VARIAÇÕES MORFOLÓGICAS E ESTRUTURAIS NA SUPERFÍCIE DA LIGA TI-6AL-4V PELA APLICAÇÃO DE PULSOS DE CORRENTE DURANTE A ANODIZAÇÃO
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- Herman Fagundes Fortunato
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1 VARIAÇÕES MORFOLÓGICAS E ESTRUTURAIS NA SUPERFÍCIE DA LIGA TI-6AL-4V PELA APLICAÇÃO DE PULSOS DE CORRENTE DURANTE A ANODIZAÇÃO E.L.S. Santos 1, G.E. Campos 1, M.C. Pereira 2, N. N. Regone 3, L.M.R. Vasconcellos 1, E. N. Codaro 2, H. A. Acciari 2* 1 Instituto de Ciência e Tecnologia - UNESP, São José dos Campos, SP 2* Faculdade de Engenharia - UNESP, Guaratinguetá, SP. Av. Dr. Ariberto Pereira da Cunha, CEP , heloisa@feg.unesp.br 3 Campus Experimental de São João da Boa Vista - UNESP, SP RESUMO A anodização com pulsos de corrente pode ser uma escolha viável para induzir a formação de um filme espesso e poroso de TiO 2 na superfície do titânio e de suas ligas, mesmo a baixos potenciais. Neste trabalho, esta técnica foi realizada em amostras de Ti-6Al-4V, visando aplicação futura em implantes ortopédicos. A imagem obtida por microscopia eletrônica de varredura revelou a presença de poros uniformemente distribuídos por toda a superfície anodizada, com diâmetros de aproximadamente 2 m. Células osteogênicas cultivadas sobre as superfícies das amostras controle e anodizada foram analisadas quanto à citotoxicidade celular (teste de MTT) e formação de matriz mineralizada. Os resultados evidenciaram maior índice de células viáveis aos 10 dias, bem como maior quantidade de nódulos nas superfícies anodizadas, porém sem diferença estatística (p>0,05). Concluiu-se, portanto, que a nanotopografia promovida por este método de anodização induz efeitos moduladores benéficos nas células osteoblásticas. Palavras-chave: liga Ti-6Al-4V, anodização, filme anódico, osseointegração. 6004
2 INTRODUÇÃO Dentre os vários métodos para melhorar as propriedades interfaciais e aumentar o tempo de vida dos implantes, a anodização têm atraído grande atenção dos pesquisadores, devido à sua simplicidade e facilidade para manipular os parâmetros experimentais na obtenção de filmes microporosos ou nanoporosos (1, 2). Os parâmetros que mais afetam as características do óxido formado por anodização correspondem às mudanças no eletrólito (concentração, valor de ph e temperatura da solução), diferença de potencial elétrico imposta entre o cátodo e o ânodo, além da densidade de corrente aplicada. Assim, o óxido formado poderá apresentar características variadas, com respeito à espessura, cor, cristalinidade e uniformidade, como uma função da variação nos parâmetros do processo (1). No que concerne ao eletrólito, um importante requisito, é que o mesmo não seja agressivo para o crescimento do óxido, a fim de evitar a sua dissolução durante o processo, ou ao menos, deve-se assegurar que a taxa de crescimento do óxido seja maior que a taxa de sua dissolução (3). Os eletrólitos comumente utilizados na anodização do titânio são o ácido fosfórico e o ácido sulfúrico, em diferentes concentrações, além de soluções de sulfato de amônio, de hidrogenocarbonato de sódio e outras contendo íons fluoreto (1, 2). A diferença de potencial e a densidade de corrente aplicada podem variar dentro de uma ampla faixa de valores. Os mais baixos permitem a obtenção de um óxido amorfo, cuja cor varia como função da espessura e, consequentemente, do potencial aplicado. A busca por uma camada de óxido relativamente espessa e uniforme, que confira maior resistência à corrosão e à abrasão e, que favoreça a osseointegração, é um desafio atual (2, 3). Neste sentido, o objetivo neste estudo foi avaliar a citotoxicidade da camada de TiO 2 obtida por meio do processo de anodização utilizando corrente pulsátil e verificar a influência desta nova superfície na atividade de osteoblastos obtidos da calvária de ratos recém-nascidos. MATERIAL E MÉTODOS A partir de tarugos cilíndricos de 1,1 cm de diâmetro da liga Ti-6Al-4V foram preparados 24 corpos-de-prova na forma de discos, com 0,3 cm de altura cada um, utilizando-se uma cortadora de precisão, ISOMET Previamente à anodização, as amostras obtidas foram lixadas mecanicamente com SiC nas seguintes 6005
3 granulações: 100, 200, 400 e 600 mesh e, em seguida, enxaguadas em banho de ultrassom por 10 minutos em etanol e mais 10 minutos em água deionizada. Doze das amostras obtidas foram submetidas ao processo de anodização aplicando-se uma corrente pulsátil de 0,1 A cm 2 aproximadamente (a uma frequência de 100 Hz, em um ciclo de 15 minutos, com 40% de eficiência por ciclo) e tensão máxima de 30 V, em meio de H 3 PO 4 2,5 mol/l, usado como eletrólito. Durante este processo a temperatura do banho variou de 21 a 23 ºC. Ao final de cada ensaio as amostras foram enxaguadas em água deionizada e secas naturalmente ao ar. Para o monitoramento dos parâmetros elétricos, foram utilizados: um osciloscópio digital, modelo MO2061, marca Minipa; um retificador pulsante de onda quadrada, modelo GI21P-10/30, da empresa General Inverter e; um multímetro, modelo ET-2615A, marca Minipa. As amostras anodizadas foram caracterizadas utilizando-se um microscópio eletrônico de varredura ZEISS DSM 940 e um espectrômetro Raman Horiba Scientific T64000, com comprimento de onda de excitação de 514 nm. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as orientações do Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Ciência e Tecnologia da Unesp (027/2008-PA/CEP). Para a etapa in vitro deste estudo, foram utilizados 50 ratos (Rattus norvegicus, variação albinus, Wistar), machos, recém-nascidos (2 a 4 dias). Células osteogênicas foram isoladas por digestão enzimática sequencial de fragmentos de calvária de ratos Wistar recém-nascidos (2 a 4 dias), com solução de tripsina a 0,25% (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e colagenase tipo II a 0,1% (Gibco, Invitrogen). Depois de cultivadas durante 3 e 10 dias, uma solução de MTT [3 (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio] (Sigma) foi adicionada às células e incubados a 37 C durante 4 horas, para formar cristais de formazan púrpura. Em seguida, o sobrenadante foi removido e as amostras foram lavadas com PBS, seguindo-se a adição de 1 ml de ácido isopropanol (0,04 N HCl em isopropanol) a cada poço para dissolver os cristais de formazan. A análise colorimétrica foi realizada com um espectrofotômetro EL808IU (Biotek Instruments, Winooski, VT, EUA) a nm. Os dados foram expressos como absorbância. Após 14 dias em cultura, as amostras foram lavadas três vezes com solução de Hank (Sigma) a 37 C, e as culturas foram fixadas com etanol a 70% durante 1 hora a 4 C. Após a fixação, as amostras foram lavadas duas vezes com PBS e coradas com 2% de vermelho de alizarina S (Sigma), ph 4,2, durante 15 minutos a 37 C. Esta solução é 6006
4 I (ma) I (ma) 21º CBECIMAT - Congresso Brasileiro de Engenharia e Ciência dos Materiais conhecida para a coloração de nódulos de matriz mineralizada. As amostras foram lavadas três vezes com água deionizada e secadas durante 24 horas a 37 C. Foi feita a quantificação de formação mineralizada de acordo com um método padrão e os valores foram expressos como densidade óptica. A análise estatística foi realizada utilizando testes não paramétricos, para dados independentes (Kruskal- Wallis), seguido por um teste de comparações múltiplas, quando aplicável (Dunn). O nível de significância foi de 5%. Os resultados são representativos de três experiências efetuadas com culturas primárias distintas. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Figura 1 são apresentados os pulsos de corrente de onda quadrada aplicados durante a anodização das 12 amostras da liga Ti-6Al-4V submetidas aos ensaios de viabilidade celular. De acordo com os registros efetuados, os pulsos de corrente oscilaram entre 0,35 e 0,65 A enquanto o potencial permaneceu em 30 V Tempo (ms) Tempo (ms) Figura 1: Pulsos de corrente durante a anodização de 12 amostras de Ti-6Al-4V. Verificou-se por meio das imagens obtida por SEM, Figura 2, que a técnica de anodização com corrente pulsátil possibilita a indução de fortes variações morfológicas no substrato, pela formação de um filme fino e poroso. O espectro Raman do filme formado, Figura 3, exibiu três bandas posicionadas entre 400 e 700 cm -1, que poderiam ser atribuídas à estrutura cristalina da anatase do TiO 2, mas o pico intenso a aproximadamente 158 cm -1 geralmente está associado ao óxido amorfo (4), em oposição àquele característico da anatase cristalina, que ocorre em torno de 147 cm -1, como registrado por diversos autores (5-7). 6007
5 Intensidade (u. a.) 21º CBECIMAT - Congresso Brasileiro de Engenharia e Ciência dos Materiais Figura 2: SEM para Ti-6Al-4V: (a) antes e (b) após anodização com corrente pulsátil Deslocamento Raman (cm -1 ) Figura 3: Espectro Raman obtido para uma das 12 amostras anodizadas com corrente pulsátil. 6008
6 Nos testes in vitro preliminares observou-se que a viabilidade celular aumentou gradualmente nos dois grupos ao longo do tempo. Após 3 e 10 dias de cultura, a viabilidade celular não foi significativamente afetada pela composição do material, nem pela topografia (p>0,05), embora amostras anodizadas tenham indicado melhores resultados nos períodos estudados. Aos 3 dias, os valores dos grupos de amostras não-anodizadas e anodizadas foram 0,038 e 0,055, e aos 10 dias foram 0,124 e 0,128, respectivamente. Em 10 dias, as amostras anodizadas apresentaram as maiores contagens de células viáveis. Foi observada diferença estatística entre os períodos (p<0,05). A formação de nódulos de matriz mineralizada aos 14 dias não foi afetada pela anodização, uma vez que, os grupos de amostras não-anodizadas e anodizadas apresentaram valores de absorção de 0,088 e 0,063, respectivamente. CONCLUSÕES Os resultados indicam que a anodização desempenha um importante papel na composição química e morfologia da superfície, influenciando positivamente na atividade osteoblástica, podendo acelerar o processo de osseointegração. Concluiuse que filmes porosos de TiO 2 podem ser obtidos em um intervalo relativamente curto de anodização, podendo ser considerados para aplicações biomédicas, por não demonstrar citotoxicidade para as células osteogênicas. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Luis Rogerio de Oliveira Hein (DMT/FEG/UNESP), pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura. Ao Laboratório Multiusuário de Espectroscopia Óptica Avançada (LMEOA/IQ-Unicamp), pelo espectro Raman. Aos órgãos de fomento à pesquisa: FAPESP, PROPe/UNESP e FUNDUNESP. REFERÊNCIAS 1. Kim, S. E.; Lim, J. H.; Lee, S. C.; Nam, S.; Kang, H.; Choi, J. Anodically nanostructured titanium oxides for implant applications. Electrochimica Acta, v.53, p , Yu, X.; Li, Y.; Wlodarski, W.; Kandasamy, S.; Kalantar-Zadeh, K. Fabrication of nanostructured TiO2 by anodization: a comparison between electrolytes and substrates. Sensors and Actuators B, v.130, p ,
7 3. Diamanti, M. V.; Pedeferri, M. P. Effect of anodic oxidation parameters on the titanium oxides formation. Corrosion Science, v.49, p , Si, H. Y.; Sun, Z. H.; Kang, X.; Zi, W. W.; Zhang, H. L. Voltage-dependent morphology, wettability and photocurrent response of anodic porous titanium dioxide films. Microporous and Mesoporous Materials, v.119, p , Liu, J. H.; Yi, J. L.; Li, S. M.; Yu, M.; Xu, Y. Z. Fabrication and characterization of anodic films on a Ti-10V-2Fe-3Al titanium alloy. International Journal of Minerals, Metallurgy and Materials, v.16, p , Jaeggi, C.; Parlinska-Wojtan, M.; Kern, P. Correlation of electrolyte-derived inclusions to crystallization in the early stage of anodic oxide film growth on titanium. Thin Solid Films, v.520, p , Nettikaden, V. C.; Skeldon, P.; Thompson, G. E. Porous anodic film formation on Al-Ti alloys in sulphuric acid. Corrosion Science, v.57, p , MORPHOLOGICAL AND STRUCTURAL VARIATIONS ON THE ALLOY TI-6AL-4V SURFACE BY APPLICATION OF CURRENT PULSE DURING ANODIZING ABSTRACT Anodizing by current pulses may be a viable alternative to induce the formation of TiO 2 film on the surface of titanium, even at low potentials. In this work, this technique was carried out on samples of Ti-6Al-4V, aiming an application in orthopedic implants. Images obtained by scanning electron microscopy in the anodized samples revealed the presence of pores uniformly distributed over the entire surface, with diameters of about 2 m. Grown on the surfaces of the control sample and anodized osteogenic cells were assayed for cytotoxicity test (MTT) and formation of mineralized matrix. The results showed a higher rate of viable cells at 10 days, as well as greater amount of nodules on anodized surfaces (p = 0.05). It was concluded that the nanotopography is promoted by the anodization method induces beneficial modulatory effects on osteoblastic cells. Keywords: Ti-6Al-4V alloy, anodizing, anodic film, osseointegration. 6010
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