ITS-1 npcr combinando-se CD e CE foi de 83,3%. Pelo mesmo método 15/30 cães (50,0%) foram positivos para biópsias de pele e 17/30 cães (56,7%) para amostras de sangue. A kdna PCR- hibridização e a ITS-1 npcr apresentaram sensibilidades semelhantes para amostras de swab conjuntival e biópsia de pele. Por outro lado, para as amostras de sangue, a positividade do método ITS-1 npcr foi significativamente mais elevada do que aquela obtida pelo kdna-pcr- hibridização, indicando que a sensibilidade dos métodos de PCR podem variar de acordo com a amostra biológica analisada. Este estudo demonstrou o potencial do swab conjuntival para detectar DNA de Leishmania em cães assintomáticos e que as sensibilidades obtidas com animais assintomáticos foram semelhantes às observadas em estudos anteriores para PCR de swab conjuntival em cães sintomáticos (LEITE et al., 2010) e (FERREIRA et al., 2008). Uma pesquisa conduzida por Gramiccia et al. (2010), em um canil público para cães vadios em Santa Maria Capua Vetere (região da Campânia, sul da Itália), avaliou o desempenho do swab conjuntival associado ao PCR para a detecção da infecção por Leishmania nas fases inicial e tardia em cães expostos a risco de transmissão. O ensaio de

50 50 nested PCR foi realizado utilizando-se iniciadores dirigidos ao gene da subunidade menor do RNA ribossomal (rrna). Foram utilizados dois grupos de animais: (A) uma coorte de 65 cães IFI e SC-PCR negativos expostos e acompanhados durante uma temporada de flebotomíneos (julho-novembro de 2008) e (B) um grupo de 17 cães IFI e CS-PCR negativos, mas positivos na PCR de creme leucocitário de sangue periférico em julho de Estes animais foram examinados novamente em setembro e novembro de 2008 por PCR de creme leucocitário e em maio de 2009 por PCR de creme leucocitário e SC-PCR. Nenhum dos cães do grupo A foi positivo por SC-PCR ou IFI durante a estação de transmissão. Em relação ao grupo B, todos os cães permaneceram IFI negativos até o fim do estudo, com exceção de um animal. Os resultados da PCR de creme leucocitário mostrou uma tendência intermitente com conversão transitória ou total para negativo de 4 e 11 cães, respectivamente, até novembro de Oitenta e dois por cento dos cães (14/17) converteram a negativo em maio de 2009 pelo PCR de creme leucocitário. No entanto, o SC-PCR foi negativo para todos os cães em novembro de 2008, mas 71% dos animais (12/17) haviam se convertido para positivo quando analisados por esta técnica em maio de O grupo controle positivo, no qual foram incluídos 10 cães positivos assintomáticos com títulos elevados de IFI na triagem inicial realizada em 2008, quando examinado novamente maio de 2009 apresentou 80% dos cães positivos por SC-PCR e 60% positivos em PCR de creme leucocitário. A SC-PCR não foi eficaz para a detecção precoce da infecção, mas demonstrou uma conversão lenta para positivo em um número elevado de cães mesmo na ausência de soroconversão. A PCR de creme leucocitário embora pudesse representar um marcador precoce da infecção por Leishmania foi transitória e propensa a conversão para negativa. Os autores consideraram o SC-PCR como uma alternativa não-invasiva aos métodos atuais para identificação de cães expostos à Leishmania.

51 51 Leite et al. (2011) realizaram uma comparação entre o diagnóstico por SC-PCR e a sorologia em um grupo de 42 cães policiais vacinados contra a LVC. Os cães pertenciam à Polícia Militar do Estado de Minas Gerais (PMMG). Todos os cães foram vacinados com a vacina Leishmune (Fort Dodge, Brasil), de acordo com o protocolo do fabricante. Os ensaios sorológicos foram realizados um ano após a vacinação de forma independente por três laboratórios: Os laboratórios 1 e 2 foram laboratórios privados e o laboratório 3 foi o Laboratório de Referência Nacional do Brasil, pertencente à Fundação Ezequiel Dias. ELISA e IFI foram os testes sorológicos utilizados. O laboratório 1 analisou todos os 42 cães e encontrou 15 animais positivos e 4 foram identificados como indeterminados. O laboratório 2 confirmou apenas 3 cães reativos e 2 foram classificados como indeterminados. O laboratório 3 confirmou 7 cães reativos e encontrou 3 animais indeterminados. O resultado sorológico consolidado foi considerado positivo quando ELISA e IFI foram simultaneamente reagentes. Os resultados foram considerados indeterminados quando o ELISA foi reagente e a IFI foi não reagente. Embora os três laboratórios utilizassem os mesmos kits oficiais de diagnóstico para executar os ensaios sorológicos, uma diferença significativa nos resultados foi verificada entre eles. Por esta razão, apenas os sete casos confirmados pelo laboratório 3 foram considerados para a eutanásia. A autópsia dos animais sacrificados mostrou alterações morfológicas relacionadas com LVC de órgãos e tecidos, com exceção de um cão. O diagnóstico molecular por SC-PCR foi realizado em todos os 42 animais e foi capaz de detectar DNA de Leishmania em 17 cães. O método molecular utilizado foi o ITS-1nPCR. Comparando-se os resultados da PCR com os obtidos pelos ensaios sorológicos do laboratório 1, a PCR foi positiva para 10 cães reativos e um caso indeterminado, mas foi negativa para 5 reativos e 3 casos indeterminados. A SC-PCR também foi positiva para 5 cães não reativos, todos eles assintomáticos. Os casos reativos de acordo com o laboratório 1 que foram PCR negativos foram negativos nos testes sorológicos dos laboratórios 2 e 3, e podem

52 52 representar falsos positivos. O mesmo ocorreu com os três casos indeterminados do laboratório 1 que foram PCR negativos. Para os laboratórios 2 e 3, o teste de PCR foi positivo para todos os casos reativos e indeterminados. O ensaio de PCR também confirmou todos os casos simultaneamente reativos nos testes sorológicos de dois laboratórios. O estudo sugere o uso de métodos moleculares como ferramentas complementares para um diagnóstico preciso de LVC e indicou que o procedimento do swab conjuntival poderia ser especialmente útil como uma metodologia de confirmação do diagnóstico para os cães vacinados assintomáticos que apresentem teste positivo no ensaio sorológico, uma vez que uma fração destes animais pode apresentar resultado falso positivo em função da vacinação. Um método de PCR em tempo real baseado em TaqMan, que amplifica um fragmento de 122pb altamente conservado dos minicírculos de kdna de L. infantum, foi desenvolvido e normalizado por Galleti et al. (2011). A fim de avaliar o método, 177 amostras clínicas de medula óssea, aspirado de linfonodo, sangue e SC foram coletadas de 88 cães. Amostras adicionais do baço, rim, pulmão e fígado foram também obtidas dos animais mortos. Vinte e sete amostras oriundas de 15 cães foram positivas. Três destas amostras positivas corresponderam aos SC, para os quais foi encontrado um número médio de parasitas por reação de PCR de 29,4, 0,35 e 170. De acordo com os autores, o SC pode ser adequado para o diagnóstico molecular da infecção por Leishmania apenas em caso de alta carga parasitária, mas melhorias nos procedimentos de extração de DNA de SC poderiam aumentar a sensibilidade obtida. A utilidade do SC para detectar a infecção por Leishmania em uma população canina de área altamente endêmica de leishmaniose foi investigada por Lombardo et al. (2012). Cento e sessenta e três cães, selecionados aleatoriamente em várias províncias da Sicília, foram utilizados. A PCR em tempo real baseada em TaqMan (Applied Biosystems), utilizando iniciadores para a região constante dos minicírculos do cinetoplasto, foi utilizada.

53 53 Amostras de sangue, linfonodos, swabs conjuntivais e orais foram obtidas para o ensaio molecular. O SC foi coletado de uma das oculares em 138 cães (Grupo A), enquanto que um grupo adicional de 25 animais (grupo B) teve a coleta realizada em ambas as oculares. A imunofluorescência indireta (IFI), a reação de hipersensibilidade retardada para leishmanina (DTH) e exame físico também foram realizados. A positividade encontrada para sorologia e DTH foram 27,0% e 73,8%, respectivamente. As positividades por PCR para linfonodos, SC, swab oral (SO) e sangue foram: 24,5%, 22,1%, 8,7% e 5,5%, respectivamente. A positividade obtida para SC no grupo B, em que ambas as oculares foram amostradas, aumentou para 52,0%. A carga parasitária media (parasitas/ml) foi determinada para cada amostra: SC 10 (faixa ), SO 7 (intervalo 2-100), aspirado de linfonodo (faixa de ) e sangue 7 (intervalo 2-14). As positividades foram semelhantes em amostras de aspirado de linfonodo e SC, com base no resultado de uma conjuntiva. Este achado reforçou o uso do SC como alternativa não invasiva para a detecção de cães infectados por Leishmania. O estudo não mostrou associação significativa entre títulos de anticorpos e o percentual de cães SC positivos, mas cães soropositivos e com PCR de linfonodo positivos apresentaram uma alta probabilidade de serem positivos no PCR de SC. Nenhuma associação também foi encontrada entre o estado clínico e os resultados moleculares individuais, em especial entre a presença de lesões oculares e PCR positiva para SC. Curiosamente, o estudo demonstrou a presença de DNA de Leishmania em SO de cães sem qualquer evidência de lesões orais. Embora, a PCR de SO não tenha sido um método de diagnóstico sensível, o trabalho destacou que novos estudos devem investigar a importância deste achado para o risco de transmissão de Leishmania por lambedura ou mordidas. O trabalho de Ferreira et al. (2012) corroborou a aplicabilidade do SC para o diagnóstico da LVC. Neste estudo a kdna PCR-hibridização e PCR em tempo real quantitativa (qpcr) foram utilizadas, respectivamente, para diagnóstico e avaliação da carga

54 54 parasitaria em amostras clínicas de 80 cães infectados naturalmente. Os cães foram divididos em dois grupos: sem manifestações clínicas (grupo 1) e apresentando sinais clínicos associados com a leishmaniose visceral (grupo 2). Todos os animais tinham ELISA positivo e IFI e/ou teste parasitológico positivos. O grupo controle negativo possuía 10 cães sadios que apresentavam resultados negativos nos testes sorológicos e parasitológicos. As taxas de resultados positivos no método kdna PCR-hibridização para as amostras clínicas do Grupo 1, foram as seguintes: swab da conjuntiva direita, 77,5% (31/40); swab de conjuntiva esquerda, 75,0% (30/40); pele, 45,0% (18/40); medula óssea, 50,0% (20/40) e sangue, 27,5% (11/40). Ao combinar os resultados de ambas as conjuntivas, a positividade foi de 87,5% (35/40). Para o grupo 2, a kdna PCR-hibridização apresentou os seguintes resultados: swab da conjuntiva direita, 95% (38/40); swab da conjuntiva esquerda, 87,5% (35/40); medula óssea, 77,5% (31/40); e no sangue, 22,5% (9/40). Considerando-se ambas as conjuntivas, obteve-se uma positividade de 95,0% (38/40). As amostras de SC apresentaram os melhores resultados para ambos os grupos de cães. A qpcr foi realizada utilizando os iniciadores dirigidos para o gene de cópia única da DNA polimerase de L. infantum. O gene da β-actina, constitutivo de célula canina foi utilizado como controle endógeno. Os resultados foram definidos como o número de parasitas por 10 4 células caninas. Para ambos os grupos, as cargas parasitárias determinadas pela qpcr em SC e medula óssea foram estatisticamente equivalentes, por outro lado, a carga de parasitas na pele foi maior do que as outras amostras clínicas analisadas. Quando comparados entre os grupos a carga parasitária de SC no grupo 2 foi maior que no grupo 1. A mesma relação foi encontrada para medula óssea. No entanto, não foram observadas diferenças na carga parasitária de pele entre os grupos estudados. As altas cargas parasitárias detectadas na pele dos animais, tanto sintomáticos quanto assintomáticos, enfatizaram o papel de cães infectados, especialmente o grupo assintomático,

55 55 como reservatório da LVC. O artigo considerou o SC como uma forma adequada de amostragem para o diagnóstico molecular da LVC e sugeriu a sua ampla utilização. Um interessante estudo para avaliar o desempenho de diagnóstico por SC em diferentes estágios da infecção e também para o acompanhamento de cães em tratamento contra leishmaniose foi conduzido por Di Muccio et al. (2012). Para se alcançar o primeiro objetivo, os autores utilizaram 253 cães de áreas endêmicas da região central da Itália e os submeteram a um estudo transversal. Para o segundo objetivo foi realizado um estudo longitudinal com 20 cães doentes em tratamento. O método molecular escolhido foi uma nested PCR utilizando iniciadores dirigidos ao gene da subunidade menor do rrna. Dentre os 253 animais as taxas de infecção por Leishmania foram 21,73% para PCR de SC, 21,34% para a IFI, 14,22% para o exame citológico do linfonodo poplíteo e 8,69% para a PCR de creme leucocitário. Setenta e dois cães foram positivos em pelo menos um teste e considerados positivos para LVC. Entre esses 72 cães, 76,38% foram positivos para PCR de SC, 75,0% para a IFI, 50,0% para exame citológico de linfonodo e 30,55% para a PCR de creme leucocitário. A PCR de SC apresentou o melhor desempenho e uma alta concordância em relação à IFI (κ = 0,75). A correlação dos testes com a infecção e estadiamento clínico foram analisadas em 54 cães soropositivos na IFI. Sete cães foram classificados como expostos (baixo título IFI além de citologia negativa e PCR negativos), 38 como infectados (baixo título IFI além de citologia positiva e / ou PCR positivo, mas sem sinais clínicos) e 9 como doentes (título elevado IFI além de citologia positiva e com pelo menos um sinal clínico). A PCR de SC apresentou a melhor positividade no grupo infectado (84,2%, 32/38 cães), seguida do exame citológico de linfonodo (77,8%, 7/9 cães) e PCR de creme leucocitário (42,1%, 16/38). A positividade da PCR de SC também foi alta no grupo sintomático (77,8%, 7/9 cães), o exame citológico de linfonodo detectou 9/9 cães (100%) e a PCR de creme leucocitário 33,3% (03/09 cães). No grupo exposto, nenhum dos três métodos

56 56 foi capaz de detectar a infecção. Dezoito cães foram negativos pela IFI e 16 destes foram positivos por PCR de SC e 3 por PCR de creme leucocitário. No estudo longitudinal utilizando 20 cães doentes, todos eles foram positivos por imunofluorescência e PCR de SC (100%) no início do estudo, ao passo que 17 foram positivos no exame citológico de linfonodo (85%) e 9 na PCR de creme leucocitário (45%). Após três meses, os protocolos de terapia promoveram uma remissão total dos sinais e diminuição dos títulos de anticorpos com redução das taxas de positividade para o PCR de SC (30%), exame citológico de linfonodo (10%) e PCR de creme leucocitário (5%). Após seis meses de tratamento foi verificado um aumento na positividade para as PCR de SC (88,89%) e creme leucocitário (44,44%) e um aumento menos acentuado no exame citológico de linfonodo (22,22%), sem reaparecimento de sinais clínicos ou aumento dos títulos sorológicos. Estes resultados demonstraram que a PCR de SC foi sensível para a detecção precoce de surtos e foi adequada para monitorar a evolução da infecção após a terapia em cães infectados. Ferreira et al. (2013) comparou swab conjuntival e nasal com outras amostras clínicas em 62 cães naturalmente infectados (58 deles sintomáticos). Iniciadores específicos para o complexo L. donovani dirigidos à região conservada do kdna foram utilizados. Foram obtidas as seguintes frequências de resultados positivos: swab nasal (SN), 87% (54/62); SC, 76% (47/62); biópsia de pele, 81% (50/62); biópsia de medula óssea, 90% (56/62). A positividade obtida com o SN foi estatisticamente equivalente às obtidas com as outras amostras, mas, neste estudo, o SC mostrou uma menor frequência de positividade do que o calculado para amostras de medula óssea, provavelmente devido ao protocolo de PCR utilizado. A carga parasitária foi estimada por qpcr, utilizando iniciadores dirigidos ao gene da DNA polimerase do parasito e ao gene canino da β-actina como um gene constitutivo. A carga parasitária calculada a partir de amostras nasais e da conjuntiva foram equivalentes, mas menor do que verificado em amostras de medula óssea e de pele. Swabs orais (SO) e de orelha

57 57 (SP) também foram avaliados em um grupo menor de 28 animais. Os resultados positivos foram: SO, 79% (22/28) e SP, 43% (12/28). Os resultados deste estudo indicaram que swabs conjuntival, nasal e oral foram eficazes na detecção de Leishmania em cães naturalmente infectados. Os autores sugeriram que uma combinação destas amostras seria útil na triagem de cães em larga escala. Geisweid et al (2013) avaliaram um grupo de cães de área não endêmica. Em função do aumento do número de cães importados ou visitando países do Mediterrâneo, a leishmaniose canina se tornou uma doença infecciosa importante em países onde a transmissão natural normalmente não ocorria. O objetivo deste estudo foi avaliar a sensibilidade e especificidade da PCR de SC em cães em uma área não endêmica da Alemanha. Setenta e quatro cães (37 com sinais clínicos e 37 assintomáticos) que apresentaram suspeita de leishmaniose canina ou que tinham histórico de viagem para regiões endêmicas foram prospectados no período de 2007 a 2011 na Clínica de Pequenos Animais da Universidade de Munique. O exame físico foi realizado em todos os animais que foram classificados de acordo com número de sinais clínicos como: assintomáticos (sem sinal clínico); oligossintomático (um ou dois sinais clínicos); polissintomático (a partir de três sinais clínicos). Para avaliar a sensibilidade e especificidade da PCR de SC, os cães foram definidos como infectados se a PCR de medula óssea e / ou aspirado de linfonodo e / ou sangue foram positivos. Os cães foram classificados como negativos se a PCR de medula óssea fosse negativa, já que este método possuía a mais alta sensibilidade e é considerado um padrão de referência ( padrão ouro ) do teste. As amostras de SC foram colhidas de ambas as oculares. O protocolo de PCR utilizou iniciadores L. infatum específicos destinados a um fragmento de 120pb dos minicírculos do kdna. A PCR em tempo real utilizada foi baseada no SYBR Green. Iniciadores para o gene constitutivo NCX 1 foram utilizados como controle de extração de DNA das amostras. A sensibilidade e especificidade da PCR de SC

58 58 foram de 78,4% (intervalo de confiança [IC] 95%, 62,8-88,6) e 93,8% (IC de 95%, 79,8-98,3), respectivamente. Houve uma forte concordância entre os resultados de PCR de SC e linfonodos (κ = 0,642), concordância fraca a moderada entre SC e medula óssea (κ = 0,483), e quase nenhuma concordância entre PCR de SC e sangue (κ = 0,070). Os cães com altos títulos de anticorpos foram mais propensos a positivar na PCR de SC do que cães com títulos negativos ou duvidosos de anticorpos (p <0,001). Os autores concluíram que a PCR de SC é um bom teste não -invasivo para diagnosticar a infecção por Leishmania em cães em países não endêmicos. Solcà et al. (2014) avaliaram a precisão do método molecular de diagnóstico para LVC usando a análise de classes latentes (ACL). Este estudo foi realizado para avaliar a precisão do teste de diagnóstico molecular (qpcr) em cães de Jequié, estado da Bahia, uma área endêmica de LVC, determinando que tipo de tecido apresentaria a taxa mais alta de detecção de DNA do parasita. A PCR em tempo real utilizou iniciadores direcionados à região constante dos minicírculos do DNA de cinetoplasto. Cinquenta e um cães sintomáticos foram testados para a LVC usando os métodos sorológico, parasitológico e molecular. A qpcr detectou DNA do parasito em 100% desses animais a partir de pelo menos um dos seguintes tecidos: aspirados de medula óssea, fragmentos de baço, linfonodos, pele, sangue e SC. Usando variável latente como padrão de referência, a qpcr alcançou uma sensibilidade de 95,8% (IC 90,4-100%) em aspirado de baço; 79,2% (IC 68-90,3%) em linfonodos; 77,3% (IC 64,5-90,1%) na pele; 75% (IC 63,1-86,9%) no sangue; 50% (IC 30-70%) na medula óssea; 37,5% (IC 24,2-50,8%) em SC da ocular esquerda e 29,2% (IC 16,7-41,6%) em SC da ocular direita. A precisão da qpcr utilizando aspirados esplênicos também foi avaliada em um maior número de amostras aleatórias (n = 800) coletadas durante um estudo de prevalência. A especificidade alcançada pela qpcr foi de 76,7% (IC 73,7-79,65) para estas amostras. A sensibilidade alcançada por esta técnica foi de 95% (IC 93,5-96,5%), maior do que as obtidas

59 59 pelos outros testes de diagnóstico e semelhante ao observado no estudo com amostragem menor. Os autores concluíram que o aspirado de baço é o tipo mais eficaz de tecido para detectar a infecção por L. infantum. Além disso, foi demonstrado que a ACL poderia ser utilizada para gerar um padrão ouro adequado para comparação de testes de LVC. Ceccarelli et al. (2014) demonstraram a aplicação da qpcr em amostras de SC para a avaliação da leishmaniose canina em casos limítrofes ou de recidiva da doença e a correlação com parâmetros clínicos. Neste trabalho os autores buscaram confirmar a eficácia do SC, comparando este ao creme leucocitário como amostra não-invasiva, e verificaram a utilidade da qpcr associada a parâmetros clínicos e laboratoriais convencionais para auxiliar na tomada de decisão terapêutica em relação a cães com casos clínicos complexos. Para isso, foram utilizados 80 cães divididos em quatro grupos com base nos títulos de IFI e histórico clínico: A) cães com IFI negativo (n = 24), composto por cães saudáveis (n = 14 com escore clínico igual a zero) e também cães sintomáticos suspeitos de leishmaniose segundo avaliação clínica por médico veterinário (n = 10 com escore clínico de 1 a 8); B) cães com suspeita de leishmaniose (IFI de 1:40 a 1:80; n = 17); C) cães após terapia bem-sucedida (IFI 1:160 no momento do primeiro diagnóstico; n = 16), composto por cães que foram diagnosticados com leishmaniose antes do início dos estudos e trazidos à clínica veterinária para reavaliação, em muitos casos por causa do reaparecimento de sintomas (escore clínico de 0 a 6); D) cães positivos de novo (IFI 1:160; n = 23) e cães monitorados durante a terapia (IFI 1:160; n = 4). Amostras de sangue periférico e SC dos animais foram fornecidas por uma clínica veterinária de Fano, Itália. Foram realizados dois ensaios de qpcr ambos em lizado bruto de SC e DNA purificado de creme leucocitário. Os ensaios de qpcr usaram dois diferentes pares de iniciadores: iniciadores MaryF-MaryR e MLF-MLR para qpcr1 e qpcr2, respectivamente. A qpcr realizada em amostras de SC apresentou melhor sensibilidade (87%) e especificidade (96%) em comparação com amostras de creme leucocitário,

60 60 independentemente dos iniciadores utilizados. Os parâmetros hematoquímicos hemoglobina e globulinas foram associados significativamente com a positividade da qpcr. Correlações de Pearson entre carga parasitária de kdna de Leishmania no SC e escores de condição física ou títulos de IFI foram calculados em cães com novo diagnóstico de leishmaniose. A carga de kdna de Leishmania no SC correlacionou-se moderadamente com títulos da IFI (R =0.59), mas uma correlação muito fraca (r = 0,37) com o escore da condição física (ECC) foi encontrada. A aplicabilidade do SC para a detecção de Leishmania em cães foi confirmada juntamente com a utilidade de lizados brutos para fins de quantificação. Além disso, a qpcr foi considerada particularmente útil nos casos em que falta um diagnóstico clínico bem definido, onde os valores hematoquímicos não podem ser preditivos. Carvalho Ferreira et al. (2014) realizaram um estudo com objetivo de avaliar um método de PCR em tempo real para a detecção de L. infantum em quatro diferentes tipos de amostras clínicas de cão, incluído o SC. Os autores selecionaram 60 cães naturalmente infectados destinados à eutanásia compulsória, todos positivos para LVC nos testes ELISA, IFI e exame parasitológico. Os animais foram divididos em dois subgrupos, sendo 30 sem sinais clínicos (Grupo 1) e outros 30 apresentando algum sinal clínico sugestivo de LCV (Grupo 2). Além do SC foram avaliadas amostras de sangue, biopsia de pele e aspirado de medula óssea. As amostras foram analisadas por PCR em tempo real, utilizando iniciadores específicos para minicírculos de kdna, e por ITS-1 nested PCR. Os resultados obtidos nos dois métodos moleculares foram comparados. No grupo 1, as taxas de positividade encontradas para a PCR em tempo real foram: sangue, 90% (27/30); biópsia de pele, 93,3% (28/30); aspirado de medula óssea, 100% (30/30); SC, 96,7% (29/30). Não foi observada diferença significativa entre as positividades dessas amostras. Já para o método molecular ITS-1 nested PCR, as taxas de positividade foram: sangue, 63,3% (19/30); biópsia de pele, 63,3% (19/30); aspirado de medula óssea, 97% (29/30); SC, 90% (27/30). As taxas de

61 61 positividade encontradas para medula óssea e SC foram maiores que as encontradas para sangue e biópsia de pele (p < 0,05). Para sangue (p = 0,0146) e biópsia de pele (p = 0,0047) a taxa de positividade obtida na PCR em tempo real foi significativamente maior que a obtida na ITS-1 nested PCR. No grupo 2, a PCR em tempo real foi capaz de detectar 90% (27/30) de cães positivos usando amostras de sangue, 100% (30/30) utilizando amostras de biópsia de pele, 100% (30/30) usando amostras de aspirado de medula óssea e 100% (30/30) com amostras de SC. Novamente, os autores não observaram diferença significativa entres os resultados obtidos para as amostras analisadas por PCR em tempo real. Quando o método utilizado foi o ITS-1 nested PCR foram encontradas as seguintes positividades: sangue, 70% (21/30); biópsia de pele, 83,3% (25/30); aspirado de medula óssea, 96,7% (29/30); SC 90% (27/30). Foi observada diferença estatística entre as taxas de positividade obtida para as amostras de medula óssea e sangue (p =0,0055). No grupo 2, a taxa de positividade obtida na PCR em tempo real para amostras de biópsia de pele foi significativamente maior (p=0.0195) que a taxa verificada quando o método molecular utilizado foi a ITS1 nested PCR. Não foi verificada diferença significativa entre os resultados das amostras analisadas por PCR em tempo real quando os grupos 1 e 2 foram comparados. Para o método ITS-1 nested PCR a positividade em amostras de biopsia de pele foi significativamente maior no grupo 2 (p < 0,05). O SC associado a PCR em tempo real, usando iniciadores específicos para minicírculos de kdna, foi capaz de detectar a infecção por L. infantum em 96,7% dos cães sem sinais clínicos e 100% dos cães sintomáticos, demonstrando a importância deste método para o diagnóstico da LVC.

62 62 3 JUSTIFICATIVA

63 63 No Brasil, a LV é classificada como uma doença de notificação compulsória (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014) e nos últimos cinco anos mais de 3 mil casos por ano foram confirmados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). O Ministério da Saúde tem instituído medidas específicas para controlar a disseminação da doença que incluem o diagnóstico precoce e o tratamento dos casos humanos, controle de vetores, educação em saúde e a eliminação de cães soropositivos infectados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). O cão é o principal reservatório doméstico da LV em áreas urbanas e muitos animais infectados podem desenvolver os sinais clínicos da doença, todavia outros permanecem assintomáticos sem apresentar qualquer sinal clínico aparente (BANETH et al., 2008) e (SOLANO GALLEGO et al., 2009). No entanto, cães assintomáticos naturalmente infectados têm demonstrado infectar flebotomíneos facilmente sob condições experimentais (xenodiagnóstico). A prevalência de leishmaniose visceral canina (LVC) em áreas endêmicas, no Brasil, varia entre 5,9% a 29,8% (FRANÇA-SILVA et al., 2003), (MALAQUIAS et al., 2007), (RONDON et al., 2008) e (LOPES et al., 2010), porém os métodos sorológicos empregados na detecção da LVC exibem sensibilidade baixa e podem estar subestimando o valor verdadeiro. A acurácia dos ensaios é baixa principalmente para detectar infecção em cães assintomáticos (de PAULA et al., 2003) e (ALMEIDA et al., 2005), refletindo em falhas nas medidas de controle e mantendo cães infectados em áreas endêmicas. Ensaios sorológicos podem também apresentar resultados falso positivos em função de reações cruzadas com outros tripanossonatídeos parasitos (BARBOSA-DE-DEUS et al., 2002). Inquéritos sorológicos tem sido realizados usando o ensaio imunoenzimático (ELISA) e a reação de imunoflorescência indireta (IFI) em cães em campanhas de triagem e sacrifício de animais soropositivos. Atualmente, um teste imunocromatográfico (DPP Dual Path Platform) foi implementado como teste de triagem no Brasil e a IFI, como método oficial, está em desuso (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011). Este método detecta anticorpos anti-leishmania

64 64 utilizando a proteína recombinante k28 (fragmentos k26, k39 e k9) como antígeno. O DPP tem apresentado um desempenho excelente identificando 98% dos cães sintomáticos, mas a eficácia em diagnosticar cães assintomáticos foi de apenas 47% (GRIMALDI et al., 2012). Estudos têm demonstrado que as ações propostas pelo Ministério da Saúde têm tido pouco impacto no controle da LV. Este efeito negativo tem sido atribuído ao atraso entre detecção e eliminação de cães infectados, a tendência de se substituir os cães infectados por outros susceptíveis e a baixa sensibilidade dos métodos sorológicos disponíveis (ROSÁRIO et al., 2008), (GOMES et al. 2008) e (ROSÁRIO, et al., 2005). No entanto, segundo Coura-Vital et al. (2014), o novo protocolo para o diagnóstico da LVC, tendo o DPP como método de triagem e a ELISA como confirmatório, tem demonstrado que a prevalência e incidência de infecção são muito maiores do que o sugerido pelo protocolo anterior (ELISA e RIFI), indicando que a magnitude da infecção em áreas endêmicas vinha sendo subestimada. Entretanto, o DPP apresenta especificidade e sensibilidade superiores ao ELISA, o que reforça a busca por um método confirmatório com especificidade superior ao DPP. A reação da cadeia da polimerase (PCR) tem demonstrado ser uma técnica rápida, específica e sensível para detectar Leishmania e diagnosticar LVC (MAIA et al., 2008), (de ASSIS, et al., 2008) e (de QUEIROZ et al., 2010). Porém, amostras obtidas de forma não invasiva seriam muito apropriadas neste contexto uma vez que poderiam ser obtidas fora de clínicas veterinárias e poderiam ser usadas para triagens em massa de cães. Uma amostra interessante para esta finalidade é o swab conjunctival (SC) que é obtido utilizando-se um swab bacteriológico esterilizado para coletar amostras de esfregaço da conjuntiva de cães. O SC-PCR tem demonstrado ser altamente sensível para o diagnóstico da LVC, tanto em cães sintomáticos (STRAUSS-AYALI et al., 2004), (FERREIRA et al., 2008), e (PILATTI et al., 2004) quanto assintomáticos (LEITE et al., 2010). Embora a alta sensibilidade e a aplicabilidade do SC-PCR para o diagnóstico molecular tenham sido confirmadas por

65 65 diferentes grupos de pesquisa, ainda faltam estudos de campo com grandes populações heterogêneas, incluindo animais soronegativos e soropositivos. O proposito deste estudo foi avaliar o SC como uma ferramenta de triagem em massa para o diagnóstico molecular da LVC comparando os resultados dos diagnósticos sorológico e molecular. As amostras de SC foram analisadas por um protocolo de PCR em tempo real altamente sensível que utilizou iniciadores endereçados às regiões conservadas dos minicírculos de kdna (de PAIVA CAVALCANTI et al., 2009) e (CARVALHO FERREIRA et al., 2014) e por ITS-1 nested PCR, que amplifica o alvo ITS-1 da região dos genes do RNA ribossomal (rrna) (LEITE et al., 2010) e (SCHÖNIAN et al., 2003). Vale ressaltar que escolha da PCR real em tempo real foi em função da sua alta sensibilidade, capacidade de processamento de grande número de amostras e reduzido risco de contaminação com amplicon, visto que esta técnica permite acompanhar a amplificação em tempo real eliminando a análise por eletroforese. Este estudo foi realizado na Regional Norte (Distrito Sanitário Norte) da cidade de Belo Horizonte, Minas Gerais, uma importante área endêmica classificada como prioritária para as ações de vigilância do Ministério da Saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).

66 66 4 OBJETIVOS

67 Objetivo Geral Avaliar o swab conjuntival (SC) em inquérito canino para leishmaniose visceral (LVC) na região metropolitana de Belo Horizonte. 4.2 Objetivos Específicos Comparar o diagnóstico molecular, utilizando amostras de SC, com os ensaios sorológicos ELISA e IFI, métodos oficiais preconizados pelo Ministério da Saúde até o período em que a coleta de amostras foi realizada; Comparar os métodos moleculares ITS1-nPCR e PCR em tempo real utilizando-se amostras de SC; Verificar o desempenho dos métodos em grupos de cães sem sinais clínicos e sintomáticos; Identificar por RFLP, a partir do método ITS 1 npcr, espécies de Leishmania infectando cães em Belo Horizonte.

68 68 5 METODOLOGIA

69 Ética na experimentação animal Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) (protocolo n o 001/2011) (Anexo A) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Secretária de Municipal de Saúde de Belo Horizonte (protocolo no ) (Anexo B). Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e com a Lei Federal /2008 (BRASIL, 2008). Os proprietários dos animais incluídos neste trabalho, antes da coleta de material, foram informados sobre o propósito deste estudo e, se concordassem com a participação, assinavam o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A) em que declararam concordar com a participação do cão no projeto. 5.2 Planejamento Experimental A cidade de Belo Horizonte é dividida administrativamente em regionais e cada regional corresponde a um distrito sanitário. O estudo transversal foi realizado entre julho de 2011 a março de 2012 no Distrito Sanitário Norte (19º 55' 15" S, 43º 56' 16" W), que corresponde a uma área de 34,32 km² e uma população humana estimada em habitantes, de acordo com o último censo demográfico realizado pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) (BELO HORIZONTE, 2013). No período em que o estudo transversal foi conduzido o Distrito Sanitário Norte estava subdivido em 19 áreas de abrangência (Figura 5) e foram triados cães em 13 destas áreas. Estas áreas de abrangência apresentam contrastes urbanísticos e socioeconômicos característicos das regiões metropolitanas brasileiras (Figura 6). As áreas de abrangência estudadas foram: Centro de Saúde do Bairro Aarão Reis; Centro de Saúde do Bairro Campo Alegre; Centro de Saúde do Bairro Floramar;

70 70 Centro de Saúde do Bairro Guarani; Centro de Saúde do Bairro Jardim Guanabara; Centro de Saúde do Bairro Lajedo; Centro de Saúde do Bairro Monte Azul; Centro de Saúde do Bairro Novo Aarão Reis; Centro de Saúde do Bairro Providência; Centro de Saúde do Bairro São Bernardo; Centro de Saúde do Bairro Tupi; Centro de Saúde do Conjunto Jardim Felicidade I; Centro de Saúde do Conjunto Jardim Felicidade II.

71 71 Figura 5 - Mapa da cidade de Belo Horizonte com seus distritos sanitários e as correspondentes áreas de abrangência de seus centros de saúde. Destaque para o Distrito Sanitário Norte Mapa modificado a partir do original disponibilizado no sítio eletrônico da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte (Belo Horizonte, 2013)

72 72 Figura 6 - Mapa da cidade de Belo Horizonte com suas regionais. Destaque para a Regional Norte com suas áreas de assentamentos O mapa foi modificado a partir do mapa disponibilizado no sitio eletrônico da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte (Belo Horizonte, 2013)

73 73 Em Belo Horizonte, a população de cães domésticos foi estimada em animais em 2009, o que correspondia a oito cães por habitante humano (de ARAÚJO et al., 2013). A prevalência esperada da LVC nesta área era de 5% a 10% e a população canina estimada de animais. Foi necessário triar um número suficiente de cães para obtenção de pelo menos 120 cães com diagnóstico ELISA positivo para se alcançar um intervalo de confiança de 95% e uma precisão estimada de 1,5%. O presente estudo foi realizado em colaboração com a Secretaria de Saúde de Belo Horizonte. As amostras utilizadas neste trabalho foram coletadas durante o inquérito censitário anual como parte da rotina do Programa de Controle da LV. Os agentes de controle de endemias eram responsáveis pela contenção e coleta de sangue dos animais. Todos os animais foram avaliados por testes sorológicos (ELISA para triagem e IFI como confirmatório) e pelo SC associado à PCR em tempo real. Foram triados cães. Um subgrupo de 484 animais foi submetido à avaliação clínica e ao diagnóstico molecular com o SC associado à ITS-1 nested PCR. 5.3 Avaliação Clínica Durante a coleta de amostras de SC, realizada juntamente com o inquérito canino da Prefeitura de Belo Horizonte, os animais foram avaliados clinicamente por uma médica veterinária e os sinais clínicos observados e/ou relatados pelos proprietários foram documentados em fichas clínicas individuais previamente elaboradas (Apêndice A). Estas fichas, que a cada grupo de 100 constituíam um caderno de campo, continha também os dados de identificação da coleta (numeração sequencial e códigos correspondentes à identificação dos boletins da PBH), dados de identificação e localização do animal e proprietário e o termo de consentimento livre e esclarecido devidamente assinado. Além disso, para garantir a rastreabilidade das informações, todos os cães foram fotografados e cada foto colada em campo destinado a elas nas respectivas fichas.

74 74 Os dados do caderno de campo foram posteriormente digitalizados em uma planilha, utilizando-se recursos do aplicativo Microsoft Excel, versão 2007, onde foi possível classificar os animais em quatro grupos, de acordo com o seu diagnóstico clínico: 1) Cães sem sinais clínicos aparentes (A); 2) Cães com sinais clínicos Grau I (SI apresentaram até 2 sinais clínicos isolados comuns à LVC, sem relatos de outros agravos ou morbidades como possíveis justificativas para eles ); 3) Cães com sinais clínicos Grau II (SII apresentaram a partir de 3 sinais clínicos comuns à LVC, sem relatos de outros agravos ou morbidades como possíveis justificativas para eles ; 4) Cães com sinais clínicos * (S* - apresentaram algum sinal clínico, porém que poderia ser justificados por agravos/morbidades previamente diagnosticados e relatadas pelos proprietários no momento da coleta, fatores determinantes observados no campo, característica fisiológica ou outros). No caso do grupo 4, apesar de terem sido levados em conta outros possíveis fatores determinantes, a LVC também poderia ser a causa dos sinais clínicos observados, devendo ser considerado o diagnóstico diferencial ou de co-infecção. 5.4 Coleta de amostras Swab conjuntival Foram coletadas amostras da conjuntiva inferior de ambas as oculares dos animais (Figuras 7C e 7D). Para o esfregaço, swabs esterilizados manufaturados para isolamento de bactérias foram utilizados e as extremidades contaminadas acondicionadas em microtubos de poliestireno esterilizados, livres de endonucleases, com capacidade para 1,5mL e devidamente identificados. Estes tubos foram acondicionados em bolsas térmicas até o armazenamento temporário em geladeira no posto de apoio da equipe de zoonoses que trabalhava na área de abrangência estudada. No último dia útil da semana, em geral sexta-feira, as amostras eram transportadas, sob - refrigeração, para o laboratório e congeladas (-20,0 ± 5,0) o C até o seu processamento.

75 Sangue Para amostragem sanguínea (Figura 7B) foram colhidas amostras de sangue em papel de filtro para exames sorológicos. A coleta foi realizada pelos agentes de controle de zoonose e as amostras analisadas pelo Laboratório do Centro de Controle de Zoonoses de Belo Horizonte (LABZOO). 5.5 Diagnóstico laboratorial Exame sorológico Os exames sorológicos foram realizados pelo LABZOO. Foram utilizados, para análise, Kits de diagnóstico produzidos por Bio-Manguinhos/ Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz). Dois testes sorológicos foram utilizados: o ensaio imunoenzimático (ELISA) e a reação de imunofluorescência indireta (IFI), conforme determinação do Ministério da Saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). Para o teste ELISA Foi utilizado o kit EIE-LVC, que utiliza placa de microtitulação sensibilizada com antígenos solúveis de Leishmania major-like (MHOM/BR/76/JOF). Na IFI foi utilizado o kit IFI-LVC que utiliza como antígeno formas promastigotas de Leishmania major-like (MHOM/BR/76/JOF). As reações foram realizadas de acordo com os protocolos do fabricante.

76 76 Figura 7 Imagens representativas do trabalho de coleta de amostras dos animais durante o inquérito canino censitário anual (A) contenção do animal pelo agente de controle de endemias; (B) coleta de amostra de sangue em papel de filtro para realização do diagnóstico sorológico; (C) e (D) coleta de amostra pela técnica não invasiva do swab conjuntival para realização do diagnóstico sorológico.

77 Diagnóstico molecular a) Extração de DNA A extração de DNA a partir dos swabs foi realizada de acordo com Ferreira et al. (2008), com a seguinte modificação: o material das duas oculares foi misturado constituindo uma única amostra por cão. Uma mistura de 600 L de proteinase k (250 g/ml) e Triton X- 100 (1%) em tampão de lise (Tris 50 mm, NaCl 50mM e EDTA 10Mm [ph 8,0]) foi adicionada em cada microtubo de poliestireno esterilizado contendo as extremidades dos swabs que continham os esfregaços de ambas as conjuntivas. Tais amostras foram incubadas por 2h a 56ºC. Em seguida, com o auxílio de uma micropipeta, o lisado foi extraído do algodão e transferido para um novo microtubo de poliestireno livre de endonucleases. A remoção dos contaminantes foi realizada mediante três lavagens com 500 L de fenol e clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) em microtubos de poliestireno livres de endonucleases. Nas duas primeiras lavagens, foram utilizados 75% e 50% de fenol respectivamente e a última foi realizada com 100% de clorofórmio-álcool isoamílico. Após cada lavagem, as misturas foram centrifugadas a RCF por 5min. No final, 50 L de acetato de sódio 3M foram adicionados em cada amostra. O DNA foi precipitado com 50 L de isopropanol e foi lavado com 250 L de etanol 75% (v/v). Após centrifugação, a fase contendo DNA foi dissolvida em água ultrapura autoclavada. O DNA foi dosado em espectrofotômetro (GE NanoVue Spectrophotometer ). Os produtos das extrações foram armazenados a -20,0 ± 5,0 o C até o momento de uso. b) Reação da Cadeia de Polimerase (PCR) Dois métodos de PCR foram utilizados neste estudo: o ITS-1 npcr e PCR em tempo real. A identificação das espécies de Leishmania foi realizada pela técnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) a partir do produto amplificado pelo método ITS-1 npcr.

78 78 c) ITS-1 nested PCR (Internal transcribed spacer 1 nested PCR) Foi utilizado para o método ITS-1 npcr uma variação do método original descrito (SCHÖNIAN et al., 2003). Nesta variação o alvo ITS-1 da região dos genes do RNA ribossomal (rrna) passou por duas amplificações. Na primeira amplificação, 10,0 L de amostra de DNA foi misturado a 5,0 L de solução tampão 10x (tris-hcl 50mM [ph 8,3], KCl 50mM), 2,0 L de MgCl2 a 2mM, 1,0 L de dntps a 10mM, 1,4 unidades da enzima DNA polimerase AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), 15pmol de cada oligonucleotídeo iniciador [5 -CTG GAT CAT TTT CCG ATG-3 e 5 -TGA TAC CAC TTA TCG CAC TT- 3 ] e um volume complementar de água ultrapura autoclavada totalizando um volume final de Uma alíquota de 25,0 L dos produtos PCR da primeira amplificação foi diluída em 1,0mL de água ultrapura autoclavada, sendo utilizados 10 L dessa solução como amostra de DNA na segunda amplificação. Os demais constituintes da reação foram: 2,5 L de solução tampão 10x, 1,0 L de MgCl2 a 2mM, 0,5 L de dntps a 10mM, 0,7 unidades da enzima DNA polimerase AmpliTaq Gold (Applied Biosystems ), 15pmol de cada oligonucleotídeo iniciador, [5 -CAT TTT CCG ATG ATT ACA CC-3 ] e [5 -CGT TCT TCA ACG AAA TAG G-3 ], e um volume complementar de água ultrapura autoclavada totalizando um volume final de 25,0 L. Nas duas etapas, as condições de amplificação foram as seguintes: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguida por 30 ciclos de amplificação de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 53ºC e 30 segundos a 72ºC, e uma etapa de extensão final a 72ºC por 5 minutos. O produto de PCR para a primeira reação possui entre 300 a 350pb e o da segunda reação entre 280 a 330pb. Foi utilizado como controle positivo DNA genômico L. infantum, cepa MHOM/1973/BH46, e como controle negativo água ultrapura autoclavada. A visualização dos produtos de amplificação foi realizada como descrito na seção Eletroforese em gel de agarose, página 79.

79 79 d) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) A técnica RFLP permite a identificação das espécies de Leishmania e foi utilizada para identificar a espécie que infectava cães que apresentaram resultado positivo no ITS-1 npcr e negativo no PCR em tempo real. Os produtos de PCR do método ITS-1 npcr, foram digeridos pela enzima HaeII. Para isso, 17 L dos produtos de amplificação da segunda reação de ITS-1 npcr, foram misturados a 3,0 L de uma solução de digestão enzima Hae III no tampão de digestão da enzima (10mM Tris-HCl, 50mM de NaCl, 10mM de MgCl2, 1,0mM de DTE [ph 7,5]). Foram utilizados como controles DNA genômico de L. infantum (cepa MHOM/1973/BH46), L. amazonenis (cepa IFLA/BR/67/PH8) e L. braziliensis (cepa MHOM/BR/75/M2903). Os fragmentos de restrição foram submetidos à eletroforese em gel de agarose de alta resolução a 2%. e) Eletroforese em gel de agarose Para analisar os produtos de PCR, 5,0 L de tampão de amostra (Tris 10mM, EDTA 10mM, azul de bromofenol 0,005% m/v e glicerol 10% v/v) foram acrescentados a 20 L do produto de PCR ou fragmento de restrição e em seguida submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2%, com brometo de etídio, em uma diferença de potencial de 90V. Um marcador de peso molecular com fragmentos múltiplos de 100pb foi utilizado e a corrida realizada em tampão TBE 1x. Para visualizar o resultado, o gel foi exposto à luz ultravioleta em um transiluminador. f) PCR em Tempo Real O DNA extraído das amostras de SC foi analisado por PCR em tempo real de acordo com De Paiva e Cavalcanti et al. (2009), com pequenas modificações. Foram utilizados 2,0 L de amostras de DNA (com concentração final menor ou igual a de 20ng/ L), 3pmol de

80 80 cada oligonucleotídeo iniciador, 25,0 L SYBRGreen Master Mix (Applied Biosystems ) e um volume complementar de 50,0 L de água deionizada autoclavada. O mesmo foi feito para os controles negativos sem, no entanto, acrescentar DNA. Para os controles positivos, foi adicionado 1,0 L de solução contendo DNA genômico purificado de L. infantum, cepa MHOM/1973/BH46, na concentração de 1,0ng/ L. As condições de reação foram: 95 C por 10min para a desnaturação inicial, seguindo-se 40 ciclos de amplificação (15 segundos a 95ºC, 60 segundos a 60ºC). Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram Linf.1-23F [5 - TCCCAAACTTTTCTGGTCCT-3 ] e Linf.1-154R [5 -TTACACCAACCCCCAGTTTC-3 ], endereçados para os minicírculos de kdna de L. infantum, que amplificam fragmentos de 120pb (Tm 81ºC). As reações foram processadas e analidas no sistema automatizado StepOne System (Applied Biosystems ). Para validação dos resultados a curva de dissociação foi avaliada. Foram considerados positivos aqueles resultados em que houve amplificação até o Ct 38 e curva de dissociação com Tm igual a (80,0±1,0) o C. g) Avaliação da integridade das amostras de DNA Para avaliar a integridade das amostras de DNA foi utilizada a amplificação do gene constitutivo da -globina canina. Os iniciadores especificos -globin : 5 -CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3 e -globin 01: 5 -ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC-3 (GREER et al., 1991) que amplificam um fragmento de 118pb (Tm 79ºC) do gene da -globina foram usados. A PCR em tempo real foi realizada com um volume final de 12,5 L contendo 3,0pmol de cada inciador, 6,25 L de 2x SYBR GREEN reaction master mix (Applied Biosystems, USA), 2,0μL de DNA com concentração final menor ou igual a de 20ng/ L As reações foram realizadas nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95 C por 10 min, seguida por 40 ciclos de amplificação (95 C/15s, 60 C/1min). Nenhum controle padrão qualitativo ou quantitativo foi incluido. As amostras postivas para -globina foram

81 81 validadas, enquanto as negativas foram excluidas deste estudo. As reações foram processadas e analidas no sistema automatizado StepOne System (Applied Biosystems ). 5.6 Análise estatística A reprodutibilidade dos métodos moleculares foi obtida pela proporção de resultados concordantes entre a primeira e segunda análise. Para isto, foram selecionadas 5% (68/1358) das amostras avaliadas por SC-PCR em tempo real e 14% (68/484) das amostras avaliadas por SC-ITS-1 npcr sorteadas pelo método de amostragem aleatório sem repetição. Para isso foi utilizado o software Minitab, versão 15. Para verificar a frequência relativa de cães positivos por área de abrangência estudada, foram comparados os métodos ELISA e SC-PCR em tempo real. Foram verificadas as positividades de cada método nas 13 áreas de abrangências estudadas. Para se calcular a frequência relativa foi utilizado o número de cães positivos da área de abrangência dividido pelo número total de cães positivos encontrado no método diagnóstico avaliado. As frequências de resultados positivos obtidos para cada método avaliado foram comparadas usando-se o teste 2 de Pearson a um nível de significância de 5%. A diferença entre os resultados foi considerada significativa se valor P < Para avaliar o grau de concordância entre PCR em tempo real e os demais testes, foi utilizado o índice Kappa, que foi interpretado de acordo com Landis e colaboradores (LANDIS, et al., 1977). Os softwares Minitab, versão 15, e Microsoft Excel, versão 2010, foram utilizados.

82 82 6 RESULTADOS

83 83 Todos os 1350 animais foram triados por ELISA e por SC-PCR em tempo. O teste de IFI foi usado como método confirmatório para os animais ELISA positivos, conforme determinaçao do Ministério da Saúde (2013). Dentre os 1350 cães avaliados, 269 (27,3%) foram positivos pelo método SC-PCR em tempo real e 126 (9,3%) positivos no ELISA. Entre os cães ELISA positivos, 31,0% (39/126), tiveram diagnóstico postivo confirmado pela IFI. A reprodutibilidade do teste SC-PCR em tempo real foi de 95,7%. Quando os testes ELISA e SC-PCR em tempo real foram comparados, verificou-se que 28,5% (105/369) dos cães positivos no SC-PCR real time foram também positivos no ELISA, enquanto 2,1% (21/981) dos cães SC-PCR em tempo real negativos foram ELISA positivos. Por outor lado, 83,3% (105/126) dos animais ELISA positivos foram positivos no SC-PCR em tempo real e 21,6% (264/1224) dos cães ELISA negativos foram positivos no SC-PCR em tempo real (Tabela 1). A Figura 8 apresenta uma análise representativa de amostras de SC pelo PCR em tempo real. O teste confirmatório IFI foi realizado nas 126 amostras positivas no teste de ELISA. Dos cães positvos na IFI, 87,2% (34/39) foram positivos também na SC-PCR em tempo real. Cinco cães negativos no SC-PCR em tempo real foram positivos na IFI. Foram encontrados 68 animais SC-PCR em tempo real positivos que foram negativos na IFI (Tabela 2) Quando SC-PCR em tempo real foi comparado ao ELISA ( = 0,28) e a IFI ( = 0,23), foi observado um nível de concordância fraco. Nenhuma concordância foi verificada quando ELISA e IFI foram comparados ( = 0). As associações ELISA / SC-PCR em tempo real e ELISA / IFI não foram significativas (p > 0,05)

84 84 Figura 8 - Análise por PCR em tempo real de amostras de swab conjuntival pelo método SYBR Green Espectograma de amplificação de quatro amostras positivas (A); Curva padrão com o controle positivo de L. (L.) infantum (Li) (cepa MHOM/1973/BH46) em diferentes concentrações (vermelho) e quatro amostras positivas (azul) (B); Curva de dissociação (Melt) das amostras positivas (C); Curva de dissociação (Melt) do controle positivo em diferentes concentrações.

85 85 Tabela 1 Comparação dos resultados obtidos nos testes ELISA e SC-PCR em tempo real nos cães avaliados para LVC Diagnóstico SC-PCR em tempo real ELISA Total Positivo Negativo n (%) n (%) n (%) Positivo 105 (7,8) 264 (19,6) 369 (27,3) Negativo 21 (1,6) 960 (71,1) 981 (72,7) Total 126 (9,3) 1224 (90,7) 1350 (100) (n) Número de animais

86 86 Tabela 2 - Comparação entre os resultados obtidos na IFI e no SC-PCR em tempo real em cães avaliados para LVC Diagnóstico SC-PCR em tempo real IFI Total Positivo Negativo Indeterminado n (%) n (%) n (%) n (%) Positivo 34 (27,0) 68 (54,0) 3 (2,4) 105 (83,3) Negativo 5 (4,0) 14 (11,1) 2 (1,6) 21 (16,7) Indeterminado 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Total 39 (31,0) 82 (65,1) 5 (4,0) 126 (100) (n) Número de animais

87 87 Em relação ao dignóstico clínico, 484 animais foram analisados. Quando os sinais clínicos foram avaliados nos 52/484 (10,7%) cães ELISA positivos, foi observado que 73,1% destes animais apresentavam sinais clínicos sugestivos da LVC, sendo que 55,7% pertenciam ao grupo SII (Tabela 3). Lesões cultâneas foram os principais sinais clínicos encontrados no momento da avaliação (53,8%). O segundo sinal clínico mais frequente foi linfoadenopatia (42,3%), seguido de onicogrifose (38,5%), pelos opacos (34,6%), apatia (30,8%), perda de peso (26,9%), caquexia (26,9%), alopécia (26,9%), mucosa hipocorada (23,1%), lesões oculares (21,2%), alterações motoras (9,6%) e alterações gastrointestinais (tais como diarréia, vômito ou melema) (5,8%) (Tabela 4). No grupo de 24 cães com diagnóstico sorológico positivo confirmado pela IFI, lesões cutâneas foram também os principais sinais clíncos observados (66,7%). Em segundo lugar, foram observados apatia, linfoadenopatia, onicogrifose e perda de peso (45,8% cada). Os outros tipos manifestações clínicas encontradas foram caquexia (41,7%), pelos opacos (37,5%), mucosa hipocorada (33,3%), alopécia (29,2%), lesões oculares (16,7%), alterações motoras (16,7%) e alterações gastrointestinais (8,3%) (Tabela 3). Foi observado que 83,3% dos cães apresentavam sintomatologia sugestiva para LVC, sendo que 66,7% se enquadravam no grupo SII (Tabela 4). Quando SC-PCR em tempo real foi o método molecular utilizado para avaliar o subgrupo de cães com avaliação clínica, 32,2% (156/484) dos cães testados foram positivos. Neste grupo, 35,3% dos cães não apresentaram sinais clínicos (A), 33,3% foram classificados como SII, 26,9% como SI e 4,5% foram incluídos no grupo S*, sendo a maior parte dos animais pertencentes aos grupos A e SII (Tabela 3). As lesões cutâneas foram mais uma vez os principais sinais clínicos observados (32,9%). A segunda manifestação clínica mais observada foi a linfoadenopatia (29,1%), seguida por onicogrifose (27,8%), pelo opaco (19,0%), alopécia (15.8%), apatia (14,6%), mucosa hipocorada (13,9%), lesões oculares

88 88 (12,7%), caquexia (12,7%), perda de peso (12,0%), alterações gastrointestinais (4,4%) e alterações motoras (4,4%) (Tabela 4). O número de animais diagnosticados como positivos pelo método molecular ITS-1 npcr foi de 44/484 (9,0%), dos quais no diagnóstico clínico 38,6% pertenciam ao grupo SII, 34,1% ao A, 22,7% ao SI e 4,5% ao S* (Tabela 3). O principal sinal clínico observado foi a linfoadenopatia (45,5%), seguida por lesões cutâneas (40,9%), onicogrifose (36,4%), mucosa hipocorada (31,8)%), apatia (29,5%), caquexia (27,3%), pelos opacos (25,0%), perda de peso (22,7%), alopécia (15,9%), alterações motoras (11,4%), alterações gastrointestinais (9,1%) e lesões oculares (4,5%) (Tabela 4). A figura 9 apresenta um gel representativo da análise pelo método ITS-1 npcr. A reprodutibilidade do ITS-1 npcr foi de 91%

89 89 Tabela 3 Classificação clínica dos cães positivos nos testes de ELISA, IFI, PCR em tempo rela e ITS-1 npcr Diagnóstico Clínico ELISA IFI PCR em tempo real ITS-1 npcr n (%) n (%) n (%) n (%) A 14 (26,9) 4 (16,7) 55 (35,3) 15 (34,1) SI 8 (15,4) 4 (16,7) 42 (26,9) 10 (22,7) SII 30 (57,7) 16 (66,7) 52 (33,3) 17 (38,6) S* 0 (0) 0 (0) 7 (4,5) 2 (4,5) Total 52 (100) 24 (100) 156 (100) 44 (100) (A) cães sem sinais clínicos aparentes; (SI) cães com sinhais clínicos grau I; (SII) cães com sinais clínicos grau II; (S*) cães com sinais clínicos*; (n) número de animais

90 90 Tabela 4 - Distribuição dos sinais clínicos observados em relação ao método diagnóstico avaliado Diagnóstico Sinais Clínicos ELISA IFI PCR em tempo real ITS-1 npcr (+) % (+) % (+) % (+) % Alopécia 14 26,9 7 29, , Apatia 16 30, , , Caquexia 14 26, , , ,3 Alterações Gatrointestinais 3 5,8 2 8,3 7 4,4 4 9,1 Mucosa hipocorada 12 23,1 8 33, , ,8 Alterações motoras 5 9,6 4 16,7 7 4,4 5 11,4 Linfoadenopatia 22 42, , , ,5 Lesões oculares 11 21,2 4 16, ,7 2 4,5 Onicogrifose 20 38, , , ,4 Pelos opacos 18 34,6 9 37, , Lesões cutâneas 28 53, , , Perda de peso 14 26, , , N

91 91 Figura 9 - Análise por ITS-1 npcr de amostras de swab conjuntival Eletroforese da segunda reação em gel de agarose a 2%. Padrão de Peso Molecular de 100 pb (M); amostras analisadas (1-16); controle positivo de L. infatum (Li); controle negativo da primeira reação (Cn1); controle negativo da segunda reação (Cn2)

92 92 A Tabela 5 apresenta a comparação entre as positividades obtidas nos métodos moleculares ITS-1 npcr e SC-PCR em tempo real. Verificou-se que 156 (32,2%) cães foram positivos no SC-PCR em tempo real, dentre estes 39 (25,7%) foram positivos no ITS 1 npcr e 117 (74,3%) foram negativos. Cinco cães com teste negativo no SC-PCR em tempo real foram positivos nos metodos ITS-1 npcr e ELISA simultaneamente. Trinta e nove (84,8%) dos 46 animais positivos no ELISA e SC-PCR me tempo real simultaneamente, foram positivos no ITS-1 npcr. Apenas um cão (0,2%) dos 484 foi ELISA postivos e apresentou resultado negativo nos métodos moleculares SC-PCR em tempo real e ITS-1 npcr. Quando a IFI foi comparada ao ITS-1 npcr, 85,7% (21/24) dos cães positivos na IFI tiveram resultado confirmado pelo método molecular ITS-1 npcr, enquanto 14,3% (3/27) dos cães positivos na IFI foram negativos no ITS-1 npcr. Não foi observada qualquer concordância na comparção entre os métodos SC-PCR em tempo real versus ITS-1 npcr, entre os ITS-1 npcr versus ELISA-1 e ITS-1 npcr versus IFI ( < 0). As amostras dos cinco cães ITS-1 npcr positivos que apresentaram resultado negativo no SC-PCR em tempo real foram analisados por RFLP. Foi observado que três cães estavam infectados por L. braziliensis e dois por L. amazonenis (Figura 10). Dentre os cães infectados com L. braziliensis um era SG III e apresentava perda de peso, caquexia, alterações motoras, alterações cutâneas e onicogrifose. Os outros dois eram SG I, sendo que um apreentava linfoadenopatia e outro alterações cutâneas. Com relação aos dois cães infectados com L. amazonensis, um era SG I apresentando linfoadenopatia e o outro não apresentava sinais clínicos.

93 93 Tabela 5 Comparação entre ELISA e ITS-1 npcr com SC-PCR em tempo real no subgrupo dos cães submetidos à avaliação para LVC Diagnóstico SC-PCR em tempo real ELISA ITS-1 npcr Positivo Negativo Total Positivo Negativo Total n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) Positivo 46 (9,5) 110 (22,7) 156 (32,2) 39 (8,1) 117 (24,2) 156 (32,2) Negativo 6 (1,2) 322 (66,5) 328 (67,8) 5 (1,0) 323 (66,7) 328 (67,8) Total 52 (10,7) 432 (89,3) 484 (100) 44 (9,1) 440 (90,9) 484 (100)

94 94 Figura 10 Análise por RFLP de amostras de cães positivos no ITS-1 npcr e negativos no PCR em tempo real Padrão de peso molecular (M); L. infantum (Li) (cepa MHOM/1973/BH46); L. braziliensis (Lb) (cepa MHOM/BR/1975/M2903); L. amazonensis (La) (cepa IFLA/BR/67/PH8); controle negativo (Cn); amostras de cão (1 5). Os fragmentos de RFLP foram 136pb and 123pb para L. braziliensis, 166pb and 122bp para L. amazonensis e 164pb, 72pb e 35bp para L. infantum. As amostras 1 a 3 foram identificadas como L. (V.) braziliensis e as amostras 4 e 5 como L. amazonensis

95 95 A frequência relativa de cães positivos por área de abrangência estudada para os métodos ELISA e SC-PCR em tempo real foram comparadas. Foram verificadas as positividades de cada método nas 13 áreas de abrangências estudadas. Para se calcular a frequência relativa foi utilizado o número de cães positivos da área de abrangência dividido pelo número total de cães positivos encontrado no método de diagnóstico avaliado. Comparando-se os resultados, foi observado que áreas de abrangência com frequência relativa elevada de cães positivos no método sorológico ELISA apresentaram também alta frequência relativa de cães positivos no SC-PCR em tempo real. As três áreas de abrangência com maior frequência relativa de cães positivos no método SC-PCR em tempo real foram: Centro de Saúde do Bairro Novo Aarão Reis, Centro de Saúde do Bairo Jardim Guanabara e Centro de Saúde do Bairro Guarani. Quando o método avaliado foi o ELISA, as três áreas de abrangência com maior frequência de cães positivos foram: Centro de Saúde do Bairro Novo Aarão Reis, Centro de Saúde do Conjunto Felicidade II e Centro de Saúde do Bairro Jardim Guanabara (Figura 11). Os resultados demonstraram que áreas com prevalência alta de cães ELISA positivos tendem a apresentar prevalência alta de cães positivos no SC-PCR em tempo real.

96 Frequência relativa 96 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Área de abrangência ELISA( %) PCR em tempo real (%) Figura 11 - Gráfico com a frequência relativa de cães positivos nos métodos de diagnóstico ELISA e SC-PCR em tempo real

97 97 7 DISCUSSÃO

98 98 Este estudo foi realizado para avaliar o desempenho do swab conjuntival em inquérito epidemiológico rotineiro para o diagnóstico laboratorial da LVC. Este estudo é o primeiro trabalho investigativo da eficácia desta técnica, em triagem rotineira, realizada em uma área endêmica importante e com transmissão intensa de LV. Os resultados mostraram que as infecções caninas por L. infantum identificadas por SC-PCR em tempo real foram em maior número que as detectadas por SC-ITS-1 npcr e por métodos sorológicos. Coura-Vital et al. (2011) estudaram a prevalência e fatores de risco associados à infecção por L. infantum em amostras de cães em Belo Horizonte. Nesse estudo foram utilizadas amostras de sangue e PCR convencional, com iniciadores endereçados para os minicírculos do kdna. Uma positividade de 24,7% foi obtida, muito similar ao resultado do presente estudo usando swab conjuntival associado a PCR em tempo real (27.3%). A prevalência obtida por ELISA (9,4%) foi também equivalente a encontrada no presente estudo (9,3%). Wang et al. (2011) relataram pela primeira vez a prevalência de infecção por Leishmania em cães que viviam na cidade chinesa de Jiuzhaigou County, importante área endêmica de LVC. ELISA, imunocromatografia e PCR (com iniciadores endereçados para alvos no kdna) foram comparados neste estudo. Os resultados forneceram informações fundamentais para a concepção de programas de controle contra a leishmaniose canina e humana. Aproximadamente 2 mil animais foram avaliados. Os autores utilizaram para a PCR amostras de sangue total e para os testes sorológicos foi utilizado soro. A porcentagem de cães infectados foi de 36,79%, 9,43% e 51,88%, detectados por ELISA, imunocromatografia e PCR, respectivamente. Os testes ELISA e PCR foram mais sensíveis que o teste imunocromatográfico baseado na proteína k39. A PCR foi o método de diagnóstico mais sensível para a detecção de cães infectados com Leishmania. Neste contexto, os resultados de Wang et al. (2011) vão de encontro aos que obtivemos no presente estudo indicando que a

99 99 PCR é uma técnica mais sensível para detecção da LVC, embora tenham usado PCR convencional e amostras de sangue. Costa et al (2014) avaliaram a PCR no diagnóstico da LVC em duas regiões epidemiológicas diferentes. Nesse estudo os autores compararam a PCR para o diagnóstico de Leishmania com as técnicas sorológicas DPP (método de triagem) e ELISA (método confirmatório). Foram coletadas amostras de sangue de 195 cães, sendo 98 de Teresina-PI e 97 de Campinas-SP. Trinta e quatro animais de cada cidade apresentaram sorologia positiva após a triagem. Os autores observaram que em Campinas, uma área sem casos humanos autóctones da doença e que tem apresentado um aumento no número de casos caninos nos últimos 5 anos, a PCR apresentou uma maior sensibilidade (88,24%) quando comparado com os resultados obtidos em Teresina (14,71%), uma área endêmica para L. infantum há décadas. Os autores observaram que a sensibilidade do ELISA também foi discordante entre as duas regiões, sendo 100% para Campinas e 21,74% para Terezinha. Belo Horizonte apresenta um perfil epidemiológico semelhante a Teresina, porém nosso estudo apresentou resultados discordantes do que Costa et al. (2014) verificaram: o método molecular PCR foi mais sensível que o teste de ELISA em uma área endêmica de alta transmissão. Temos que ressaltar que os autores usaram amostras de sangue, que estudos anteriores já demostraram apresentar sensibilidade inferior para detecção de Leishmania quando comparada a outras amostras, principalmente o SC (LEITE et al., 2010) e (FERREIRA et al., 2012). A sensibilidade e a utilidade de amostras de sangue total ou de creme leucocitário (buffy coat) para o diagnóstico molecular da LVC são ainda contraditórios. Ao contrário do desempenho verificado para o diagnóstico em humanos, a detecção de DNA de Leishmania por PCR na LVC, a partir de amostras de sangue, demonstra resultados variáveis e esta amostra é considerada de baixo valor diagnóstico (REALE et al., 1999). Problemas reportados para este tipo de amostra incluem, baixa sensibilidade, presença de inibiores da PCR no

100 100 sangue canino, dificuldades na preparação e variações da carga parasitária no curso da infecção (LACHAUD et al., 2002), (STRAUSS-AYALI et al., 2004) e (FERREIRA, et al., 2008). No entanto, alguns trabalhos tem reportado altas sensibilidades com amostas de sangue associadas ao PCR em tempo real (MOHAMMADI-GHALEHBIN et al., 2011) e (MOHAMMADIHA et al., 2013). No trabalho de Mohammadi-Ghalehbin et al. (2011) as amostras de creme leucocitário analisadas por PCR convencional apresentaram sensibilidade alta quando comparadas a métodos sorológicos (creme leucocitário 15%; DAT 3.33%; FML- ELISA 11.66%). Mohammadiha et al. (2013), avaliaram amostras de sangue de cães e humanos por PCR em tempo real, PCR convencional e DAT, que foi utilizado como método de referência. Os autores observaram que amostras de cães e humanos analisadas por PCR em tempo real apresentaram uma alta concordância com o DAT (99% e 95%, respectivamente). Carvalho Ferreira et al. (2014) obtiveram boa sensibilidade com amostras de sangue analisadas por PCR em tempo real, porém o resultado foi inferior ao obtido com amostras de SC tanto em cães assintomáticos (sangue, 90%; SC, 98,3%) quanto sintomáticos (sangue, 90%; SC, 100%). Apesar dos altos índices de positividade por PCR para amostras de pele de cão (XAVIER et al., 2006), o método de coleta é doloroso, requer anestesia local e assepsia na manipulação, provoca sangramento e é invasivo. O desempenho da PCR utilizando amostras de punção de medula apresentam alta sensibilidade (FISA et al., 2001), mas o procedimento de obtenção da amostra é muito invasivo, traumático e requer a anestesia geral do animal. Aspirados de linfonodo permitem obter alta sensibilidade na PCR (ALMEIDA et al., 2013), porém mais uma vez o procedimento de coleta é invasivo, oferecendo risco de infecção para os animais e demanda pessoal altamente capacitado para a coleta. Tais limitações tornam estas amostras inviáveis para inquéritos em grande escala. O uso de DNA extraído de SC para

101 101 o diagnóstico da LVC por PCR foi introduzido com a finalidade de reduzir a necessidade de procedimentos de coleta invasivos (FERREIRA et al., 2008). Neste contexto, Lombardo et al (2001) e Almeida et al (2013) verificaram que amostras de SC apresentaram sensibilidade similar a amostras de medula óssea e linfonodo, respectivamente (LOMBARDO et al., 2011) e (ALMEIDA et al., 2013). Lombardo et al. (2011) avaliaram a utilidade de amostras de swab conjuntival para diagnóstico da LVC em quatro áreas de alta endemicidade na Sicília, Itália. Os autores avaliaram 163 cães domiciliados criados em quintais. Os animais foram avaliados por IFI, Intradermoreação de Monte Negro (RM), PCR em tempo real para sangue (SA), linfonodos (LN), swab conjuntival (SC) e swab oral (SO). As positividades obtidas por PCR em amostras de LN, SC, SO e SA foram: 24,5%, 22,1%, 8,7% e 5,5%, respectivamente. As positividades para os métodos de IFI e RM foram 27,0% e 73,8%, nesta ordem. Vale ressaltar que o SC- PCR, neste estudo, teve resultado semelhante ao LN-PCR que é uma amostra clínica sensível, mas invasiva. Estes resultados também vão de encontro ao que foi obtido em Belo Horizonte: o SC-PCR em tempo real apresentou uma sensibilidade superior ao ELISA se destacando como uma amostra não invasiva para detecção de DNA de L. infantum em cães de áreas endêmicas. No presente estudo, a prevalência obtida no método SC- ITS-1 npcr não foi significativamente diferente quando comparado ao ELISA (p > 0,05; 95% IC) e foi menor que aquela observada no método SC-PCR em tempo real. Estudos anteriores mostraram que swab conjuntival associado a PCR em tempo real foi capaz de detectar infecção por L. infantum em 96,7% dos cães sem sinais clínicos e em 100% dos animais sintomáticos, enquanto 90,0% de sensibilidade foi verificado em ambos os grupos quando os cães foram analisados por swab conjuntival associado a ITS-1 npcr (CARVALHO FERREIRA et al., 2014). Este estudo avaliou 60 cães infectados, positivos simultaneamente nos métodos sorológicos (ELISA e IFI)

102 102 e no teste parasitológico. A positividade encontrada no presente estudo com 484 animais, incluindo cães soronegativos, foi também superior para o SC-PCR em tempo real quando comparado ao SC-ITS-1 npcr. A positividade observada foi três vezes superior demostrando a maior sensibilidade do método em situação de campo, onde é comum cães com baixa carga parasitária e em estágios iniciais da infeção. Devido à maior sensibilidade do SC-PCR em tempo real, foi notório que cinco cães ITS-1 npcr positivos apresentassem resultado negativo para o PCR em tempo real (Tabela 1). Estes animais também foram negativos nos testes de ELISA e IFI. Considerando-se que o PCR em tempo real utiliza iniciadores específicos para L. infantum e o ITS-1 npcr utiliza iniciadores específicos para o género Leishmania, estes resultados poderiam indicar que estes cães estariam infectados com outras espécies de Leishmania. A análise de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) dos amplicons de ITS1 npcr revelou que duas destas amostras correspondiam à L. amazonensis e três a L. braziliensis (Figura 10). L. braziliensis já foi identificada previamente em inquéritos caninos na região metropolitana de Belo Horizonte (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013). Quaresma et al. (2009) avaliaram 217 cães de Belo Horizonte. Os animais foram avaliados por PCR convencional e PCR em tempo real, utilizando iniciadores endereçados à região conservada de 120pb dos minicírculos do kdna. Os animais PCR positivo foram avaliados por RFLP. Os autores encontram 192 animais infectados por L. infantum e dois por L. braziliensis. Leite et al. (2010) compararam amostras de SC com amostras de sangue e biopsia de pele em 30 cães assintomáticos positivos nos testes sorológicos e parasitológicos. Neste estudo, como já descrito anteriormente, as amostras de swab conjuntival apresentaram maior sensibilidade que as demais amostras avaliadas tanto no método kdna PCR hibridização quanto no método ITS-1 npcr. Os autores, demonstraram por RFLP a partir de amplicons de ITS-1 npcr a presença de cães infectados com L. braziliensis. Entretanto, do nosso conhecimento, este é o

103 103 primeiro relato de L. amazonensis infectando cães na Região Metropolitana de Belo Horizonte. Dias et al. (2011), realizaram um estudo em uma área urbana da cidade de Paracatu, localizada na Região Noroeste de Minas Gerais, que é uma cidade endêmica para LTA. Os autores realizaram um inquérito canino com duração de 6 meses e avaliaram 6295 cães. O estudo encontrou 4,2% dos animais (267) positivos para LVC pelos métodos ELISA e IFI. Quinze cães foram submetidos a exames mais detalhados incluindo o exame parasitológico direto e a PCR de amostras de tecidos (linfonodo, pele, baço e medula óssea). Dois métodos de RFLP, utilizando amostras de mielocultura, foram utilizados para identificação das espécies de Leishmania de 7/15 animais positivos. Dois animais apresentaram infecção por L. infantum e cinco por L. amazonensis. Embora o estudo de Dias et al. demonstre a presença de L. amazonensis infectando cães em Minas Gerais, em uma cidade da Região Noroeste, até momento não havia relatos desta natureza na Região Central de Minas Gerais, onde se localiza a Região Metropolitana de Belo Horizonte. Sendo assim, a identificação de dois cães infectados por L. amazonensis em Belo Horizonte é um achado inédito. Tolezano et al. (2007) descreveram o primeiro relato de cães infectados por L. amazonensis na cidade de Araçatuba, interior de São Paulo. Os animais haviam sido inicialmente diagnosticados clinicamente como portadores da LVC e viviam em uma área endêmica. Os autores tentaram o isolamento de parasitos a partir de aspirado de medula e realizaram IFI. Ambos os resultados foram negativos. Os parasitos puderam ser visualizados por exame citológico a partir de amostras de linfonodos. O DNA foi extraído de amostras de linfonodo que foi submetido a uma PCR especifica para rdna de Leishmania. Os produtos da PCR foram hibridizados com sondas S8 especificas para L. amazonensis. O resultado da PCR foi positivo para L. amazonensis. Até aquele momento nenhum caso humano envolvendo L. amazonensis havia sido relatado naquela região. Os autores concluíram que a

104 104 L. amazonensis poderia estar sendo transmitida no peridomicílio e ser a responsável por casos de LV (TOLEZANO et al., 2007). Diante desses relatos e com base nos nosso resultados, sugerimos que as medidas de vigilância epidemiológica e controle em Belo Horizonte considerem a presença de L. amazonensis nesta área endêmica. Este estudo mostrou que um grande número de cães positivos para o SC-PCR em tempo real, com ou sem sinais clínicos para LV, teve o diagnóstico serológico negativo, indicando que a utilização deste método em áreas endémicas poderia ter um impacto positivo sobre o controle da doença. O SC-PCR em tempo real se for utilizado como uma ferramenta de triagem identificaria um maior número de cães infectados. No entanto, este teste deve ser associado obrigatoriamente a um ensaio de confirmação, uma vez que alguns cães SC-PCR em tempo real positivos com sorologia negativa podem converter-se a SC-PCR em tempo real negativos no futuro sem soroconversão (dados não mostrados). Parece que, nestes casos, o SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar infecções iniciais, transitórias, que foram controlados pelos animais com consequente redução da carga parasitária para aquém do limite de detecção do ensaio. Estudos têm mostrado que normalmente cerca de 52% dos cães assintomáticos evoluem para a cura espontânea, cerca de 12% permanecem infectados durante um longo período de tempo sem sintomas, e os outros 36% desenvolvem sintomas mais tarde, podendo vir a morrerem dentro de um ano. Um cão CS-PCR em tempo real positivo com sorologia negativa deve ser indicado como um animal a ser monitorado, uma vez que este grupo de cães tem alta probabilidade de soroconversão. Coura-Vidal et al. (2013) demonstraram a importância de um teste PCR positivo como fator associado com a soroconversão por L. infantum, verificando que cães PCR positivos apresentavam o dobro do risco de se tornarem ELISA positivos no futuro em comparação com aqueles PCR negativos. Neste contexto, o SC-PCR em tempo real se apresenta como uma ferramenta valiosa para antecipar ações de controle da LVC em áreas endêmicas.

105 105 Outro estudo também conduzido por Coura-Vital et al. (2014) avaliou a mudança no protocolo de diagnóstico canino adotado pelo programa nacional de controle da LV e apresentou uma nova proposta para o diagnóstico. Os autores avaliaram 1226 cães dos quais coletaram sangue para obtenção de soro. O soro dos animais foi avaliado por dois protocolos oficiais do Ministério da Saúde: o protocolo anterior a 2012 (protocolo 1), que utilizava ELISA para triagem e IFI como método confirmatório; e o protocolo vigente que utiliza DPP para triagem e ELISA como método confirmatório (protocolo 2). Uma coorte de 447 animais e outra de 440 foram submetidas a uma reavaliação após 10 meses pelo protocolo 1 e pelo protocolo 2, respectivamente. Os animais foram submetidos a mais duas reavaliações 16 e 26 meses após a primeira avaliação. A incidência e prevalência foram determinadas pelo uso dos dois protocolos citados. A prevalência foi de 6,2% e a incidência foi de 2,8 por 1000 cães/mês para o protocolo 1. Para o protocolo 2, a incidência foi de 5,4 por 1000 cães/mês e a prevalência foi 8,1%. Os resultados demonstraram que a prevalência e incidência da infecção foram bem maiores que a sugerida pelo protocolo utilizado antes de 2012 e que a magnitude da infecção pede ter sido subestimada. Como os testes são realizados em sequência e a eutanásia de cães infectados só é realizada quando os dois testes são positivos, a ordem de realização dos testes não afetaria o número de animais a serem eliminados. Com isso, os autores sugerem que os municípios com grande demanda de exames usem ELISA para triagem e DPP para confirmação, desde que isso facilite o trabalho e reduza os custos. Os resultados têm demonstrado que PCR de SC apresenta, além de alta sensibilidade, capacidade de identificar a infecção antes da soroconversão (STRAUSS- AYALI et al., 2004). Neste cenário, sugerimos que a PCR de SC seja introduzida como um método de triagem e a confirmação seja feita por DPP, uma vez que ambas as técnicas são sensíveis, utilizam amostras de fácil coleta e são de fácil realização. Outra opção seria a triagem dos animais por DPP, uma vez que esta técnica permite a realização do diagnóstico em campo e a coleta de SC

106 106 nos cães DPP positivos para realização da PCR como método confirmatório. Nossos resultados demonstram que SC-PCR em tempo real pode ser útil como um teste confirmatório. Dentre os cães ELISA positivo 30,9% (39/126) foram confirmados por IFI enquanto 83,3% (105/126) foram positivos por este método. Esta associação de ensaios permite identificar um grande número de cães infectados com impacto direto no controle da doença. O uso de testes sorológicos rápidos associados com um ensaio molecular de alta especificidade vem sendo indicado como necessário para detectar todos os cães infectados, tanto assintomáticos quanto sintomáticos (VERAS et al., 2014). A frequência relativa de cães ELISA positivos e SC-PCR em tempo real positivos foi avaliada. Foi observado que áreas com alta frequência relativa de cães SC-PCR em tempo real positivos, também apresentaram alta frequência relativa de cães ELISA positivos (Figura 11). As três áreas de abrangência com maior frequência de cães positivos no método SC-PCR em tempo real foram: Centro de Saúde do Bairro Novo Aarão Reis, Centro de Saúde do Bairro Jardim Guanabara e Centro de Saúde do Bairro Guarani. Quando o método avaliado foi o ELISA, as três áreas de abrangência com maior frequência de cães positivos foram: Centro de Saúde do Bairro Novo Aarão Reis, Centro de Saúde do Conjunto Felicidade II e Centro de Saúde do Bairro Jardim Guanabara. Coura-Vital et al. (2011) avaliaram a prevalência e os fatores associados com a infecção de cães por L. infantum no Distrito sanitário Noroeste utilizado PCR de amostras de sangue. Esse estudo mostrou que um dos fatores de risco associados à LVC foi a renda familiar baixa (inferior a dois salários mínimos). No entanto, as áreas de abrangência dos Centros de Saúdes dos Bairros Jardim Guanabara e Guarani, que apresentaram uma prevalência relativa elevada, tanto na PCR em tempo real quanto no ELISA, possuem população com perfil socioeconômico de classe média. Neste contexto, podemos inferir que a expansão da LVC na área avaliada neste estudo ocorre em todas as regiões independente das condições socioeconômicas da população.

107 107 Foi observado que a maior parte dos cães examinados, ELISA e/ou SC-PCR em tempo real positivos, apresentaram sinais clínicos relacionados à LVC. O SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar infecção em cães independentemente do grau de sintomatologia (p > 0,05), enquanto o ELISA foi mais sensível em cães do grupo SII. A alta frequência de lesões cutâneas observada em animais positivos para LVC foi compatível com os resultados encontrados no estudo de Almeida et al. (2005), que avaliou os sinais clínicos de 86 cães naturalmente infectados vivendo em áreas endêmicas da Região Nordeste. Os principais sinais clínicos sugestivos de LVC observados foram emagrecimento e úlceras na pele (80%), seguido por onicogrifose (73%) e conjuntivite (73%). Freitas et al. (2012) avaliaram 85 cães naturalmente infectados de ambos os sexos, com peso e idade variados, oriundos do Centro de Controle de Zoonoses de Fortaleza, Ceará. Os animais foram selecionados pela IFI e pelo exame parasitológico direto de esfregaço de medula óssea. Os autores agruparam os animais conforme os sinais clínicos associados à doença da seguinte forma: negativos (CN = 7); subclínicos (CS = 10) e clínicos (CC = 68). Foram coletadas amostras de sangue para determinar os parâmetros hematológicos e bioquímicos. Os autores observaram que os sinais clínicos mais frequentes foram caquexia (77,9%), ceratoconjuntivite (61,8%) e linfoadenopatia (55,9%), sendo que 86,8% dos animais possuíam mais de um sinal clínico da doença. Nos animais classificados como CC, os autores observaram redução no número de hemácias e hemoglobina, leucocitopenia, neutropenia, trombocitopenia, uremia, hiperproteinemia e hiperglobulinemia. Os autores concluíram que animais com formas clínicas da doença apresentavam alterações hematológicas e bioquímicas. Em nosso estudo, devido ao grande número de animais envolvido, análises hematológicas e bioquímicas não foram realizadas, porém um minucioso exame clínico foi conduzido avaliando-se os sinais físicos da doença em um subgrupo de 484 animais.

108 108 Maia et al. (2010) conduziram um estudo cujo o objetivo era caracterizar um modelo experimental para LVC de modo a determinar quais parâmetros seriam mais relevantes para avaliar a eficácia de candidatos a drogas e vacinas contra L. infantum. Os animais foram infectados experimentalmente e avaliados por técnicas sorológicas e moleculares. Os autores observaram que os principais sinais clínicos observados foram linfoadenopatia e alterações cutâneas. No entanto não foram realizadas correlações entre os sinais clínicos e os métodos diagnósticos avaliados. No presente estudo, as alterações cutâneas e a linfoadenopatia foram os principais sintomas clínicos observados tanto no grupo de cães positivos para o ELISA quanto no grupo de animais SC-PCR em tempo real positivos. Curiosamente, as alterações oculares não foram sinais clínicos de destaque no grupo de cães positivos no SC-PCR em tempo real. O percentual destas lesões foi inclusive superior nos animais positivos nos testes sorológicos em relação aos positivos nos diagnósticos moleculares utilizados em associação com o SC. Concluindo, os resultados do presente estudo demonstraram que o SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar um maior número de cães infectados que o ELISA e que a prevalência de infecções caninas tem sido subestimada pelos testes sorológicos. A utilização de métodos diagnósticos altamente sensíveis como SC-PCR em tempo real, principalmente em áreas endêmicas, poderia dar uma contribuição significativa para o controle da enfermidade.

109 109 8 CONCLUSÕES

110 110 Nossos resultados permitem concluir que: O SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar um maior número de cães infectados quando comparado ao ensaio sorológico de ELISA; O SC-PCR em tempo real apresentou desempenho superior a IFI como ensaio confirmatório; O SC-PCR em tempo real foi capaz de detectar infecção em cães independentemente do grau de sintomatologia, enquanto o ELISA foi mais sensível em cães do grupo SII; O SC-PCR em tempo real foi mais sensível que o SC-ITS-1nPCR em estudo de campo; O presente estudo demonstrou pela primeira vez a presença de cães naturalmente infectados com Leishmania amazonensis em Belo Horizonte; O SC-PCR em tempo real se apresenta como uma ferramenta útil para triagens em inquéritos caninos rotineiros como parte dos programas de controle da leishmaniose visceral; Este estudo contribui para tornar os ensaios moleculares disponíveis em áreas endêmicas e esses procedimentos podem ter um forte impacto no controle da leishmaniose visceral.

111 111 9 PERSPECTIVAS

112 112 Comparar o desempenho do SC-PCR em tempo real com método imunocromatográfico em um estudo de campo em uma área endêmica; Avaliar o desempenho do SC-PCR em tempo real como método confirmatório em um estudo de campo em uma área endêmica; Realizar estudo longitudinal utilizado o SC-PCR em tempo real para avaliar a soroconversão de animais PCR positivos; Determinar a taxa de cura espontânea de cães SC-PCR em tempo real positivos; Demonstrar a viabilidade econômica da implantação da SC-PCR em tempo real como método de rotina para triagem ou confirmação da LVC.

113 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

114 114 ALMEIDA, A. B. et al. Canine visceral leishmaniasis: diagnostic approaches based on polymerase chain reaction employing different biological samples. Diagn Microbiol Infect Dis, v. 76, n. 3, p , ALMEIDA, M. A. et al. Clinical and serological aspects of visceral leishmaniasis in northeast Brazilian dogs naturally infected with Leishmania chagasi. Vet Parasitol, v.127, n.3/4, p , ALMEIDA, P.S. et al. Espécies de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae) coletadas em ambiente urbano em municípios com transmissão de leishmaniose visceral do estado de Mato Grosso do Sul. Rev Bras Entomol, n. 54, p , ALVAR, J. et al. Canine leishmaniasis. Adv Parasitol, n. 57, p. 1-88, Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of its incidence. Plos One, v. 7, n.5, p. e35671, Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. Plos One, v. 7, n. (5): e35671, p. 1-12, ALVAR, J.; YACTAYO, S.; BERN, C. Leishmaniasis and poverty. Trends Parasitol, v. 22, n. 12, p , ALVES, A.S. et al. Evaluation of serological cross-reactivity between canine visceral leishmaniasis and natural infection by Trypanosoma caninum. Res Vet Sci, v. 93, n.3, p , Evaluation of serological cross-reactivity between canine visceral leishmaniasis and natural infection by Trypanosoma caninum. Res Vet Sci, v. 93, n.3, p , ANDRADE, Antero Riberio Silva de, et al. Use of DNA-based diagnostic methods for human leishmaniasis in Minas Gerais, Brazil. Acta Trop, v. 78, p , 2001.

115 115 ANDRADE, H. M. et al. Use of PCRRFLP to identify Leishmania species in naturallyinfected dogs. Vet. Parasitol. v. 140, n.3/4, p , ANDRADE, H. M. Leishmaniose visceral canina: transmissão verticalde Leishmania (Leishmania) chagasi e de imunidade em filhotes e alguns aspectos da resposta imunológica em animais adultos f. Tese (Doutorado em Ciências) - Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, ARIAS, J. R.; MONTEIRO, P. ; ZICKER, F. The reemergence of visceral leishmaniasis in Brazil. Emerg. Infec. Dis., v. 2, n.2, p , BADARÓ, R. Current situation in regard to leishmaniasis in Brazil. Vols. BL-5, p , BANETH, G. et al. Canine leishmaniasis - New concepts and insights on an explaing zoonosis: Part one. Trends in Parasitology, n. 24, p , BARBOSA-DE-DEUS, R. et al. Leishmania major-like antigen for specific and sensitive serodiagnosis of human and canine visceral Leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol, v. 9, n.6, p , BARROUIN-MELO, S.M. et al. Comparison between splenic and lymph node aspirations as sampling methods for the parasitological detection of Leishmania chagasi infection in dogs. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 99, n. 2, p , BELO HORIZONTE Regiões Administrativas. Gestão Compartilhada. Disponível em: < Acesso: em 10 ago BEVILACQUA, PD, et al Urbanization of visceral leishmaniose in Belo Horizonte, Brazil. Arq Bras Med Vet Zoot, v.53, p. 1-8, BRASIL. Lei nº , de 8 de outubro de Regulamenta o inciso VII do 1o do art. 225 da Constituição Federal, estabelecendo procedimentos para o uso científico de animais; revoga a Lei no 6.638, de 8 de maio de 1979; e dá outras providências. Disponível em : < Acesso em: 10 ago.2013.

116 116 BRITO, V.N. et al. Phlebotomine fauna, natural infection rate and feeding habits of Lutzomyia cruzi in Jaciara, state of Mato Grosso, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, v.109, n.7, p , CARVALHO FERREIRA, A.L. et al. Detection of Leishmania infantum in 4 different dog samples by real-time PCR and ITS-1 nested PCR. Diagn Microbiol Infect Dis, v. 78, p , CECCARELLI, M. et al Application of qpcr in conjunctival swab samples for the evaluation of canine. Parasit Vectors, v.7, p. 460, CHAPPUIS, F. et al. Visceral leishmaniasis: what are the needs for diagnosis, treatment and control? Nature Reviews Microbiology, v.5, p , CIARAMELLA, P. et al. A retrospective clinical study of canine leishmaniasis in 150 dogs naturally infected by Leishmania infantum. Vet Rec, v. 141, n. 21, p , COURA-VITAL, W. et al. Evaluation of Change in Canine Diagnosis Protocol Adopted by the Visceral Leishmaniasis Control Program in Brazil and a New Proposal for Diagnosis. PLoS ONE. v. 3, n. 9, p. e91009, Prevalence and Factors Associated with Leishmania infantum infection of Dogs from an Urban Area of Brazil as Identified by Molecular Methods. PLoS Negl Trop Dis, v. 8, p. e1291, Risk Factors for Seroconversion by Leishmania infantum in a Cohort of dogs from an Endemic Area of Brazil. PLOS ONE, v.8, n.8, p. e71833, da SILVA, E.S. et al. Diagnosis of canine leishmaniasis in the endemic area of Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil by parasite, antibody and DNA detection assays. Vet Res Commun, v. 30, n.6, p , da SILVA, R.N. et al. Real-time PCR in clinical practice: a powerful tool for evaluating Leishmania chagasi loads in naturally infected dogs. Ann Trop Med Parasitol., v. 104, n. 2, p , DAULAIRE, N. Globalization and health. Developmen, v. 4, p , de ALMEIDA, M.E. et al. Identification of Leishmania spp. by molecular amplification and DNA sequencing analysis of a fragment of rrna internal transcribed spacer 2. J Clin Microbiol., v. 49, n. 9, p , 2011.

117 117 de ARAÚJO, V.E. et al Relative Risk of Visceral Leishmaniasis in Brazil: A Spacial Analysis in Urban Area. PLoS Negl Trop Dis., v.11, n. 7, p. e2540, de ASSIS, J. et al Estudo comparativo dos métodos diagnósticos para Leis[Comparative study of diagnostic methods for visceral leishmaniasis in dogs from Ilha Solteira, SP]. Rev Bras Parasitol Vet., v.19, n.1, p , de LIMA, V.M. et al. Comparison between ELISA using total antigen and immunochromatography with antigen rk39 in the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Vet Parasitol., v. 173, n. 3/4, p , de PAIVA CAVALCANTI, M. et al The development of a real-time PCR assay for the quantification of Leishmania infantum DNA in canine blood. The Veterinary Journal., v. 182, p , de PAULA, A.A. et al. The use of immunoblot analysis in the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in an endemic area of Rio de Janeiro. J Parasitol., v. 89, n.4, p , de QUEIROZ, N.M. et al. [Canine visceral leishmaniasis diagnosis by immunohistochemistry and PCR in skin tissues in association with IFAT and ELISA-test]. Rev Bras Parasitol Vet., v. 19, n.1, p , 2010 DEANE, L.M.; DEANE, M.P. Leishmaniose visceral urbana (no cão e no homem) em Sobral, Ceará. O Hospital, n. 47, p , DESJEUX, P. H. Disease Watch Focus: Leishmaniasis. Nature Rev. Microbiol., v.2, p. 692, Leishmaniasis. Public health aspect and control. Clin. Dermatol., v.14, p , DESJEUX, P.H.; ALVAR, J Leishmania/HIV co-infections: epidemiology in Europe. Ann. Trop. Med. Parasitol., v.97, n.1, p. 3-15, DI LORENZO, C.; PROIETTI, F. A. Leishmaniose visceral canina como fator de risco para a leishmaniose visceral humana: o que sabemos e o que não sabemos ainda. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v. 35, n.3, p , 2002.

118 118 DOS-SANTOS, W.L. et al. Associations among immunological, parasitological and clinical parameters in canine visceral leishmaniasis: Emaciation, spleen parasitism, specific antibodies and leishmanin skin test reaction. Vet Immunol Immunopathol., v. 123, n. 3/4, p , DYE, C. The logic of visceral leishmaniasis control. Am J Trop Med Hyg., v. 55, n.2, p , ELKHOURY, A. N. S. M. Vigilância e controle da leishmaniose visceral no Brasil. In: Consulta de los expertos ops/oms sobre leishmaniasis visceral en las américas. 1, 2005, Brasília. Informe final de la reunion de expertos OPS/OMS sobre Leishmaniasis en las Américas, p , FARIA, A.R. et al. High-throughput analysis of synthetic peptides for the immunodiagnosis of canine visceral leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis, v. 5, n. 9, p. e1310, FERREIRA, E. C. et al Comparison of serological assays for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in animals presenting different clinical manifestations. Vet Parasitol., v.146, n.3/4, p , FERREIRA, S. A. et al. Evaluation of the conjunctival swab for canine Leishmaniasis diagnosis by PCR-hybridization in Minas Gerais State, Brazil. Vet. Parasitology., v. 152, n.3/4, p , FERREIRA, S.A.; LEITE, R.S. et al. Canine Skin and Conjunctival Swab Samples for the Detection and Quantification of Leishmania infantum DNA in an Endemic Urban Area in Brazil. PLoS Negl Trop Dis., v. 6, n. 4, p. 1-9, FIGUEIREDO, M.M. et al Histopathological and parasitological investigations of ear healthy skin of dogs naturally and experimentally infected with Leishmania (Leishmania) chagasi. Histol Histopathol., v.25, n.7, p , FISA, R. et al Nested for PCR diagnosis of canine leishmaniasis in peripheral blood, lymph node and bone marrow aspirates. Vet. Parasitol., v.99, p , FRAGA, D.B. et al. Temporal distribution of positive results of tests for detecting Leishmania infection in stray dogs of an endemic area of visceral leishmaniasis in the Brazilian tropics: a 13 years survey and association with human disease. Vet Parasitol., v.190. n.3/4, p.591-4, 2012.

119 119 FRANÇA-SILVA, J.C. et al Epidemiology of canine visceral leishmaniasis in the endemic area of Montes Claros Municipality, Minas Gerais state, Brazil. Vet Parasitol., v.111, p , GEISWEID, K. et al. Evaluation of a conjunctival swab polymerase chain reaction for the detection of Leishmania infantum in dogs in a non-endemic area. Vet J., v. 198, n.1, p , GOMES, Y.M. et al. Diagnosis of canine visceral leishmaniasis: Biotechnological advances. Vet J. v.175, p , GONTIJO, C. M. F. ; MELO, M. N. Leishmaniose Visceral no Brasil: quadro atual, desafios e perspectivas. Rev. Bras. Epidemiol, v. 7, n. 3, p , GRAMICCIA, M. ; GRADONI, L. The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control. Int J Parasitol., v. 35, n.11/12, p , GREER, C.E.; LUND, J.K. ; MANOS, M.M. PCR amplification from paraffin-embedded tissues: recommendations on fixatives for long-term storage and prospective studies. PCR Methods Appl., v. 1, n. 1, p , GRIMALDI, G. Jr. et al. The effect of removing potentially infectious dogs on the numbers of canine Leishmania infantum infections in an endemic area with high transmission rates. Am J Trop Med Hyg, v. 86, n. 6, p , GRIMALDI, G.; TESH, R. B. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Reviews., v. 6, p , KUHLS, K, et al Comparative microsatellite typing of new world leishmania infantum reveals low heterogeneity among populations and its recent old world origin. PLoS Negl Trop Dis., v. 5, n. 6, p. e1155, LACHAUD, L.; et al. Value of two PCR methods for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis and the detection of asymptomatic carriers. Parasitology, v. 125, n. 03, p , LANDIS, J.R.; KOCH, G. G. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics., v. 33, n. 1, p , LEITE, R. S. et al. PCR diagnosis of visceral leishmaniasis in asymptomatic dogs using conjunctival swab samples. Vet. Parasitol., v. 170, p , 2010.

120 120 LEITE, R.S. et al. The use of conjunctival swab samples for PCR screening for visceral leishmaniasis in vaccinated dogs. Rev Bras Parasitol Vet., v. 20, n. 1, p , LIRA, R.A. et al. Canine visceral leishmaniosis: A comparative analysis of the EIEleishmaniose-visceral-canina-Bio-Manguinhos and the IFI-leishmaniose-visceral-canina-Bio- Manguinhos kits. Vet Parasitol., v. 137, n.1/2, p , LOMBARDO, G. et al. Detection of Leishmania infantum DNA by real-time PCR in canine oral and cojunctival swabs and comparison with other diagnostic techniques. Vet. Parasitol.,v.184, n.1, p.10-17, LOPES, E.G.P. et al. Distribuição temporal e espacial da leishmaniose visceral em humanos e cães em Belo Horizonte-MG, 1993 a 2007 [Temporal and spatial distribuition of leishmaniasis in humans and dogs from Belo Horizonte-MG, ]. Arq Bras Med Vet Zootec., v. 62, p , LUZ, Z. M. P. A urbanização das leishmanioses e a baixa resolutividade diagnóstica em municípios da Região Metropolitana de Belo Horizonte. Revista da Soc. Bras. Med. Trop.,v. 34, n.3, p , MAIA, C. L. Methods for diagnosis of canine leishmaniasis and immune response to infection. Vet Parasitol, v.158, p , MAIA, C. et al. Diagnosis of canine leishmaniasis: conventional and molecular techniques using different tissues. Vet J, v. 179, n.1, p , MALAQUIAS, L.C. et al. Serological screening confirms the re-emergence of canine leishmaniosis in urban and rural areas in Governador Valadares, Vale do Rio Doce, Minas Gerais, Brazil. Parasitol Res., v. 100, p , MANNA, L. et al Comparison of different tissue sampling for PCR-based diagnosis and follow-up of canine visceral leishmaniosis. Vet Parasitol., v. 125, n. 3/4, p , MAURYA, R. et al Evaluation of blood agar microtiter plates for culturing leishmania parasites to titrate parasite burden in spleen and peripheral blood of patients with visceral leishmaniasis. J Clin Microbiol, v. 48, n. 5, p , MENDONÇA, L. et al Clinical aspects of visceral Leishmania in naturally infected dogs in the of Teresina, Piaui. Revista Brasileira Parasitologia Veterinaria., v. 8, n. 1, p. 23-5, 1998.

121 121 MILES, M.A. et al. Canine Leishmaniasis in Latin America: control strategies for visceral Leishmaniasis. Intenational forum of the canine leishmaniasis: an update. Barcelona : Wiesbaden, Hoechst Roussel Vet., p.46-53, MINISTÉRIO DA SAÚDE Casos confirmados de Leishmaniose Visceral, Brasil, Grandes Regiões e Unidades Federadas a Situação Epidemiológica. Disponível em: [ Acesso em: 26 nov Leishmaniose visceral. Secretaria de Vigilância em Saúde. Disponível em: < secretaria-svs/vigilancia-de-a-a-z/leishmaniose-visceral-lv/11334-situacao-epidemiologicadados>. Acesso em : 24 nov Leishmaniose Visceral - Aspectos Epidemiológicos. Portal da Saúde. Disponível em< Acesso em: 06 jan LV: Municípios prioritários para as ações de vigilância. Portal da Saúde. Disponível em: < Acesso em: 27 jun Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral. Brasília : Editora MS, Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. 1.ed. Brasília : Editora MS, Nota técnica conjunta n 01/2011 CGDT/DEVIT/SUS/MS. Esclarecimento sobre a substituição do protocolo diagnóstico da leishmaniose visceral (LVC). Brasília, Portaria nº 1.271, de 6 de junho de Define a Lista Nacional de Notificação Compulsória de doenças, agravos e eventos de saúde pública nos serviços de saúde públicos e privados em todo o território nacional. Define a Lista Nacional de Notificação Compulsória de doenças, agravos e eventos de saúde pública nos serviços de saúde públicos e privados em todo o território nacional, nos termos do anexo, e dá outras providências. Disponível em: < Acesso em : 12 nov Secretaria de Vigilância em Saúde. Mapa de Estratificação da LV, segundo município de residência e média de casos, de 2009 a Disponível em: brasil>. Acesso em : 06 set

122 122 MIRÓ, G. et al. Canine leishmaniosis--new concepts and insights on an expanding zoonosis: part two. Trends Parasitol.,v. 24, n. 8, p , MOHAMMADI-GHALEHBIN, B. et al. A Leishmania infantum FML-ELISA for the detection of symptomatic and asymptomatic canine visceral leishmaniasis in an endemic area of Iran. Iran J Immunol., v. 8, n. 4, p , MOHAMMADIHA, A.; MOHEBALI, M.; HAGHIGHI, A.; MAHDIAN, R.; ABADI, A.R.; ZAREI, Z.; YEGANEH, F.; KAZEMI, B.; TAGHIPOUR, N.; AKHOUNDI, B. Comparison of real-time PCR and conventional PCR with two DNA targets for detection of Leishmania (Leishmania) infantum infection in human and dog blood samples. Exp Parasitol, v. 133, n.1, p , MOLINA, R. et al. Infectivity of dogs naturally infected with Leishmania infantum to colonized Phlebotomus perniciosus. Trans R Soc Trop Med Hyg., v. 88, p , MOREIRA, M.A. et al Comparison of parasitological, immunological and molecular methods for the diagnosis of leishmaniasis in dogs with different clinical sign. Vet Parasitol., v. 145, n. 3/4, p , MORENO, J.; ALVAR, J. Canine Leishmaniasis: epidemiological risk and the experimental model. Trends in Parasiltol., v. 18, p , NEVES, D. P Parasitologia Dinâmica. 3.ed. Belo Horizonte : Atheneu, NOLAN, T,J.; HERMAN, R. Effects of long-term in vitro cultivation on Leishmania donovani promastigotes. J Protozool. 1985, v. 32,n. 1, p. 70-5, OLIVEIRA, G.G. et al. Characterization of novel Leishmania infantum recombinant proteins encoded by genes from five families with distinct capacities for serodiagnosis of canine and human visceral leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg., v. 85, n. 6, p , OMS. Control of the Leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the control of Leishmaniasis, Geneva, World Health Organization. Genebra : World Health Organization, 2010.

123 123.Leishmaniasis. World Health Organization. Disponível em: < Acesso em: jan Leishmaniasis - Clinical forms of the leishmaniases. WHO - World Health Organization. Disponível em: Acesso em: 24 nov TDR - Visceral Leishmaniasis. TDR for research on diseases of poverty WHO - World Health Organization. Disponível em: < em: 24.nov WHO - Global Health Observatory (GHO). Leishmaniasis - Situation and trends. Disponível em: < Acesso em: 24 nov PAIVA CAVALCANTI, M., et al. The development of a real-time PCR assay for the quantification of Leishmania infantum DNA in canine blood. Vet. J., v. 182, p , PALATNIK-DE-SOUZA, C.B., et al. Impact of canine control on the epidemiology of canine and human visceral leishmaniasis in Brazil. Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 65, n. 5, p , PALMA, G.; GUTIERREZ, Y. Laboratory diagnosis of Leishmania. Clin Lab Med., v. 11, n. 4, p , PASSOS, V.M., et al. [A canine survey in a recent focus of cutaneous leishmaniasis in the city of Sabará, the metropolitan area of Belo Horizonte]. Rev Soc Bras Med Trop., v. 29, n. 4, p , Epidemiological aspects of American cutaneous leishmaniasis in a periurban area of the metropolitan region of Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz., v. 88, n.1, p , PILATTI, M. M., et al. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Res Vet Sci., v.87, p , PORROZZI, R., et al Comparative evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays based on crude and recombinant leishmanial antigens for serodiagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infantum visceral infections in dogs. Clin Vaccine Immunol., v. 14, n.5, p , 2007.

124 124 QUARESMA, P.F., et al. Molecular diagnostic of canine visceral leishmaniasis: Identification of Leishmania species by PCR-RFLP and Quantification of parasite DNA by real-time PCR. Acta Tropica., v.111, n.3, p , QUINNELL, R.J., et al. Evaluation of rk39 rapid diagnostic tests for canine visceral leishmaniasis: longitudinal study and meta-analysis. PLoS Negl Trop Dis., v. 7, n. 1, p. e1992, RAMESH, V.; MUKHERJEE, A. Post-Kala-azar dermal leishmaniasis. Int J Dermatol., n. 34, p , REALE, S., et al. Detection of Leishmania infantum in dogs by PCR with lymph node aspirates and blood. J. Clin. Microbiol., v. 37, p , REIS, A. B., et al. Isotype patterns of immunoglobulins: hallmarks for clinical status and tissue parasite density in Brazilian dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) chagasi. Vet Immunol Immunopathol., v. 112, n. 3/4, p , REITHINGER, R.; DUJARDIN, J.C. Molecular diagnosis of Leishmaniasis: current status and future applications. J. Clin. Microbiol., v. 45,n. 1, p , RONDON, F. C., et al. Cross-sectional serological study of canine Leishmania infection in Fortaleza, Ceará state, Brazil. Vet Parasitol, v. 155, p , ROSÁRIO, E. Y., et al. Evaluation of enzyme-liked immunosorbent assay using crude Leishmania and recombinant antigens as a diagnostic marker for canine visceral leishmaniasis. Mem Inst Oswaldo Cruz., v. 100, p , SARIDOMICHELAKIS, M. N. Advances in the pathogenesis of canine leishmaniosis: epidemiologic and diagnostic implications. Vet Dermatol., v. 20,n. 5/6, p , SCHALLIG, H.D.F.H. et al. Review: Molecular biological applications in the diagnosis and control of Leishmaniasis and parasite identification. Trop. Med. Int. Health., v. 7, n. 8, p , SCHÖNIAN, G. et al. PCR diagnosis and characterization of Leishmania in local and imported clinical samples. Diagn Microbiol Infect Dis., v. 47, n.1, p , SCHUBACH, E.Y.; FIGUEIREDO, F.B.; ROMERO, G. A. Accuracy and reproducibility of a rapid chromatographic immunoassay for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in Brazil. Trans R Soc Trop Med Hyg, v. 108, 9, p , 2014.

125 125 SHAW, S.E.; LANGTON, D.A.; HILLMAN, T. J. Canine leishmaniosis in the United Kingdom: a zoonotic disease waiting for a vector? Vet Parasitol,v. 163, n. 4, p , SHÖNIAN, G. PCR diagnosis and characterization of Leishmania in local and local and imported clinical samples. Diag. Microbiol. Infect. Dis., v. 47, 2003, p , SILVA, E. S., et al. Visceral Leishmaniasis in the Metropolitan of Belo Horizonte, State of Minas Gerais, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz., v. 96, n.3, p , SINGH, S New developments in diagnosis of Leishmaniasis. Indian J. Med Res., v. 123, p , SOLANO-GALLEGO, L. et al. Directions for the diagnosis, clinical staging, treatment and prevention of canine leishmaniasis. Vet Parasitol., v. 165, p. 1-18, LeishVet guidelines for the practical management of canine leishmaniosis. Parasit Vectors, v. 4, p.86, Prevalence of Leishmania infantum infection in dogs living in an area of canine leishmaniasis endemicity using PCR on several tissues and sorology. J Clin Microbiol., v. 39, p , SOLCÀ, M.D. S., et al. Evaluating the Accuracy of Molecular Diagnostic Testing for Canine Visceral Leishmaniasis Using Latent Class Analysis. PLoS ONE.,v. 9, n.7, p. e103635, Qualitative and quantitative polymerase chain reaction (PCR) for detection of Leishmania in spleen samples from naturally infected dogs. Vet Parasitol., v. 184, n.2/4, p , SRIVASTAVA, P., et aldiagnosis of visceral leishmaniasis. Trans R Soc Trop Med Hyg., v. 105, n.1, p. 1-6, STRAUSS-AYALI, D., et al. Polymerase chain reaction using noninvasively obtained samples, for the detection of Leishmania infantum DNA in dogs. J Infect Dis., v. 189, p , TAVARES, C. A. P.; FERNANDES, A. P.; MELO, M. N. Molecular diagnosis of Leishmaniasis. Expert Rev. Mol. Diag, v. 3, n.5, p , Use of PCR RFLP to identify Leishmania species in naturally-infected dogs. Veterinary Parasitology., v. 140, v. 3/4, p , 2006.

126 126 VERAS, P.S.T., et al. New Advances in the Diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis. [A. do livro] Claborn David M. Leishmaniasis - Trends in Epidemiology, Diagnosis and Treatment and Treatment. s.l. : InTech, WANG, J.Y., et al. The prevalence of canine Leishmania infantum infection in western China detected by PCR and serological tests. Parasit Vectors., v. 4, p.69, XAVIER, S.C., et al. Comparison of paraffin-embedded skin biopsies from different anatomical regions as sampling methods for detection of Leishmania infection in dogs using histological, immunohistochemical and PCR methods. BMC Vet Res, v. 2, p. 17, ZIJLSTRA, E. E.; KAGER, R. A. G. Post-Kala-azar dermal leishmaniasis in the Sudan: clinical presentation and differential diagnosis. Brit J Dermatol., v. 143, p , 2000.

127 APÊNDICE A FICHA DE CAMPO 127

128 128

129 129 ANEXO A CERTIFICADO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL DA UFMG

130 130 ANEXO B PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ENVOLVENDO SERES HUMANOS DA SECRETARIA DE SAÚDE DE BELO HORIZONTE

131 131