Controle Biológico e Microbiológico de Qualidade de Medicamentos (FFI 402) CONTROLE MICROBIOLÓGICO DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS
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1 Controle Biológico e Microbiológico de Qualidade de Medicamentos (FFI 402) CONTROLE MICROBIOLÓGICO DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS Prof as Yraima Cordeiro e Ana Luisa P. Miranda
2 Produtos não-est estéreis Conceito: Objetivos: Admite-se carga microbiana limitada; (cosméticos, formulações de uso tópico e orais). Determinar a carga microbiana presente no produto; (qualitativo/quantitativo). Comprovar a ausência de m.o patogênicos e determinar o número de m.o viáveis em função do tipo de utilização. Agentes infectantes oportunistas (m.o saprófitas); Cepas patogênicas (proibitivos); Pessoas imunossuprimidas; Comprometer a estabilidade do produto, perda da eficácia terapêutica.
3 Fatores necessários à adequação dos níveis n de m.o no produto terminado Fatores diretos de contaminação: água, matérias-primas e material de acondicionamento. Fatores indiretos: limpeza, instalações inadequadas, pessoal não paramentado ou submetido a exames periódicos Fatores que contribuem para ou da carga microbiana: a) Fórmula: ptn e carboidratos sacarose, sorbitol, propilenoglicol b) ph: Neutro ( m.o), ácidos e alcalinos ( m.o) b) Atividade da água: incorporação de conservantes c) Processo: Temperatura elevadas
4 Padrões microbianos em produtos não estéreis Primeiro insumo farmacêutico com especificação relativa à qualidade microbiológica: gelatina, USP XII 1942 (10 4 bactérias totais por grama); Hoje: 10 3 /g e ausência de patógenos específicos em 10g (USP XVIII). Variações em função da origem da matéria prima, uso final, via de administração. No Brasil: limite para levedura seca (2ª Edição), 7,5 x 10 3 bct/g e 50 fungos/g Fitoterápicos: (Portaria 123, 1994) Especificação para matérias primas vegetais: < 10 5 /g do total de viáveis; < 10 4 /g fungos; < 10 3 /g enterobactérias; ausência de Salmonella sp., S. aureus, P. aeruginosa, E. coli e Aspergillus. Atualmente (outubro 2009): orientações aplicáveis a quaisquer formas farmacêuticas; presença de mos totais e patogênicos.
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6 Para cosméticos, CTFA: seus padrões são referência internacional: - Tolerância de não mais que 500 UFC/g em produtos para bebês e para a área dos olhos e < 10 3 UFC/g para todos os outros. E nenhum produto deve conter conteúdo microbiano nocivo para o usuário.
7 Produtos cosméticos (ANVISA 1997, padrão proposto Grupo de Microbiologia da Associação Brasileira de Cosmetologia) Tipo I: produtos para uso infantil, para área dos olhos, e para os que entram em contato com mucosa; Tipo II: demais produtos susceptíveis à contaminação. Tipo I: < 10 2 UFC/g de mo totais aeróbios, ausência de Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus aureus, coliformes totais e fecais em 1g(mL); ausência de clostrídios sulfito-redutores também em 1g (talco); Tipo II: difere do acima no limite de aeróbios, < 10 3 UFC/g. Resolução Nº 481, de 23 de setembro de 1999 (ANVISA)
8 Resolução Nº 481, de 23 de setembro de 1999 ÁREA DE APLICAÇÃO E FAIXA ETÁRIA LIMITES DE ACEITABILIDADE TIPO I PRODUTOS PARA USO INFANTIL PRODUTOS PARA ÁREA DOS OLHOS PRODUTOS QUE ENTRAM EM CONTATO COM MUCOSAS a.contagem de microorganismos mesófilos totais aeróbios, não mais que 10 2 UFC/g ou ml Limite máximo: 5 x 10 2 UFC/g ou ml b.ausência de Pseudomonas aeruginosa em 1g ou 1ml; c.ausência de Staphylococcus aureus em 1g ou 1ml; d.ausência de Coliformes totais e fecais em 1g ou 1ml; e.ausência de Clostrídios sulfito redutores em 1g (exclusivamente para talcos). TIPO II DEMAIS PRODUTOS COSMÉTICOS SUSCEPTÍVEIS A CONTAMINAÇÃO MICROBIOLÓGICA a.contagem de microorganismos mesófilos totais aeróbios, não mais que 10 3 UFC/g ou ml; Limite máximo: 5 x 10 3 UFC/g ou ml b.ausência de Pseudomonas aeruginosa em 1g ou 1ml; c.ausência de Staphylococcus aureus em 1g ou 1ml; d.ausência de Coliformes totais e fecais em 1g ou 1ml; e.ausência de Clostrídios sulfito redutores em 1g (exclusivamente para talcos).
9 Métodos de análise Envolvem tanto os medicamentos não estéreis quanto os cosméticos, abrangem três etapas fundamentais: 1. Amostragem, englobando coleta; 2. Transporte e preparo da amostra para análise; 3. Determinação numérica ou contagem das formas viáveis.
10 1. Amostragem: Deve ser representativa Critérios para obtenção da amostra: Sacos e barricas (pulverizados) fração da parte superior, inferior e mediana. N ou N +1, N = n o total recipientes Assepsia na área próxima, vedação, líquidos Coleta e Transporte Temperatura adequada, material limpo, recipiente de boca larga (capacidade para 100g(mL). Quantidade a ser analisada 10g(ml) 1g(ml)
11 Preparo da amostra Presença de conservante Inativação do conservante; Ajuste do ph; Homogeneização da amostra; Sabonetes e supositórios (fragmentação e aquecimento).
12 2. Métodos M de Contagem Microbiana Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade (pour plate); Em meio sólido, com semeadura da amostra em superfície; Membrana filtrante; Número mais provável.
13 2. Métodos de Contagem Microbiana Meio sólido com semeadura da amostragem em profundidade (pour plate) ou em superfície (spread plate) 10 g (ml) 1-2 ml 1-2 ml 3-5 dias (30-35 C, bactérias) Ágar caseínasoja/ágar nutriente Ágar Sabourauddextrose/ágar batata (Tampão fosfato ou NaClpeptona ph 7,2) 1: dias (20-25 C, fungos) Limitação (Pour Plate): amostras q conferem opacidade ao meio, UFC/mL < 1 Limitação (Spread Plate): carga microbiana < 2 UFC/mL(g)
14 Método spread plate harmonizado Adicionar em duplicata 0,1 ml no TSA e SDA e espalhar nas superfícies dos meios prontos. Contar as placas com crescimento com menos 250 colônias para TAMC e menos que 50 colônias para TYMC.
15 Método pour plate harmonizado Adicionar 1 ml da diluição na placa (90 mm) e adicionar 15 a 20 ml de meio TSA e SDA em duplicata. Incubar TSA o C por 3 a 5 dias. Incubar SDA o C por 5 a 7 dias Contar as placas com crescimento com menos 250 colônias para TAMC e menos que 50 colônias para TYMC.
16 Membrana filtrante: Alíquotas (líquida), filtração através de membranas. Depositadas nas placas 1. Filtração (membrana nitrato ou acetato de celulose 0,45 µm) 10mL ou 1g amostra (passagem membrana). Diluir se necessário contagem entre 10 e 100 colônias. Lavar; 1 membrana (para cada meio) Bactérias Leveduras/Fungos n colônias desenvolvidas; Cálculo UFC/g ou ml da amostra. Permite avaliar volumes elevados, amostras contendo agentes antimicrobianos.
17 Método harmonizado Transferir quantidade validada para dois filtros. Lavar cada filtro com método validado; Depositar um filtro em TSA e outro em SDA; Incubar TSA o C por 3 a 5 dias. Incubar SDA o C por 5 a 7 dias.
18 2. Métodos de Contagem Microbiana Incubação Contagem das colônias Cálculos TAMC TYMC 4 / 2 Contador / Lupa / Iluminação artificial/ Contador / Registrador 4/2 = 2 Fator de Diluição: 10 20UFC/mL 1/2 = 0,5 Fator de Diluição: 10 <10UFC/mL
19 Contagem Spiral plate
20 Número mais Provável vel Estimativa fundamentada em probabilidade; Diluição seriada em tubos contendo meio de cultura e observação do crescimento. 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Inóculo sem diluição 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Diluição do ensaio Amostra inoculada Tubos com todos Crescimento depois da incubação Sem crescimento
21 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Inóculo sem diluição 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml [3 2 0] 0 Confrontar dados com tabelas estatísticas específicas Imprecisão maior que os outros métodos; Permitir maior revitalização dos mais debilitados; Práticas para amostras pouco solúveis e translúcidas; Útil quando se espera valores baixos de contagem.
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23 Método harmonizado, NMP Preparar pelo menos 3 séries com 3 tubos. 3 alíquotas de 1 g ou 1 ml são inoculados em 3 tubos com 9 a 10 ml de TSB. O mesmo para outras diluições. Incubar todos os tubos não mais do que 3 dias. Determinar o NMP na tabela (só TAMC).
24 Determinar a adequação do método m de contagem Determinar se o método permite a detecção de mos na presença do produto. Usar <100 UFC do organismo a ser inoculado; Recuperação deve estar dentro de 50%; TAMC = Total aerobic microbial count (no TSA, incluindo fungos) TYMC = Total combined yeast/mould count (no Sab.4%-Dextrose Agar, incl. bactérias)
25 Critérios rios de aceitação de qualidade microbiológica para formulações não estéreis Via de administração TAMC UFC/g TYMC UFC/g Organismos especificados: Ausência em 1g ou ml Preparações não aquosas de uso oral E. coli Preparações aquosas de uso oral E. coli Uso inalatório (prep. Líquidas para nebulização) S. aureus/ P. aeruginosa/ BG (-) bile-tolerante *BP 2008 harmonizado
26 Pesquisa de Patógenos Específicos Antes da harmonização Principais patógenos pesquisados (devido a sua presença indesejada) nas formulações farmacêuticas. Pseudomonas aeruginosa (prep. tópicas, colírios, regiões próximas aos olhos) Staphylococcus aureus (tópicos em geral) E. coli (orais) Salmonella sp (orais) Coliformes
27 Harmonização Escherichia coli Salmonella spp Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Clostridium sp. Gram (-) bile-tolerantes Candida albicans
28 Testes de promoção de crescimento Validação de meios de cultura; Utilizar cepas referência de coleções de culturas; Níveis de inóculo < 100 UFC. Recuperação deve ser com um fator de 2 do controle (95% limite de confiança para NMP). Controle negativo (condições de esterilidade).
29 Procedimento Meios de Enriquecimento Produtividade x Especificidade Caldo lactose (Salmonella sp. e E. coli) 10 g (ml) 100 ml Caldo caseína-soja (S. aureus e P. aeruginosa). Incubação a 36 ± 1 o C de 24 a 48h. Diferenciação: identificação do microorganismo Transferir alíquotas dos meios de enriquecimento para meios de cultura de isolamento e diferenciação.
30 Meios de diferenciação Meios de enriquecimento e seleção Staphylococcus aureus (método harmonizado, 2008): Caldo caseína-soja (TSB) o C, 18-24h Subculturas em ágar Manitol (colônias amarelas, halo amarelo) o C, 18-72h Confirmar por identificação.
31 Pseudomonas aeruginosa (HARMONIZADO) TSB, 18-24h; Subculturas em Ágar Cetrimida colônias esverdeadas com fluorescência (18-72h); Ensaio de oxidase; Confirmar por identificação.
32 Escherichia coli (HARMONIZADO): Diluição do produto ( 1g ou 1mL) em TSB (30-35 o C, 18-24h); Transferir 1,0mL do TSB para 100mL de Caldo MacConkey (42-44 o C, 24-48h); Subcultivo em placa com ágar MacConkey (30-35 o C, 18-72h); Confirmar por identificação. Fermentadores x não fermentadores de lactose
33 Salmonella sp (HARMONIZADO): Diluição do produto ( 10g ou 10mL) em TSB (30-35 o C, 18-24h); Transferir 0,1mL do TSB para 10mL de RVSEB (30-35 o C, 18-24h); Subcultivo em meio ágar xiloselisina-desoxicolato (XLD) (30-35 o C, 18-48h) - colônias vermelhas, núcleo negro. Confirmar por identificação.
34 Clostridium sp (HARMONIZADO): Diluição do produto ( 1g ou 1mL) em TSB (20-25 o C, 2-5h); Usar o volume de TSB correspondente a 1g do produto em 2 porções iguais; Aquecer 1 parte a 80 o C por 10min; Transferir 10mL das alíquotas para 2 frascos com meio reforçado para Clostridia (crescimento em anaerobiose de 30 a 35 o C, 48h); Subcultivo de cada tubo em ágar Columbia (anaerobiose de 30 a 35 o C, 48h); Teste da catalase (é catalase -), e só pode apresentar crescimento anaeróbico.
35 Candida albicans (HARMONIZADO): Inocular 10mL de uma diluição 1:10 do produto ( 1g ou 1mL) em 100mL SDB, (30-35 o C, 3-5 dias); Subcultivo em placa SDA (30-35 o C, 24-48h); Confirmar por identificação.
36 Provas adicionais Capacidade de fermentação de diferentes açúcares; Aproveitamento de sais amoniacais como única fonte de nitrogênio; Uso do citrato como única fonte de carbono (Ágar Citrato); Formação de acetoína (reação de Voges-Proskauer); Reação da peroxidase, coagulase, etc; Detecção de micoplasma, micotoxinas. Uso de métodos automatizados e miniaturizados para identificação.
37 Água na Indústria Limites de alerta e de ação. Padrões microbianos: os níveis de carga microbiana para água de uso industrial (bulk) inexistem, exceto ao se referir à água estéril. Situação contornada por cada empresa pela adoção do seu próprio padrão interno. Potabilidade: legislações e pré-requisitos variados nos diversos países. FEuropeia limite de ação para AP (100mos/100mL) e ApI (10mos/100mL) USP, água bulk ou acondicionada como produto.
38 Água na Indústria Tipos de água, RDC 17, Água Purificada limite de ação 100UFC/mL Água Purificada Estéril água purificada esterilizada em embalagem apropriada. Água Estéril para Injeção água para injeção acondicionada e esterilizada. Diluente para produtos parenterais; Água Estéril para Irrigação ~AEI, especificação não inclui material particulado; Água Estéril para Inalação Água para injeção esterilizada em embalagem apropriada. Cumpre com os requisitos da APE, exceto quanto ao ph, que deve estar entre 4,5 e 7,5. Água Bacteriostática para Injeção reconstituição de injetáveis de dose múltipla a partir do mesmo frasco. Água para injeção (bulk).
39 Análise da água Potabilidade característica depende da legislação de cada país. Principais indicadores de contaminação fecal: Coliformes totais: bacilos Gram (-) não esporulados, aeróbios ou anaeróbios facultativos, fermentam a lactose a o C de 24 a 48h com produção de gás. Espécies dos gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella (obs. Enterobacter se multiplica no ambiente livre). Coliformes fecais ou termotolerantes: fermentam lactose a 44,5 ± 0,2 o C 24h. Seguramente somente a Escherichia coli. ICFs: mos presentes nas fezes em quantidade >> q patogênicos.
40 Estreptococos fecais: origem da contaminação, predomina nas fezes de animais; distância da fonte de contaminação; Clostridium perfringens: esporulado, indicador de contaminação fecal muito remota; Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, C. albicans: indicativos de tratamento não eficiente, pequeno tempo de sobrevida, presença associada à condição de higiene.
41 Padrões microbianos MS, Portaria 36, 19/01/1990 MS, Portaria 518, 25/03/2004 Água potável: ausência de E. coli ou coliformes termotolerantes em 100mL; Água na saída de tratamento: ausência de coliformes totais em 100mL; Reservatórios e rede de distribuição: ausência de E. coli ou coliformes termotolerantes em 100mL. Quando cianobactérias > céls/mL: análise semanal de cianotoxinas na água na saída do tratamento, na entrada de clínicas de hemodiálise e indústrias de injetáveis; Recomenda-se avaliar heterotróficos indicativos das condições de higiene.
42 Análise bacteriológica da água: determinação quantitativa Coleta frasco estéril, desprezar a 1ª amostra, e mantê-la a 10 o C se não analisar de imediato. Para amostras cloradas, adicionar tiossulfato de sódio (0,1mL de solução a 10% para 100mL de água). Contagem de viáveis totais valor absoluto sem significado, controle somente sobre variação esperada, índice das condições de higiene.
43 Identificação de coliformes totais e fecais: Teste presuntivo: detecção de microorganismos que fermentem a lactose. Uso de caldos Lactose ou Lactose-SDS em tubos de Durham invertidos. Formação de gás, resultado + Membrana filtrante (meio Endo), colônias escuras, brilho metálico +.
44 Teste confirmatório: há mos que não os coliformes que podem fermentar a lactose como bacilos Gram (+) esporulados e leveduras. Transferir amostras dos tubos + para tubos contendo meio seletivo Caldo Bile-Verde Brilhante que contém corante que impede proliferação de formas esporuladas e leveduras e componente que favorece proliferação de coliformes. O resultado é também a produção de gás a partir da fermentação da lactose.
45 Escherichia coli: caldo EC (lactose, proteases e sais biliares) Incubação a 44,5 o C. Em todas as etapas a contagem é realizada pela técnica de NMP, considerando a resposta positiva a fermentação da lactose.
46 Controle da água na indústria Métodos alternativos Custo x benefício Contagem direta de células marcadas com fluoróforos: coloração com marcadores fluorescentes (para ácidos nucleicos). Nível detecção mo (viáveis x não viáveis), 2h. ATP, luciferina, luciferase: detecção de qualquer tipo de microorganismo (limitação < UFC) (MicroCount TM digital, pré incubação 24h.)
47 Automação e métodos alternativos para enumeração microbiana Contadores em espiral ( tempo e material) (4 x 10 2 a 4 x 10 5 UFC); AutoPlate 4000 (Spiral Biotech, USA) e ProtoCOL (Symbiosis, UK); Petrifilm e SimPlate, subtituição do crescimento tradicional em placa com ágar sólido; Bioluminescência; Epifluorescência direta (DAPI ou alaranjado de acridina); Impedância: resistência ao fluxo de uma corrente alternada, que passa através de material condutor. Equipamentos disponíveis no mercado: Bactometer (BioMerieux) e Malthus AT automatizados e avaliam > 100 amostras simultaneamente. Análise de quantidades grandes de amostra (de 10 a 100mL), sensibilidade.
48 Métodos rápidos para identificação microbiana Sistemas miniaturizados e automatizados (exs. API e Vitek, BioMerieux Inc.). Identificação genotípica: PCR, eletroforese de fragmentos de DNA. Cromatografia gasosa (Hewllet Packard) esterificação de ácidos graxos produzidos pelo metabolismo de mos. Identificação de cepas microbianas a partir de metabólitos específicos. Métodos imunológicos.
49 BD BBL Crystal - Sistema de Identificação de Microorganismos Clinicamente Relevantes
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