PALAVRAS-CHAVE: aquecimento ôhmico; caldo de cana; peroxidase; compostos fenólicos; frequência.
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- Mirella Mota Weber
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1 INFLUÊNCIA DA FREQUÊNCIA DO CAMPO ELÉTRICO MODERADO NA INATIVAÇÃO DE PEROXIDASE E NA COMPOSIÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DE CALDO DE CANA TRATADO VIA AQUECIMENTO ÔHMICO B. Brochier 1a, G.D. Mercali 2, L.D.F. Marczak 1b 1-Departamento de Engenharia Química Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Laboratório de Tecnologia de Alimentos CEP: Porto Alegre RS Brasil, Telefone: 55 (51) Fax: 55 (51) a (brochier@gmail.com), b (ligia@enq.ufrgs.br) 2-Departamento de Ciências dos Alimentos Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos CEP: Porto Alegre RS Brasil, Telefone: 55 (51) Fax: 55 (51) (giovana.mercali@ufrgs.br) RESUMO Este estudo investigou os efeitos não térmicos da eletricidade na cinética de inativação enzimática da peroxidase e na degradação de compostos fenólicos totais e de flavonoides totais durante o aquecimento ôhmico de caldo de cana. Foram avaliadas diferentes frequências ( Hz) durante o tratamento térmico a 75 C por 25 minutos. Para isto, os perfis de temperatura durante os processos de aquecimento convencionais e ôhmicos foram igualados. O modelo de distribuição de Weibull descreveu de forma satisfatória a inativação da enzima estudada. A inativação máxima da peroxidase foi de 73 ± 1% sem diferença entre os tratamentos convencional e ôhmico. Além disso, não houve diferença entre diferentes frequências estudadas. O aquecimento ôhmico na frequência de 10 Hz apresentou maior teor de flavonoides (24 ± 1%), enquanto que, para fenólicos totais, os tratamentos a 10 e 60 Hz apresentaram maior teor dos compostos bioativos (retenção acima de 90%) quando comparados com frequências mais altas. É possível que nas frequências mais baixas tenha ocorrido maior hidrólise de fenólicos de cadeia longa, resultando em maior número de moléculas que reagem com o reagente de Folin-Ciocalteau, utilizado na análise de quantificação desses compostos. ABSTRACT This study investigated the non-thermal effects of electricity on peroxidase enzyme inactivation kinetics and on degradation of total phenolic and total flavonoid compounds of sugarcane juice during ohmic heating. Different frequencies ( Hz) were evaluated during the thermal treatment conducted at 75 C for 25 minutes. For this, the temperature profiles during conventional and ohmic heating processes were matched. The Weibull distribution model satisfactorily described the inactivation of the enzyme studied. The maximum peroxidase inactivation was 73 ± 1% with no differences between the conventional and ohmic heating. Moreover, no differences were found between the distinct frequencies evaluated. The ohmic heating at 10 Hz showed higher flavonoids content (24 ± 1%), while for phenolics, at 10 and 60 Hz the retention of compounds (over 90%) was bigger than at higher frequencies. This may be due to greater hydrolysis of long chain phenolic in lower frequencies, which results in greater number of molecules that react with the Folin-Ciocalteu reagent, used for quantification of these compounds. PALAVRAS-CHAVE: aquecimento ôhmico; caldo de cana; peroxidase; compostos fenólicos; frequência. KEYWORDS: ohmic heating; sugarcane juice; peroxidase; phenolic compounds; frequency.
2 1. INTRODUÇÃO O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.), com produção estimada em aproximadamente 691 milhões de toneladas, cultivadas em mais de 9 milhões de hectares na safra de 2016/17 (CONAB, 2016). O caldo extraído da cana-de-açúcar é uma bebida energética, de gosto doce e de baixa acidez; contém vitaminas, minerais e compostos fenólicos, principalmente, ácidos fenólicos e flavonoides (Oliveira et al., 2007; Payet et al., 2006). O processamento e a comercialização do caldo são limitados devido à sua rápida deterioração (Yusof et al., 2000). O desenvolvimento de procedimentos eficazes para manter a qualidade do caldo de cana permitiria maior comercialização e aumentaria sua qualidade e segurança alimentar (Mao et al., 2007). Uma tecnologia emergente na indústria alimentícia é o aquecimento ôhmico (AO). Trata-se de um processo que consiste na passagem de corrente elétrica alternada por um alimento com a finalidade principal de aquecimento pela geração interna de energia. Devido à sua inerente resistência elétrica, o alimento transforma energia elétrica em térmica, promovendo, assim, um aumento de temperatura em seu interior (Resnick, 1996). Essa tecnologia apresenta vantagens em relação aos processos convencionais na indústria, pois permite a manutenção da qualidade nutricional e sensorial e pode possibilitar maior eficiência e rapidez no aquecimento. O AO se distingue de outros métodos de aquecimento elétrico pela presença de eletrodos em contato com o alimento, permitindo assim o controle da frequência e da forma de onda do campo elétrico impostos entre os eletrodos (Castro et al., 2004; Wang e Sastry, 2002). A ação de enzimas naturalmente presentes no caldo de cana, como a peroxidade (POD), promove alterações indesejáveis na cor, na textura, no sabor, no aroma e na composição nutricional. A POD (EC ) possui elevada resistência térmica, sendo, portanto usada em testes padrões de determinação de parâmetros de pasteurização (Jakób et al., 2010). O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do AO, através da aplicação de campo elétrico moderado (MEF) em diferentes frequências, na composição dos compostos fenólicos e na inativação da POD do caldo de cana. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Preparo da Amostra O caldo de cana foi doado por uma propriedade rural situada em Veranópolis / RS. A canade-açúcar de primeiro plantio foi colhida e moída em moenda mecânica. O caldo foi homogeneizado e congelado em sacos plásticos em volumes individuais de 100 ml. Imediatamente antes dos ensaios, as amostras foram descongeladas em banho de água. 2.2 Tratamento Térmico via Aquecimento Ôhmico e Convencional Os experimentos de AO foram realizados no aparato experimental descrito em detalhes por Mercali et al. (2014). A célula ôhmica é composta de um recipiente de vidro encamisado de 250 ml. Os eletrodos de titânio (3,4 cm de altura) são curvados, com distância de 2,8 a 3,7 cm entre si. A temperatura foi medida por um termopar do tipo T. As frequências e a forma de onda senoidal foram obtidas por um gerador e amplificadas para uma tensão de 25 V. Um osciloscópio (Tektronix, TDS 360) foi utilizado para monitorar os parâmetros da onda gerada. Os ensaios cinéticos foram conduzidos a 75 C, nas frequências de 10, 60, 1.000, e Hz. Um aquecimento convencional também foi realizado, utilizando-se água quente na camisa da célula para aquecimento. A Figura 1 apresenta um gráfico da temperatura em função do tempo para os ensaios de aquecimento convencional e ôhmico nas diferentes frequências.
3 Os experimentos foram realizados em triplicata, com 85 g de caldo de cana, agitado em equipamento agitador magnético a 750 rpm. As amostras foram coletadas em nove tempos de aquecimento (0, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 20 e 25 min) e imediatamente colocadas em banho de gelo. Figura 1 Evolução da temperatura durante o aquecimento ôhmico e convencional do caldo de cana. 2.3 Análise da Atividade Enzimática de POD A análise de atividade enzimática foi baseada no protocolo de Chisari et al. (2007). Para o preparo do extrato enzimático, foram misturados em vórtex uma parte de caldo de cana para 4 partes de solução tampão fosfato 0,05 M com ph 7,0. A mistura foi mantida abaixo de 4 C. O extrato enzimático foi centrifugado a rpm por 10 min a 4 C e filtrado em papel filtro qualitativo. A atividade enzimática foi determinada a partir da variação na absorbância em função do tempo (minuto) nas condições de ensaio a 25 C, utilizando-se somente a parte linear da curva para o cálculo. A atividade enzimática após a amostra atingir a temperatura de estudo desejada (tempo zero fase isotérmica) foi considerada a atividade enzimática inicial. O modelo de distribuição de Weibull, apresentado na Equação 1, foi utilizado, através de regressão não-linear (Statistica, versão 13.0), para descrever a cinética de inativação da POD. A/A 0 = exp (-b.t n ) (1) onde A/A 0 é a atividade enzimática residual, t é o tempo de tratamento e b e n são constantes. 2.4 Análise de compostos fenólicos totais e de flavonoides totais O teor de fenólicos totais foi determinado pelo método de Folin-Ciocalteau (Singleton e Rossi, 1965) com curva de calibração feita com ácido gálico. O teor de flavonoides totais seguiu o método colorimétrico de cloreto de alumínio (Yang et al., 2009), com calibração feita com (+)- catequina. Todas as análises foram realizadas em espectrofotômetro (PG Instruments), em triplicata. 2.5 Análise Estatística Os testes t-student, ANOVA e o teste de Tukey foram utilizados para comparação de médias com nível de confiança de 95% (Statistica, versão 13.0).
4 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Atividade Enzimática Residual de POD A Figura 2 apresenta a atividade residual da POD ao longo do tratamento de aquecimento ôhmico e convencional para as frequências estudadas. Avaliando a figura, é possível verificar uma queda na atividade residual para todos os ensaios ao longo do tempo de tratamento térmico. Após 25 minutos de tratamento térmico, foi obtida inativação enzimática máxima de 73 ± 1%. A queda na atividade é explicada pela desnaturação da enzima, que é causada pelo rearranjo e/ou destruição de ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e ligações iônicas da estrutura terciária da proteína. Neste estudo, o efeito da temperatura foi eliminado como variável pela realização de aquecimento convencional (Figura 1) com o mesmo perfil de temperatura aplicado durante o aquecimento ôhmico, atribuindo possíveis diferenças entre os resultados ao efeito não térmico do campo elétrico. De acordo com Castro et al. (2004), a presença de um campo elétrico pode influenciar nas reações bioquímicas pela alteração do espaçamento molecular e aumento de reações intercadeias. Figura 2 Atividade residual de peroxidase ao longo dos tratamentos convencional e ôhmico. Para comparação entre as duas tecnologias de aquecimento e entre as diferentes frequências utilizadas, os dados foram ajustados ao modelo cinético de Weibull. A partir de um ajuste não linear (r 2 acima de 0,984), foram estimados os valores de b (0,12 ± 0,03) e n (0,73 ± 0,07) para todos os ensaios (apresentados na Tabela 1), sugerindo uma degradação contínua da enzima. A análise estatística mostrou que não houve diferença significativa entre os tratamentos utilizando diferentes frequências. Esse resultado demonstra que a velocidade de polarização do campo elétrico não afetou a inativação de POD. Além disso, não houve diferença entre o tratamento convencional e ôhmico (p > 0,05), indicando, portanto, que os efeitos não térmicos devido à presença do campo elétrico não afetam a inativação da enzima. Entretanto, Samaranayake e Sastry (2016) inativaram a enzima pectinametilesterase (PME) de tomates e verificaram que em frequências de 1 e 60 Hz a inativação foi maior do que em frequências mais altas. Isso pode ter ocorrido devido às diferentes condições de MEF e diferenças na estrutura das enzimas. 3.2 Degradação de Compostos Fenólicos A degradação de fenólicos totais e de flavonoides totais ocorreu durante o aquecimento da amostra até chegar a 75 C (tempo zero); as amostras coletadas em 12 e 25 minutos de tratamento mostraram-se estáveis, sem maior degradação do que a obtida no tempo zero. Os dados obtidos no tempo zero são mostrados na Tabela 1, onde os valores fazem referência à amostra in natura.
5 Tabela 1 Parâmetros cinéticos da distribuição de Weibull e teor residual de fenólicos totais e de flavonoides do caldo de cana até chegar ao tempo zero. Tratamento Coeficientes da distribuição de Weibull c Residual (C 0 /C in ) c b n Fenólicos totais Flavonoides Convencional 0,13 ± 0,03 a 0,74 ± 0,08 a 0,66 ± 0,09 b 0,28 ± 0,04 b 10 Hz 0,13 ± 0,02 a 0,69 ± 0,03 a 0,92 ± 0,03 a 0,76 ± 0,01 a 60 Hz 0,093 ± 0,001 a 0,80 ± 0,03 a 0,91 ± 0,02 a 0,382 ± 0,008 b Hz 0,10 ± 0,02 a 0,72 ± 0,07 a 0,77 ± 0,06 ab 0,322 ± 0,003 b Hz 0,10 ± 0,02 a 0,75 ± 0,07 a 0,83 ± 0,02 ab 0,39 ± 0,02 b Hz 0,15 ± 0,01 a 0,68 ± 0,01 a 0,67 ± 0,03 b 0,30 ± 0,04 b c Letras iguais na mesma coluna não apresentam diferença significativa entre si (p > 0.05). Como pode ser observado na Tabela 1, houve maior teor de fenólicos totais nas menores frequências (10 e 60 Hz); enquanto que os flavonoides totais, somente o tratamento a 10 Hz apresentou comportamento diferente dos demais, com maior teor. Esses resultados indicam que as baixas frequências estão influenciando a estabilidade dos compostos fenólicos. Essa influência parece ser induzida pelo campo elétrico, sendo um efeito de natureza não térmica e parece depender da frequência do MEF e do composto em questão. No trabalho de Mercali et al. (2014), foi verificada maior degradação de ácido ascórbico na frequência de 10 Hz possivelmente devido a reações eletrolíticas enquanto que não houve diferença entre os tratamentos de 10 2 a 10 5 Hz. Segundo os autores, em frequências mais baixas ocorrem mais reações eletrolíticas, como corrosão dos eletrodos e eletrólise da água, que liberam metais, hidrogênio e oxigênio no meio, causando, no caso da polpa de acerola, oxidação adicional do ácido ascórbico e de pigmentos. No caldo de cana, os flavonoides majoritários são as flavonas e polímeros de cadeia longa de elevada massa molar, como taninos. Acredita-se que em baixas frequências possa ocorrer a quebra dessas estruturas complexas, liberando fenólicos individuais e / ou produtos de degradação que também podem reagir com o reagente de Folin-Ciocalteau (Guida et al., 2013). Além disso, os efeitos da eletrólise e da corrosão de eletrodos podem ter acelerado a taxa de degradação oxidativa de flavonoides pelo calor através da adição de catalisadores metálicos e radicais livres (Barnes et al., 2013). Esses compostos de hidrólise e degradação são quantificados no método de análise de flavonoides utilizado, contribuindo para o alto valor de flavonoides a baixas frequências. 4. CONCLUSÕES O presente trabalho avaliou o efeito da frequência do campo elétrico na inativação de POD e na estabilidade de compostos fenólicos do caldo de cana. Em geral, não foi observado efeito adicional não térmico na inativação enzimática, indicando que o MEF não alterou a configuração estrutural da POD nas condições trabalhadas. Mesmo assim, o efeito do AO sobre as enzimas e compostos bioativos deve ser melhor investigado, uma vez que o assunto ainda carece de literatura. Em relação aos compostos fenólicos, é possível que, nas frequências de 10 e 60 Hz, tenha ocorrido maior hidrólise de fenólicos de cadeia longa, resultando em maiores teores de compostos bioativos analisados quando comparados aos experimentos com aquecimento convencional ou ôhmico em frequências acima de 60 Hz. Com este estudo pode-se concluir que a tecnologia de AO tem potencial para ser aplicada no tratamento do caldo de cana para inativação enzimática, sem comprometer a concentração de compostos fenólicos antioxidantes se forem utilizadas frequências acima de 100 Hz e materiais adequados para a confecção dos eletrodos.
6 5. AGRADECIMENTOS Ao apoio financeiro recebido da CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), PNPD e CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Barnes, J. S., Foss Jr, F. W., & Schug, K. A. (2013). Thermally Accelerated Oxidative Degradation of Quercetin Using Continuous Flow Kinetic Electrospray-Ion Trap-Time of Flight Mass Spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 24, Castro, I., Macedo, B., Teixeira, J. A., & Vicente, A. A. (2004). The Effect of Electric Field on Important Food-processing Enzymes: Comparison of Inactivation Kinetics under Conventional and Ohmic Heating. Food Chemistry and Toxicology, 69, Chisari, M., Barbagallo, R. N., & Spagna, G. (2007). Characterization of Polyphenol Oxidase and Peroxidase and Influence on Browning of Cold Stored Strawberry Fruit. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, Companhia Nacional de Abastecimento CONAB. (2016). Acompanhamento da safra brasileira de cana-de-açúcar. v. 3 Safra 2016/17. Disponível em: < >. Guida, V., Ferrari, G., Pataro, G., Chambery, A., Di Maro, A., & Parente, A. (2013). The effects of ohmic and conventional blanching on the nutritional, bioactive compounds and quality parameters of artichoke heads. LWT - Food Science and Technology, 53(2), Jakób, A., Bryjak, J., Wójtowicz, H., Illeová, V., Annus, J., & Polakovic, M. (2010). Inactivation kinetics of food enzymes during ohmic heating. Food Chemistry, 123, Mao, L. C., Xu, Y. Q., & Que, F. (2007). Maintaining the quality of sugarcane juice with blanching and ascorbic acid. Food Chemistry, 104, Mercali, G. D., Schwartz, S., Marczak, L. D. F., Tessaro, I. C., & Sastry, S. (2014). Ascorbic acid degradation and color changes in acerola pulp during ohmic heating: Effect of electric field frequency. Journal of Food Engineering, 123, 1 7. Oliveira, A. C. G., Spoto, M. H. F., Canniatti-Brazaca, S. G., Sousa, C. P., & Gallo, C. R. (2007). Efeitos do processamento térmico e da radiação gama na conservação de caldo de cana puro e adicionado de suco de frutas. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 27(4), Payet, B., Sing, A. S. C., & Smadja, J. (2006). Comparison of the concentrations of phenolic constituents in cane sugar manufacturing products with their antioxidant activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, Reznick, D. (1996). Ohmic heating of fluid foods: Ohmic heating for thermal processing of foods: Government, industry, and academic perspectives. Food Technology, 50, Samaranayake, C. P., & Sastry, S. K. (2016). Effects of controlled-frequency moderate electric fields on pectin methylesterase and polygalacturonase activities in tomato homogenate. Food Chemistry, 199, Singleton, V. L., & Rossi, J. A. (1965). Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdicphosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture, 16, Wang, W. C., & Sastry, S. K. (2002). Effects of moderate electrothermal treatments on juice yield from cellular tissue. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 3, Yang, J., Martinson, T. E., & Liu, R. H. (2009). Phytochemical profiles and antioxidant activities of wine grapes. Food Chemistry, 116, Yusof, S., Shian, L. S., & Osman, A. (2000). Changes in quality of sugarcane juice upon delayed extraction and storage. Food Chemistry, 68,
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