TESTE DE ESTERILIDADE
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- Flávio Palma de Miranda
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Análises Farmacopeicas PFA 029 Divisão do Controle de Qualidade Biológico TESTE DE ESTERILIDADE Tiago Assis Miranda Junho de
2 Fatores que afetam a eficácia da esterilização A atividade dos agentes esterilizantes depende de inúmeros fatores, alguns deles: Número e localização de microrganismos. Resistência inata dos microrganismos. Concentração e potência do agente germicida. Fatores físicos e químicos. Duração da exposição.
3 Definição Teste de segurança biológica, estabelecido para se comprovar a ausência total de contaminação por micro-organismos, em produtos estéreis. não é doseamento! não é identificação! é um teste destrutivo! é um teste qualitativo!
4 Objetivos Assegurar um produto livre de contaminação microbiana. Determinar a eficiência dos processos de esterilização.
5 Indicação Injetáveis de qualquer via. Colírios e pomadas oftálmicas. Preparações para queimaduras e ulcerações graves. Preparações para aplicação em cavidades corporais. Material para implantes e próteses. Seringas, agulhas, material cirúrgico, gaze,algodão, bandagem, suturas, material para transfusão.
6 Extrapolação dos resultados Contaminação não-uniforme. Níveis baixos de contaminação. Cumprimento das BPF. Contaminação no envase asséptico.
7 Cuidados na realização do teste Áreas assépticas (sala limpa): capela de fluxo laminar ou câmara asséptica; Pessoal treinado e paramentado
8 Meios de cultura Devem ser esterilizados em autoclave (comprovar com uso de bioindicadores). Devem permitir o crescimento de uma larga gama de micro-organismos. Meio Tioglicolato fluido Caseína-soja Especificidade Temperatura de incubação Tempo de incubação Bactérias anaeróbicas, aeróbicas Bactérias aeróbicas, fungos e leveduras 30 a 37 o C 20 a 25 o C 7 ou 14 dias 7 ou 14 dias ph ótimo 7,1 0,2 7,3 0,2
9 Meios de cultura
10 Meios de cultura No. Tipo Aplicação Anaeróbios embora possa I Tioglicolato fluido promover o crescimento de aeróbios, fungos e leveduras. II Tioglicolato com 1% de penicilinase Em produtos contendo penicilina. III Tioglicolato com 1% de polissorbato 80 Em pomadas oftálmicas. IV Tioglicolato com 0,5% de azolectina e 0,4% de polissorbato 80 Produtos que requeiram a inativação de substâncias inibidoras. V Caseína-soja fluido Aeróbios, fungos e leveduras. VI Caseína-soja com 1% de penicilinase Idem, Idem II VII Caseína-soja com 1% de polissorbato 80 Idem, Idem III VIII Caseína-soja com 0,5% de azolectina e 0,4% de polissorbato 80 Idem, Idem IV
11 Critérios de amostragem A segurança do resultado final do teste será tanto maior quanto maior for a quantidade das amostras ensaiadas. Entretanto há problemas de ordem econômica e prática, justificando o estabelecimento de critérios de amostragem. A amostragem deve ser representativa do lote da amostra.
12 Critérios de amostragem (F. Bras IV) Deve ser, no mínimo, de 20 unidades ou 10% do número de unidades que constituem o lote, se este for inferior a 199 unidades. Para líquidos seguir uma tabela de amostragem. Para os demais produtos, seguir a determinação contida em tópicos específicos na Farmacopeia.
13 Volume total de produto (ml) Critérios de amostragem (F. Bras IV) Amostragem para produtos líquidos: Volume mínimo a ser inoculado em cada meio (ml) Volume mínimo de cada meio (ml) Inoculação direta Inoculação indireta Nº mínimo de amostras a serem testadas Menos de 10 1 ou o conteúdo total se < a < a < a 500 todo o conteúdo * acima de *
14 Critérios de amostragem (F. Bras IV) Amostragem de matéria-prima: Nº total de recipientes Nº de recipientes abertos do lote para teste 1 a 3 Todos 4 a a a a a a a a a
15 Critérios de amostragem (USP,EP,JP) Considera o número de unidades do lote, o conteúdo declarado e a natureza do produto. Número de unidades no lote Número de unidades a serem testadas Algodão, gaze, ataduras, suturas, etc < 100 unidades 10% ou 4 unidades (o que for maior) 100 a < 500 unidades 10 unidades > 500 unidades 2% ou 20 unidades (o que for maior) Produtos sólidos a granel Até 4 unidades cada unidade De 4 a < 50 unidades 20% ou 4 unidades (o que for maior) > 50 unidades 2% ou 10 unidades (o que for maior)
16 Critérios de amostragem (USP,EP,JP) Número de unidades no lote Número de unidades a serem testadas Injetáveis ou pó para injetáveis < 100 unidades 10% ou 4 unidades (o que for maior) de 100 a 500 unidades 10 unidades >500 unidades 2% ou 20 unidades (o que for menor) Parenterais de grande volume 2% ou 10 unidades (o que for menor) Antibióticos sólidos Frascos com capacidade < 5 g 20 unidades Frascos com capacidade 5 g 6 unidades Produtos não-injetáveis < 200 unidades 5% ou 2 unidades (o que for maior) 200 unidades 10 unidades
17 Critérios de amostragem (USP,EP,JP) Quantidade por unidade Quantidade mínima a ser inoculado em cada meio Líquidos (que não antibióticos) menos que 1 ml todo o conteúdo 1 a 40 ml 50%, mas não menos que 1 ml > 40 e < 100 ml 20 ml 100 ml 10%, mas não menos que 20 ml Antibióticos Qualquer capacidade 1 ml Outras preparações solúveis em água ou miristato de isopropila Qualquer capacidade todos os conteúdos até somar não menos que 200 mg Preparações insolúveis, cremes e pomadas Qualquer capacidade todos os conteúdos até somar não menos que 200 mg
18 Critérios de amostragem (USP,EP,JP) Quantidade por unidade Produtos sólidos Quantidade mínima utilizada < 50 mg todo o conteúdo 50 mg e < 300 mg 50%, mas não menos que 50 mg 300 mg 5 g 150 mg > 5 g 500 mg Algodão, gaze, ataduras, suturas, etc Algodão / Gaze / Vestimentas Suturas e materiais de uso único Outros aparelhos 100 mg por pacote todo o material todo o material, em pedaços ou desmontado
19 Testes preliminares Teste de esterilidade dos meios de cultura (controle negativo): verificação da esterilidade dos meios utilizados e da eficiência da esterilização. Incubar por no mínimo 7 dias (FB 5: 14 dias) cada lote dos meios de cultura esterilizados nas condições especificadas (não há inoculação de branco). Evitar ocorrência de falso-positivo. Resultado esperado: NÃO DEVE HAVER CRESCIMENTO
20 Testes preliminares Teste da capacidade de crescimento (controle positivo): Verificação da capacidade dos meios de promover o crescimento de micro-organismos. Incubar, em duplicata, por 7 dias, (FB 5: se bactérias, 3 dias; se fungos, 5 dias) tubos de cada meio de cultura esterilizado contendo de 50 a 100 UFC de cada cepa microbiana. Evitar ocorrência de falso-negativo. Resultado esperado: DEVE HAVER CRESCIMENTO
21 Caseínasoja Tioglicolato Testes preliminares Microorganismos recomendados para o teste da capacidade de crescimento: Meio Microorganismo Cepa Staphylococcus aureus ATCC 6538 Incubação (7 dias) Temperatura Condições aeróbica Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 aeróbica Clostridium sporogenes ATCC ,5 2,5 o C anaeróbica Candida albicans (ausente na FB 5) ATCC Bacillus subtilis ATCC 6633 aeróbica aeróbica Candida albicans ATCC ,5 2,5 o C aeróbica Aspergillus niger ATCC aeróbica
22 Métodos de inoculação O teste de esterilidade pode ser realizado de duas maneiras diferentes: inoculação direta ou inoculação indireta (filtração por membrana). A escolha da técnica é justificada pela facilidade de operação, disponibilidade de equipamentos, eficiência desejada e limitações econômicas. Há casos em que a monografia farmacopeica especifica o método a ser utilizado.
23 Métodos de inoculação De qualquer forma, é importante realizá-los em condições assépticas de forma que a amostra não se contamine durante o teste. Os recipientes a serem utilizados no teste devem ser limpos externamente com agentes antissépticos. Em ambos os métodos deve ser realizado o controle negativo e o controle positivo. Em ambos inocula-se nos meios de tioglicolato fluido e caseína soja.
24 Métodos Inoculação direta Contato direto do produto com o meio de cultura. Introdução de volume pré-estabelecido do produto diretamente no meio de cultura esterilizado. Incubação por 14 dias em condições assépticas. A preparação das amostras e a realização dos ensaios dependem da natureza e do tipo de produto a ser testado.
25 Métodos Inoculação direta Líquidos - retirar com pipeta ou seringa e agulha estéreis, transferir para os tubos contendo os respectivos meios de cultura. Sólidos - transferir na forma de pó, em suspensão ou diluído com diluente estéril para os tubos contendo os meios. Pomadas e óleos insolúveis em miristato de isopropila: utilizar tensoativo (Tween 80). Amostras solúveis devem ser analisadas por filtração em membrana.
26 Métodos Inoculação direta Algodão, gaze, bandagem, suturas e material cirúrgico: colocar porções dos artigos em contato direto com o meio de cultura. Equipamentos estéreis: sempre que possível, imergir em não mais do que 1000 ml de meio. Seringas: separar o êmbolo do corpo da seringa e colocar cada parte em um meio.
27 Métodos Inoculação direta
28 Métodos Inoculação indireta Não há contato direto do produto com os meios. Filtra-se a amostra em membrana, lava-se a membrana e inocula no meio de cultura esterilizado. A membrana é seccionada e cada metade é transferida para um dos meios. Segundo a F. Bras. IV, incuba-se por pelo menos 7 dias (na FB 5, é recomendado incubar por 14 dias).
29 Métodos Inoculação indireta O fluido de lavagem serve para eliminar resíduos da amostra na membrana, ele deve ser estéril e seu preparo é descrito na farmacopeia. F. Bras. IV USP Fluido I A água peptonada ph 7,0 II D água peptonada ph 7,0 + tween 80 0,1% III K água peptonada + extrato de carne + tween 80 1% - ph 7,0 Para penicilinas/cefalosporinas, o fluido I (A) é acrescido de -lactamase.
30 Métodos Inoculação indireta Líquidos miscíveis em veículo aquoso: filtrar o produto e lavar a membrana com pelo menos 3 porções de 100 ml de fluido I. Líquidos imiscíveis em veículo aquoso: mesmo que o anterior, porém utiliza-se o fluido II. Sólidos solúveis (filtráveis): solubilizar em fluido adequado e continuar o procedimento. Equipamentos: utilizar o fluido II.
31 Considerações sobre inoculação indireta Não há contato direto do produto com os meios de cultura, evitando formação de turvação. O efeito bacteriostático/fungistático pode ser eliminado por lavagens da membrana. Deve-se determinar o número de lavagens para eliminar os interferentes. Possibilidade de concentrar os micro-organismos.
32 Considerações sobre o método indireto A técnica é mais sensível. Usa-se menor número de tubos e volume de meio na realização do teste; IMPORTANTE: deve-se realizar controle negativo da membrana e do fluido de lavagem.
33 Casos especiais Turvação No método direto, pode ocorrer incompatibilidade físicoquímica do produto com os meios de cultura. A presença turvação do meio interferir na avaliação visual do resultado. Entre o 3º e 7º dia após o início do período de incubação, retirar alíquota de 0,5 a 1,0 ml de todos os tubos que turvaram e transferir para outros tubos contendo o mesmo meio e prosseguir na incubação.
34 Casos especiais Bacteriostase/Fungistase Alguns produtos possuem constituintes com atividade antimicrobiana. Deve-se avaliar sua interferência no resultado do teste de esterilidade, para evitar falsonegativo. Para o método de filtração em membrana: Filtrar a quantidade especificada da amostra e lavar a membrana com três porções de 100 ml do fluido de lavagem adequado. Inocular não menos que 100 UFC na última lavagem.
35 Casos especiais Bacteriostase/Fungistase Para o método de filtração em membrana (cont.): Repetir o procedimento em outro filtro que não tenha sido exposto à amostra (controle positivo). Proceder ao ensaio, incubando os filtros nos respectivos meios por não mais que 7 dias. Para o método direto: Inocular não mais de 100 UFC em dois tubos de cada meio e adicionar a amostra em um tubo de cada meio. Incubar por não mais de 7 dias.
36 Casos especiais Bacteriostase/Fungistase Interpretação: Quando o crescimento de micro-organismos for visualmente comparável com o controle positivo, o efeito Bacteriostático/Fungistático não se manifestou. Quando o crescimento de micro-organismos não for visualmente comparável com o controle positivo, o efeito Bacteriostático/Fungistático se manifestou. Deve-se eliminar esse efeito!
37 Neutralização dos conservantes Conservante Neutralizante Formaldeído Histidina 0,1% Produtos que liberam cloro Tiossulfato de sódio 0,5% Sais de amônio quaternário Tween 80 a 3% + Lecitina 0,3% Fenóis e derivados Tween 80 a 1% Tensoativos anfóteros Tween 80 a 3% + Lecitina 0,3% Metais pesados, orgânicos e ionizados Cisteína a 0,1%
38 Inativação dos antibióticos Fármacos antimicrobianos Penicilina Neomicina Estreptomicina Sulfonamidas Inativadores específicos -lactamase cloreto de sódio ou ácido ascórbico cloridrato de cisteína ácido p-aminobenzóico
39 Avaliação do teste Verificação de crescimento microbiano. Verificação da necessidade de reteste.
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