DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DO VÍRUS DA INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS ESCOLA DE VETERINÁRIA Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DO VÍRUS DA INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL DANIELA DE SOUZA RAJÃO Belo Horizonte Escola de Veterinária - UFMG 2012

2

3 Daniela de Souza Rajão DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DO VÍRUS DA INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL Tese apresentada à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal. Área de concentração: Medicina Veterinária Preventiva. Orientador: Prof. Rômulo Cerqueira Leite Co-orientadores: Profa. Zélia Inês Portela Lobato Prof. Roberto Maurício Carvalho Guedes Belo Horizonte Escola de Veterinária - UFMG

4 R161d Rajão, Daniela de Souza, Detecção e caracterização de isolados do vírus da influenza em suínos no Brasil / Daniela de Souza Rajão p. : il. Orientador: Rômulo Cerqueira Leite Co-orientadores: Zélia Inês Portela Lobato, Roberto Maurício Carvalho Guedes Tese (doutorado) Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinária Inclui bibliografia 1. Suíno Doenças Teses. 2. Vírus da influenza Teses. 3. Imunohistoquímica Teses. 4. Reação em cadeia da polimerase Teses. I. Leite, Rômulo Cerqueira. II. Lobato, Zélia Inês Portela. III. Guedes, Roberto Maurício Carvalho. IV. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. V. Título. CDD

5 3

6 4

7 Dedico esta realização aos meus pais, Cid e Cecília, por serem meus maiores incentivadores; à minha irmã, Juliana, pelo companheirismo; ao Thiago, pelo carinho; ao avô Roberto, por ter sido minha inspiração, mesmo que distante. 5

8 6

9 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, por serem meu exemplo de sucesso e me fazerem querer ser sempre melhor. À minha irmã e meu cunhado, pela amizade e apoio para desabafar nos momentos de tensão. Ao Thiago, pelo carinho e por ter entrado na minha vida para torná-la mais feliz. Sem vocês eu não teria conseguido! Ao Professor Rômulo Cerqueira Leite, exemplo profissional e principal motivador, sem o qual esta e outras conquistas não seriam possíveis. Foi o senhor quem fez tudo acontecer! À Professora Zélia Inês Portela Lobato e ao Professor Roberto Maurício Carvalho Guedes, essenciais para a realização deste doutorado, pelo incentivo e apoio constantes, pela paciência e por todos os ensinamentos. Aos membros da banca, Dra. Janice Reis Ciacci-Zanella, Dr. Jorge Caetano Júnior, Dr. Marcos Bryan Heinemann e Dr. Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, pelas contribuições para aprimorar este trabalho. Aos Laboratórios Ipeve e Microvet, e ao Médico Veterinário José Eustáquio Cavalcante, pelo fornecimento das amostras utilizadas neste estudo. À EMBRAPA Suínos e Aves, ao LANAGRO Minas Gerais e ao Dr. Alexandre Machado, pelo fornecimento das amostras referência de vírus influenza. Ao Dr. Kurt Rossow pelo fornecimento de controle positivo para a Imuno-histoquímica. Aos colegas Diego Hussin, Marcela Gasparini e Bruno Brasil pelo imenso auxílio no desenvolvimento deste estudo, indispensáveis para a conclusão desta tese. Aos Professores Jenner Karlisson Pimenta dos Reis e Marcos Bryan Heinemann, que fizeram parte de toda a minha trajetória na Escola de Veterinária e foram essenciais para o meu crescimento. Às amigas do Retrolab, Fernanda, Helen, Fabiana e Gissandra, pela ajuda na elaboração deste trabalho e por tornarem os momentos no laboratório mais prazerosos. Aos demais companheiros do Retrolab, pelas opiniões e ideias, sempre bem-vindas. À Dra. Amy Vincent, por abrir as portas para um novo mundo na pesquisa, e por proporcionar meu crescimento profissional e pessoal ao me receber em seu laboratório. À Dra. Crystal Loving, não só pelos ensinamentos, mas por fazer a minha estadia nos EUA inesquecível. Aos amigos do Swine Lab, no USDA, em especial à Pravina Kitikoon, Jamie Henningson, Doug Braucher e Phill Gauger, pela acolhida e pelos ótimos momentos vividos juntos. Aos amigos da veterinária e do colégio, em especial às amigas Jú, Flávia, Lets, Marcela e Fê, pelos maravilhosos momentos de descontração para reduzir a tensão do dia-a-dia. Aos funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, em especial ao Eduardo, Grazielle, Graciela, Anita e Doraci, pela disponibilidade e apoio. Ao Colegiado de Pós-Graduação, pelo acompanhamento e auxílio. À CAPES pelo apoio financeiro ao meu doutorado e ao CNPq/Labex pelo apoio financeiro ao doutorado SWE; ao CNPq e à FAPEMIG, pelo financiamento deste projeto. Ao INCT-Pecuária pelo apoio a este projeto. 7

10 8 SUMÁRIO ABREVIAÇÕES E SIGLAS RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO CAPÍTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA Classificação e caracterização do vírus Influenza Genes e proteínas virais Restrição de hospedeiros Evolução genética do vírus Influenza Histórico do vírus Influenza em suínos Epidemiologia Influenza suína e saúde pública H1N1 pandêmico Patogênese Sinais clínicos e lesões Resposta imune Diagnóstico Prevenção e vacinação CAPÍTULO 2: EVIDÊNCIA SOROLÓGICA DA CIRCULAÇÃO DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS DE MINAS GERAIS, BRASIL Introdução Material e Métodos Resultados Discussão CAPÍTULO 3: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO CLÍNICO- PATOLÓGICA DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL Introdução Material e Métodos Amostras clínicas Isolamento viral em cultivo celular Reação de hemaglutinação (HA) Imunocitoquímica Titulação viral de amostras isoladas... 38

11 6. Extração de RNA e transcrição reversa PCR em tempo real Clonagem e construção da curva padrão Quantificação de amostras positivas pela PCRrt Diagnóstico histológico e imuno-histoquímico Análise estatística Resultados Achados clínicos Isolamento viral, hemaglutinação e imunocitoquímica RT-PCR em tempo real e quantificação Diagnóstico histológico e imuno-histoquímico Discussão CAPÍTULO 4: PERFIL SOROLÓGICO PARA O VÍRUS DA INFLUENZA EM GRANJAS COMERCIAIS DE SUÍNOS NO BRASIL Introdução Material e Métodos Resultados Discussão CAPÍTULO 5: CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS VÍRUS INFLUENZA ISOLADOS DE SUÍNOS NO BRASIL EM 2009 E Introdução Material e Métodos Amostras clínicas Extração de RNA e transcrição reversa PCR para segmentos HA e NA Sequenciamento de nucleotídeos e análise filogenética Resultados Isolados virais Análise filogenética Análise de sítios antigênicos e de ligação a receptores Discussão CAPÍTULO 6: CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA ANEXO I

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Genes dos vírus Influenza A e suas funções Tabela 2. Ocorrência da influenza suína no Brasil para animais e rebanhos Tabela 3. Títulos de Inibição da Hemaglutinação para rebanhos positivos e negativos Tabela 4. Percentual de animais com anticorpos contra múltiplos antígenos de vírus influenza em Minas Gerais, Brasil Tabela 5. Conjunto de iniciadores e sondas para uso na PCR quantitativa em tempo real para detectar ácidos nucléicos do vírus influenza após isolamento viral Tabela 6. Caracterização das granjas estudadas Tabela 7. Caracterização das amostras virais estudadas Tabela 8. Conjunto de iniciadores para uso na PCR para sequenciamento dos genes hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) completos dos vírus Influenza A Tabela 9. Sequências de vírus Influenza A depositadas no GenBank com maior identidade de nucleotídeos para os vírus isolados de suínos (A/swine/Brazil/1-17/2009 e A/swine/Brazil/18-20/2010) e de humano (A/Minas Gerais/21/2009) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Diagrama ilustrativo da estrutura do vírus influenza A. HA: hemaglutinina; NA: neuraminidase; NP: nucleoproteína; M1/M2: matriz; PA: polimerase ácida; PB1/PB2: polimerase básica Figura 2. Mapa das mesorregiões em que as granjas estudadas estavam localizadas Figura 3. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o vírus da influenza suína (SIV) H1N1, H3N2 SIV e vírus influenza humano H1N1 nas granjas positivas. Amostras negativas (titulo <40); com título baixo (40 e 80); título médio (160 e 320); e título alto ( 640) Figura 4. Figura esquematizando os procedimentos realizados para detecção do vírus influenza em fragmentos de pulmão suíno Figura 5. Gráficos de amplificação na PCR em tempo real para detecção de ácidos nucleicos da proteína ribossomal canina S26 (A) e do vírus influenza (B) Figura 6. Gráficos representativos da curva padrão da PCR em tempo real quantitativa para quantificação de ácidos nucleicos do vírus influenza. Gráfico da eficiência da reação (A) e de amplificação da curva padrão (B)

13 Figura 7. Fotomicrografias de fragmentos de pulmão suíno com lesões histológicas (A, C, E) e detecção de antígenos do vírus Influenza A pela Imuno-histoquímica (B, D, F). (A): Parede bronquial com infiltrado neutrofílico e linfocítico intenso na lamina própria da mucosa e submucosa, particularmente ao redor de glândulas bronquiais. Hematoxilina e eosina, 100X. (B): Marcação positiva em vermelho da nucleoproteína viral no citoplasma de células do epitélio bronquiolar, 200X. (C): bronquiolite necrotizante com descamação do epitélio bronquiolar devido à necrose e infiltração linfocitária na lamina própria, 100X. (D): mesma área de C, corada pela imuno-histoquímica, com intensa marcação no epitélio de revestimento bronquiolar remanescente, 100X. (E): Intenso infiltrado inflamatório neutrofílico no lúmen alveolar, associado ao espessamento de septo interlobular devido ao edema e discreto infiltrado linfocitário, 40X. (F): Intensa marcação positiva em vermelho para nucleoproteína viral em glândulas (setas) e epitélio bronquiais, 40X Figura 8. Perfil sorológico para os vírus influenza suíno clássico (ch1n1) e pandêmico (ph1n1) nas granjas estudadas. As médias geométricas dos títulos de anticorpos após transformação logarítmica foram comparadas entre as fases de criação das granjas positivas. Letras diferentes, minúsculas para ch1n1 e maiúsculas para ph1n1, indicam diferenças significativas (P<0,05). Granjas amostradas antes (G1 a G3a) e após (G3b a G6) a pandemia H1N em humanos. A linha pontilhada indica o ponto de corte Figura 9. Distribuição dos títulos de anticorpos contra os vírus da influenza clássico (ch1n1) e pandêmico (ph1n1) das diferentes fases de criação nas granjas estudadas com resultados positivos. Amostras negativas (titulo <40); com título baixo (40 e 80); título médio (160 e 320); e título alto ( 640). Diferenças significativas (P<0,05) entre a distribuição de títulos numa mesma fase de criação das diferentes granjas estão indicadas por letras diferentes. G3b a G6 = granjas 3b a 6, que obtiveram resultados positivos na Inibição da Hemaglutinação Figura 10. Estados onde estão localizadas as granjas nas quais os vírus influenza foram isolados. N= número de propriedades analisadas por Estado Figura 11. Análise filogenética dos isolados brasileiros de suínos e de humano. Árvore construída pelo método Neighbor-Joining de (A): HA (1658nt) e (B): NA (1363nt). Foram incluídas na análise sequências de genes HA e NA de vírus H1N1 pandêmico e de vírus sazonais H1N1 e H1N2 isoladas de suínos e humanos no mundo. A análise de HA (A) mostra quatro diferentes clusters (α, β, γ, δ) de vírus H1 endêmicos em suínos norte-americanos, indicado por chaves à direita da árvore. Losango fechado: amostras de vírus influenza pandêmico H1N isoladas de suínos neste estudo; losango aberto: amostra de vírus influenza pandêmico H1N1 isolada de humano neste estudo; A/swine/Brazil/12A/2010: amostra de vírus influenza pandêmico previamente isolada no Brasil

14 Figura 12. Dendrograma dos genes HA (A) e NA (B) dos isolados suínos e humano brasileiros, construída pelo método de Neighbor-Net. Sequências dos genes HA e NA de vírus pandêmicos humanos e suínos depositadas no GenBank foram incluídas na análise. Números 1 a 20: isolados suínos; número 21: isolado humano, destacado por borda preta; quadrado cinza: isolados brasileiros deste estudo; círculos pretos: sequências depositadas no Genbank e utilizadas como referência; ph1n1: sequências refêrencia de vírus pandêmicos de humanos; ph1n1swine: sequências refêrencia de vírus pandêmicos de suínos; quadrado cinza com borda preta = isolados brasileiros deste estudo idênticos a amostras depositadas no GenBank Figura 13. Alinhamento das sequências da hemaglutinina subunidade 1 (HA1) dos isolados pandêmicos H1N1 suínos e humano brasileiros. As sequências foram alinhadas e numeradas usando a proteína HA1 madura. Pontos representam aminoácidos iguais aos da sequência consenso A/Mexico/4108/2009 (número de acesso GenBank GQ162170). Retângulos grandes: sítios antigênicos (Sa, Sb, Ca1, Ca2 e Cb); triângulos: resíduos de aminoácidos nos sítios de ligação ao receptor; asterisco: alteração observada no resíduo Figura 14. Alinhamento das sequências da proteína neuraminidase (NA) dos isolados pandêmicos H1N1 suínos e humano brasileiros. Pontos representam aminoácidos iguais aos da sequência consenso A/Mexico/4108/2009 (número de acesso GenBank GQ162169). Triângulos: resíduos de aminoácidos associados com resitência a drogas anti-virais; asteriscos: alterações nos resíduos 106 e

15 ABREVIAÇÕES E SIGLAS AEC = Amino-etilcarbazol BALT = Tecido linfoide bronco-associado CDC = Center for Disease Control and Prevention cdna = DNA complementar ch1n1 = Vírus H1N1 suíno clássico CO 2 = Dióxido de carbono DNA = Ácido desoxirribonucléico DNAse = Desoxirribonuclease dntp = Desorribonuleotídeo trifosfatado ECP = Efeito citopático EDTA = Ácido etilenodiamino tetra-acético EID50 = Dose infecciosa 50% em ovos FAO = Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação g = Força centrífuga HA = Hemaglutinina ou Reação de hemaglutinação HA0 / 1 / 2 = Hemaglutinina molécula única/ subunidade 1 / subunidade 2 HCL = Ácido clorídrico HE = Hematoxilina e eosina HI = Reação de inibição da hemaglutinação IAV = Vírus Influenza A IC = Intervalo de confiança ICQ = Imuno-citoquímica IF = Imunofluorescência IFNα = Interferon alfa IgA / G / M = Imunoglobulina A / G / M IHQ = Imuno-histoquímica IL = Interleucina IM = Intramuscular KCl = Cloreto de potássio KH 2 PO 4 = Hidrogenofosfato de Potássio LANAGRO/MG = Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais M = Matriz ou Molar MAPA = Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MDCK = Células Madim-Darby de rim canino MEM = Meio essencial mínimo MgCl 2 = Cloreto de magnésio MgSO 4 = Sulfato de magnésio MHC = Complexo de Histocompatibilidade Principal ml = Mililitro mm = Milimolar NA = Neuraminidase NaCl = Cloreto de sódio NaOH = Hidróxido de sódio NeuAc α2,3/α2,6 = Ácido siálico N-acetilneuramínicos ligado à galactose α2,3/α2,6 ng = Nanograma NP = Nucleoproteína 13

16 NS = Não estrutural nt = Nucleotídeo ºC = Graus Celsius OFFLU = Rede de vigilância em influenza animal OIE = Organização Mundial de Saúde Animal OMS = Organização Mundial de Saúde p/v = Peso por volume PA = Polimerase ácida PB1 = Polimerase básica 1 PB2 = Polimerase básica 2 pb = Pares de bases PBS = Tampão salina fostato PCR = Reação em cadeia da polimerase PCV2 = Circovírus suíno tipo 2 ph1n1 = Vírus H1N1 pandêmico PRCV = Coronavírus respiratório suíno PRRSV = Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína q. s. p. = Quantidade Suficinte Para RIDT = Teste rápido para detecção do vírus influenza RNA = Ácido ribonucleico RNAse = Ribonuclease RNC = Região não-codificadora RNP = Complexo ribonucleoproteína rpm = Rotações por minuto rt = Tempo real RT = Transcrição reversa S26 = Proteína ribossomal canina S26 SFB = Soro fetal bovino SIV = Vírus influenza suíno SN = Soroneutralização TCID50 = Dose infecciosa 50% em cultura de tecido TNFα = Fator de necrose tumoral alfa U = Unidades µg = Micrograma µl = Microlitro µm = Micrômetro µm = Micromolar 14

17 RESUMO O vírus influenza A (IAV) é um importante causador de doença respiratória em suínos, mas a epidemiologia da influenza suína no Brasil ainda é desconhecida. O objetivo deste estudo foi detectar a infecção pelo IAV em suínos do Brasil; fazer a caracterização de cepas virais isoladas; e avaliar o perfil sorológico em granjas antes e após a pandemia de Foram utilizadas 355 amostras de soro de suínos de 17 granjas de Minas Gerais e 86 amostras de pulmão de 39 granjas de Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Paraná. Dez amostras de soro de cada fase da produção de granjas coletadas antes (3) e após (4) 2009 foram utilizadas no perfil sorológico. As amostras de soro foram testadas pela inibição da hemaglutinação (HI) e as amostras de pulmão foram submetidas ao isolamento viral e à reação em cadeia da polimerase em tempo real (rtpcr). A caracterização genética foi realizada em 21 isolados. No levantamento sorológico, 158 amostras (44,5%) e 11 granjas (64,7%) foram positivas para o vírus suíno (SIV) H1N1; 36 animais (10,1%) e quatro granjas (23,5%) para H3N2 SIV; e 136 animais (38,3%) e 10 granjas (58,8%) para o vírus H1N1 humano. No isolamento viral, 31 amostras foram positivas e 36 na rtpcr. Das 86 amostras de pulmão, 60 foram submetidas à imuno-histoquímica e 38 (63,3%) foram positivas. No perfil sorológico, apenas granjas amostradas após 2009 eram positivas e com queda de anticorpos na creche. Todos os isolados foram agrupados com vírus pandêmicos H1N1. Este estudo comprova a circulação do IAV em suínos no Brasil, inclusive de vírus humanos, ressaltando a importância do suíno na epidemiologia da Influenza. Palavras-chave: Influenza; suíno; granja; inibição da hemaglutinação; PCR; imunohistoquímica; caracterização genética, H1N1 pandêmico, Brasil. 15

18 ABSTRACT Influenza A virus (IAV) is an important pathogen causing respiratory disease in pigs. However, influenza epidemiology in Brazilian pigs is still unknown. The aim of this study was to detect IAV infection in Brazilian pigs; characterize isolated viruses; and evaluate the serological profile in swineherds prior and after 2009 pandemics. Serum samples of 355 animals from 17 herds in Minas Gerais and 86 swine lung samples from 39 herds in Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, and Paraná were used. Ten serum samples from each production phase from herds sampled before (3) and after (4) 2009 were used for the serological profile. Serum samples were tested by hemagglutination inhibition (HI), and lung samples were tested by virus isolation and real time polymerase chain reaction (rtpcr). Genetic characterization was performed in 21 isolates. In the serological survey, 158 animals (44.5%) and 11 herds (64.7%) were positive for swine virus (SIV) H1N1; 36 animals (10.1%) and 4 herds (23.5%) for SIV H3N2; and 136 animals (38.3%) and 10 herds (58.8%) for human H1N1 virus. Virus was isolated from 31 lung samples and 36 were positive for rtpcr. Sixty lung samples were tested by immunohistochemistry and 38 (63.3%) were positive. For the serological profile, only herds sampled after the pandemic were naturally infected and showed maternal derived antibodies decay in nursery stage. All isolates were clustered with pandemic H1N1 influenza when sequenced. This study shows influenza virus is circulating in Brazilian pigs, mainly human origin viruses, and proves the importance of the swine for influenza epidemiology. Keywords: Influenza; swine; herd; hemagglutination inhibition; PCR; immunohistochemistry; genetic characterization, pandemic H1N1, Brazil. 16

19 INTRODUÇÃO A Influenza é uma zoonose viral que representa um problema econômico e para a saúde pública e animal em todo o mundo. Os vírus Influenza A infectam várias espécies de mamíferos e aves, sendo que a transmissão interespécie pode ocorrer. Os vírus influenza apresentam alta variabilidade genética, principalmente nas duas proteínas principais da superfície viral, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Essas alterações genéticas podem levar à formação de novos subtipos e novas cepas virais contra os quais a população humana não possui imunidade, o que pode resultar na ocorrência de pandemias. Alguns vírus Influenza estão adaptados à espécie suína, circulam nos rebanhos suínos mundiais, e são endêmicos em diversos países, causando perdas consideráveis na produção. No Brasil, estudos sobre o vírus da influenza em suínos são escassos e não foram capazes de identificar os subtipos e cepas virais endêmicas, mas comprovaram a infecção nos rebanhos suínos nacionais. O suíno pode se infectar tanto com vírus de origem aviária, quanto de origem humana, e apresenta potencial para atuar como hospedeiro intermediário na transmissão de vírus aviários para humanos. Dessa forma, essa espécie tem um papel importante na epidemiologia da Influenza, pois participa na formação de novos vírus, dificultando o controle da Influenza em outras espécies. Existe uma rede de vigilância da Influenza humana formada por diversos países do mundo e coordenada pela Organização Mundial de Saúde (OMS), com o intuito de monitorar as cepas dos vírus da Influenza circulantes anualmente nos dois hemisférios e definir a melhor cepa vacinal. Além disso, foi criada uma rede de vigilância da Influenza animal (OFFLU) englobando diversos países, através da parceria entre a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO), para trocar informações científicas e conhecimentos, com o intuito de reconhecer e caracterizar cepas do vírus Influenza infectando animais, promovendo segurança alimentar mundial e o bem estar animal. A OMS em associação com a OIE preconizam o monitoramento da Influenza em suínos visando identificar vírus tipo aviários capazes de causar infecção em humanos. Entretanto, não existe um sistema de monitoramento do vírus influenza em suínos no Brasil, medida que é fundamental para avaliar os efeitos da infecção nos plantéis nacionais e identificar os variantes virais existentes. A pouca informação sobre a infecção pelo vírus influenza em suínos no Brasil e a não associação do vírus a surtos respiratórios nos plantéis nacionais limitam a elaboração e implantação de medidas preventivas. Portanto, este estudo é um passo importante para determinar a real situação em que se encontra a infecção por esse vírus nos rebanhos brasileiros, permitindo elaborar medidas de prevenção e sistemas ideais para monitoramento. 17

20 CAPÍTULO 1: REVISÃO DE LITERATURA Classificação e caracterização do vírus Influenza A Influenza é uma doença respiratória altamente contagiosa que acomete humanos e animais. Os vírus influenza são membros da família Orthomyxoviridae (do grego orthos: padrão, ordenado; e myxo: muco) (Palese e Shaw, 2007). A família Orthomyxoviridae possui cinco gêneros diferentes: Influenza A, Influenza B, Influenza C, Thogotovirus e Isavirus (King et al., 2011). Os vírus influenza dos tipos A, B e C são diferenciados de acordo com características antigênicas distintas entre suas proteínas internas do nucleocapsídeo (NP) e da matriz (M) (Palese e Shaw, 2007). Os vírus influenza do tipo A podem ser classificados em diferentes subtipos com base nas características antigênicas de suas glicoproteínas de superfície, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Até o momento, 16 subtipos de HA e nove subtipos de NA foram identificados (Fouchier et al., 2005). Os vírus influenza A (IAV) infectam naturalmente uma variedade de espécies aviárias e de mamíferos, incluindo humanos, suínos e equinos. Vírus Influenza B infectam apenas humanos, enquanto que os vírus influenza C infectam principalmente humanos, mas também foram isolados em suínos (Webster et al, 1992; Palese e Shaw, 2007). Os vírus influenza apresentam genoma segmentado composto por RNA fita simples senso negativo. Os genomas dos vírus influenza A e B são divididos em oito segmentos (Palese e Schulman, 1976; Ritchey et al., 1976; Palese et al., 1977) (Fig. 1), enquanto que o dos vírus influenza C apresentam apenas sete segmentos (Palese e Shaw, 2007). O vírus possui um envelope lipídico derivado da membrana plasmática da célula hospedeira, onde estão embebidas as proteínas HA, NA e matriz 2 (M2), se projetando na superfície viral. Cada segmento de RNA viral é envolto por várias moléculas de nucleoproteínas (NP), formando o complexo ribonucleoproteína (RNP) (Nayak, et al. 2004). As três subunidades da RNA polimerase (polimerase básica 1 - PB1, polimerase básica 2 - PB2 e polimerase ácida - PA) se ligam à extremidade 3 do RNP, que por sua vez é envolto pela proteína da matriz 1 (M1) (Palese e Shaw, 2007). A partícula viral é pleomórfica, podendo ser encontrada na forma esférica ou filamentosa. Os vírus isolados de humanos e animais geralmente apresentam partícula filamentosa de diâmetro uniforme (diâmetro ~80nm), mas após o cultivo em laboratório a forma viral esférica (diâmetro de nm) é observada mais comumente (Chopin et al., 1960). Figura 1. Diagrama ilustrativo da estrutura do vírus influenza A. HA: hemaglutinina; NA: neuraminidase; NP: nucleoproteína; M1/M2: matriz; PA: polimerase ácida; PB1/PB2: polimerase básica. Fonte: Horimoto et al.,

21 Genes e proteínas virais O genoma do vírus Influenza A consiste em RNA fita simples, dividido em oito segmentos que codificam 11 proteínas virais (Tab. 1) (Ritchey et al, 1976). Todos os segmentos de RNA viral do Influenza A possuem sequências conservadas nas terminações 5 (13 nucleotídeos) e 3 (12 nucleotídeos) da região não codificadora (RNC), seguidas de sequências específicas para cada segmento (Skehel e Hay, 1978; Desselberger et al., 1980). Tabela 1. Genes dos vírus Influenza A e suas funções. Segmento Gene Tamanho (nt) Função 1 PB Transcriptase: polimerase, início da transcrição 2 PB Transcriptase: polimerase, extensão do RNAv 3 PA 2233 Transcriptase: polimerase, replicação do RNAv 4 HA 1778 Hemaglutinina: ligação à célula hospedeira 5 NP 1565 Nucleoproteína: ligação do RNA, parte do complexo RNP, transporte núcleo-citoplasma do RNAv 6 NA 1413 Neuraminidase: liberação viral 7 M NS 890 RNAv = RNA viral; Fonte: Adaptado de Webster et al., 1992 Matriz: M1 maior componente do vírion, estrutural M2 canal de íon da membrana Não-estrutural: NS1 transporte de RNA, montagem, tradução, antagonista de interferon NS2/NEP: proteína de exportação nuclear do RNAv A glicoproteína HA é o antígeno de superfície mais importante do vírus influenza e principal alvo para a resposta imune do hospedeiro, é altamente variável e com frequente substituição de aminoácidos (Skehel e Wiley, 2000). A molécula da HA tem aparência de espiga, com a cabeça arredondada e um corpo transmembrana (Webster et al., 1992). A HA é importante determinante de virulência e de especificidade de hospedeiros, pois media a ligação inicial do vírus a receptores de ácido siálico na célula hospedeira, mas também participa da liberação do complexo RNP no citoplasma através da fusão com a membrana do endossomo (Shinya et al., 2006; Nicholls et al., 2008). Nas células infectadas, a HA é inicialmente sintetizada na forma precursora como molécula polipeptídica única (HA0). A clivagem proteolítica da HA0 é necessária para a infectividade do vírus e crucial para a patogenicidade viral (Taubenberger, 1998; Steinhauer, 1999). A HA0 é clivada por endoproteases tipo-tripsina do hospedeiro em duas subunidades, HA1 e HA2, ligadas entre si por ligações dissulfeto (Taubenberger, 1998). A subunidade HA1 forma a extremidade distal que contém os sítios de atividade antigênica e o sítio de ligação ao receptor. A subunidade HA2 contém uma sequência altamente conservada de aminoácidos hidrofóbicos que insere a glicoproteína na bicamada lipídica (Schoch e Blumenthal, 1993; Cross et al., 2001). A glicoproteína NA também é um antígeno de superfície do vírus influenza, tem aparência de cogumelo e, como a HA, sofre 19

22 constantes variações antigênicas. Sua atividade enzimática cliva receptores presentes na mucina que impedem o acesso aos receptores da membrana (Gottschalk, 1957), auxiliando na penetração na célula hospedeira, além de atuar na liberação e disseminação da progênie viral (Matrosovich et al., 2004). Além disso, determinantes de resistência a antivirais foram detectados na proteína NA (Le et al., 2005) e M (Marozin et al., 2002). Os seis segmentos restantes codificam proteínas estruturais e acessórias (Tab. 1). Uma proteína acessória adicional, PB1-F2 pode ser codificada pelo segmento 2, conferindo virulência aos vírus, pois induz apoptose em células imunes ao se associar a proteínas mitocondriais (Chen et al., 2001). Restrição de hospedeiros Análises filogenéticas indicam que todos os 16 subtipos de HA e nove subtipos de NA do vírus influenza A já foram detectados em espécies aviárias, o que sugere que os vírus influenza de mamíferos vieram de reservatórios aviários. Além disso, a infecção geralmente não causa doença em aves silvestres, sugerindo que o vírus é adaptado a esse hospedeiro (Webster et al., 1992). Embora a transmissão interespécie dos vírus influenza tenha sido demonstrada (Koopmans et al., 2004; Li et al., 2004; Crawford et al., 2005; Newman et al., 2008), os vírus influenza apresentam algumas restrições de hospedeiros e a infecção de novos hospedeiros não resulta em transmissão adequada entre eles. Vírus influenza aviários não replicam eficientemente em humanos (Beare e Webster, 1991), enquanto que vírus influenza humanos não replicam eficientemente em aves (Hinshaw et al., 1983). Os vírus influenza A apresentam afinidade da glicoproteína HA com receptores de ácido siálico distintos. Vírus humanos reconhecem preferencialmente receptores de ácido siálico N- acetilneuramínicos (NeuAc) ligados à galactose por uma ligação do tipo α2,6 (NeuAc α2,6gal), pois as células epiteliais da traqueia humana possuem receptores com ligação do tipo NeuAc α2,6gal (Couceiro et al., 1993), enquanto que vírus aviários e equinos geralmente reconhecem receptores de ácido siálico com ligação α2,3 (NeuAc α2,3gal) (Ito, 2000; Gambaryan et al., 2005), uma vez que células da traqueia de cavalos e do cólon de aves possuem receptores com esse tipo de ligação (Ito, 2000). Os suínos apresentam ambos os receptores em seu epitélio respiratório (Kida et al., 1994; Gambaryan et al., 2005). Portanto o suíno é susceptível à infecção com vírus humanos e aviários e pode servir de hospedeiro intermediário ou sítio de mistura (mixing vessel) para esses patógenos (Ito e Kawaoka, 2000; Ma et al., 2009). No entanto, os receptores de ácido siálico parecem estar distribuídos de forma irregular no trato respiratório dos suínos, com receptores NeuAc α2,3gal presentes em menor abundância no trato superior, o que leva à pior replicação de vírus aviários nas traqueia e fossas nasais de suínos, dificultando a transmissão de vírus aviários entre suínos (Lipatov et al., 2008; Van Poucke et al., 2011). Existem casos em que humanos se infectaram com vírus aviários, através do contato com animais dessa espécie, mas a transmissão desse vírus humano-humano é limitada (Shinya et al., 2006). Evolução genética do vírus Influenza As populações de vírus influenza estão em constante evolução e apresentam ampla diversidade genética, resultante de mecanismos distintos como: i) recombinação genética; ii) mutação pontual ou antigenic 20

23 drift; e iii) rearranjo ou antigenic shift (Webster et al., 1982; 1992). i) Recombinação pode gerar variantes novas do vírus influenza através da troca de informação genética, que ocorre quando a polimerase muda o molde ou quando segmentos de ácido nucléico são quebrados e reunidos. Por exemplo, dois vírus aviários de baixa patogenicidade podem ser revertidos em um vírus de alta patogenicidade após a inserção de 21 nucleotídeos do segmento M no segmento HA do outro (Pasick et al., 2005). Em geral, a recombinação é mascarada pela baixa atividade biológica dos vírus recombinantes, mas, em casos de pressão seletiva, podem resultar em vantagem para a linhagem recombinante. ii) Mutação ou antigenic drift resulta do acúmulo de mutações pontuais resultantes da baixa fidelidade da RNA polimerase e sua inabilidade de correção de erros (Hampson, 2002). Essas mutações ocorrem principalmente em genes que codificam as glicoproteínas de superfície, HA e NA, e resultam da pressão de seleção imposta pelos mecanismos de defesa do hospedeiro (Wright et al., 2007). Embora a maioria das novas variantes não seja viável, algumas podem apresentar vantagens e se tornar dominantes. Na população humana, novas variantes do vírus causam doença grave e podem levar à morte de pacientes com depressão imunológica. Entretanto, antigenic drift no segmento HA do vírus influenza suíno é limitada e ocorre em segmentos sem atividade antigênica (Brown et al., 1997), provavelmente devido à baixa seleção imune em suínos, resultante da constante introdução de animais sem proteção. iii) Rearranjo ou antigenic shift é a troca de segmentos de diferentes vírus que ocorre em uma célula co-infectada com dois ou mais vírus. Esse mecanismo resulta em grande variação antigênica das glicoproteínas HA e NA, podendo gerar novos subtipos e introduzir novas cepas virais em populações não imunizadas (Wright et al., 2007). A introdução de novos vírus pode levar à ocorrência de pandemias, como foi o caso da emergência do novo H1N1 (Smith et al., 2009). Histórico do vírus Influenza em suínos O primeiro relato da infecção pelo vírus influenza A (IAV) em suínos ocorreu nos Estados Unidos durante a pandemia de 1918 (Gripe Espanhola), quando foi documentado um surto de doença respiratória aguda em suínos semelhante àquele observado em humanos no mesmo período, que levou à morte de 40 milhões de pessoas em todo o mundo (Koen, 1919 citado por Zimmer e Burke, 2009). A etiologia infecciosa da Influenza suína foi confirmada em 1931, quando Robert Shope, um veterinário, foi capaz de causar doença em animais sadios utilizando secreções filtradas de animais doentes (Shope, 1931). Mais tarde Shope sugeriu que o vírus suíno e o vírus humano pandêmico de 1918 eram antigênica e geneticamente semelhantes, o que foi confirmado por estudos moleculares recentes. Entretanto, ainda não se sabe se o vírus original foi transmitido de suínos para humanos ou de humanos para suínos (Shope e Francis, 1936; Reid et al., 2001). Epidemiologia A introdução da Influenza em um rebanho geralmente está associada à movimentação e introdução de novos animais (Olsen et al., 2006a). A secreção nasal de animais infectados apresenta altos títulos infecciosos durante a fase aguda da infecção (2 a 5 dias após a exposição) e é a principal fonte de transmissão, que ocorre pela via nasofaringeal (Brankston et al., 2007). A 21

24 transmissão respiratória ocorre através de gotículas e aerossóis, pelo contato direto entre animais, mas também contato indireto com objetos e superfícies contaminadas (Bridges et al., 2003). O vírus se mantém viável por 8 a 12 horas em superfícies porosas (tecido e papel) e por até 48 horas em superfícies não porosas (metal) e nas mãos (Bean et al., 1982). Já em aerossóis, pode permanecer viável por até 24 horas em ambiente com umidade relativa do ar baixa (Brankston et al., 2007). Embora surtos da doença sejam mais comuns em meses mais frios, a doença ocorre durante todo o ano, principalmente em regiões sem grandes variações de temperatura (Hinshaw et al., 1978; Olsen et al., 2000; Caron et al., 2010). Em rebanhos comerciais de ciclo completo infectados, geralmente todos os animais entram em contato com o vírus até a idade de abate (Vincent et al., 2008). Atualmente, três diferentes subtipos do IAV (H1N1, H1N2 e H3N2) circulam na população de suínos em todo o mundo e, ao contrário do que ocorre com vírus influenza de humanos, os vírus suínos têm origem e caracterização distinta nos diferentes continentes (Vincent et al., 2008). Nos EUA a doença está em constante circulação e acredita-se que cerca de 50% dos suínos possuam anticorpos contra H1N1 (Chambers et al., 1991). Na Europa, vírus H1N1 e H3N2 se tornaram endêmicos em algumas regiões, com prevalências que chegam a 80% e 58%, respectivamente (Van Reeth et al., 2008). Até a década de 90, a Influenza suína na América do Norte era causada quase que exclusivamente pelo vírus suíno clássico H1N1 (ch1n1), que permaneceu antigênica e geneticamente conservado desde sua introdução em 1918 (Vincent et AL., 2008). No final da década, entretanto, vírus do subtipo H3N2 de dois genótipos diferentes passaram a circular nos rebanhos americanos: um vírus de rearranjo duplo, contendo genes de vírus humano (HA, NA, 22 PB1) e do suíno clássico (NS, NP, M, PB2, PA); e um vírus de rearranjo triplo, contendo genes de vírus humano (HA, NA, PB1), suíno (NS, NP, M) e aviário (PB2, PA) (Zhou et al., 1999; Vincent et al., 2008). Desses, apenas o rearranjo triplo se manteve na população suína, cuja co-circulação com ch1n1 levou ao aparecimento de novos rearranjos (Webby et al., 2000) que são endêmicos no rebanho suíno americano e canadense, incluindo H3N2 (Webby et al., 2000), H1N1 rearranjado (Webby et al., 2004) e H1N2 (Choi et al., 2002a; Karasin et al., 2002). A maior parte das linhagens do IAV que circulam nos rebanhos norte-americanos atualmente são rearranjos com combinações diversas de HA e NA com genes internos de vírus humanos, suínos e aviários (Ito, 2000), conhecidos como genes internos de rearranjo triplo (TRIG), com PB1 de linhagem humana, PB2 e PA de linhagem aviária, e NP, M e NS de linhagem suína (Vincent et al., 2008). Na Europa, os vírus H1N1 são de origem aviária e foram introduzidos na população suína por patos selvagens em 1979 (Pensaert et al., 1981). Já o vírus H3N2 foi introduzido na população suína no início da década de 70 e tinha todos os segmentos originados do vírus humano (Castrucci et al., 1993). Essa linhagem inicial do H3N2 suíno circulou no continente Europeu até a década seguinte, mas a partir daí a linhagem originada do rearranjo entre o vírus tipo humano H3N2 (HA e NA) com o vírus H1N1 tipo aviário (proteínas internas e não estruturais) passou a ser predominante (Jong et al., 2007). O vírus H1N2 emergiu no Reino Unido no início dos anos 90 e se tornou endêmico nos suínos da Europa (Lam et al., 2007). Essa linhagem contém genes de origem humana (HA e NA) e derivados do vírus Europeu tipo aviário H1N1. Os subtipos H1N1 e H3N2 estão amplamente disseminados nos rebanhos

25 asiáticos (Li et al., 2004). Na Coréia do Sul, ambos os subtipos estão disseminados em quase todo o território, e a co-infecção entre os subtipos existe (Jung et al., 2002; 2007). Na China, o ch1n1 é o vírus influenza predominante infectando suínos, mas os vírus de origem aviária H1N1 (Guan et al., 1996) e H3N2 (Kida et al., 1988) também foram relatados no país. Os vírus H3N2 que circulam em suínos na Tailândia são relacionados a linhagens suínas da América do Norte, Ásia e Europa e também à linhagem humana, e o H1N1 circulante é principalmente relacionado a um vírus humano tipo-suíno, mas também a vírus endêmicos suínos norte-americanos (Chutinimitkul et al., 2008). O subtipo H1N2 circula em suínos na Ásia desde a década de 70 (Sugimura et al., 1980) e possui NA de vírus humano e os outros sete segmentos do ch1n1 (Ito et al., 1998). Evidências da circulação do vírus H1N1 e H3N2 foram relatadas em estudos sorológicos na Argentina (Teodoroff et al., 2003; Piñeyro et al., 2007). No Brasil, existem evidências sorológicas da circulação do vírus H1N1 e H3N2 nos estados do RS, SC, PR, SP, MG, MS, MT e GO, com ocorrência de 2,2 e 16,7% em animais, e 11,8 e 50,9% em propriedades para H1N1 e H3N2, respectivamente. Tentativas de isolamento e caracterização dos vírus circulantes foram realizadas, mas sem muito sucesso (Brentano et al, 2002; Mancini et al, 2006; Schaefer et al, 2008). Recentemente, um estudo relatou a prevalência sorológica de 46% de granjas e 20% de animais infectados com H3N2 no Paraná (Caron et al., 2010). Alguns subtipos distintos também foram isolados em suínos, principalemte em animais de países asiáticos, como o H9N2 e o H5N1 isolados na China (Li et al., 2004), o H3N1 isolado em Taiwan (Tsai e Pan, 2003), mas também o H2N3 isolado nos EUA (Ma et al., 2007), o H1N7 no Reino Unido (Brown et al., 1997) e H3N8 no Brasil (Schaefer et al., 2011a). Influenza suína e saúde pública Além do suíno contribuir para a geração de vírus com potencial pandêmico para a população humana, o IAV também apresenta potencial zoonótico (Thacker e Janke, 2008; Neumann et al., 2009). Infecções de humanos com vírus influenza de suínos foram relatadas na América do Norte, Europa e Ásia, geralmente envolvendo indivíduos com contato direto com suínos, e sem distinção de sinais clínicos das infecções com vírus humanos (Alexander e Brown, 2000; Gregory et al., 2003). A maioria dos casos ocorreu pela infecção com o vírus ch1n1, embora casos de infecção com vírus tipo aviário H1N1, rearranjos H3N2 e rearranjos H1N1 também tenham sido relatados em humanos (Gray et al., 2007; revisado por Myers et al., 2007; Newman et al., 2008). Alguns casos de infecções humanas com IAV de suínos sem qualquer contato com esses animais foram relatados, sugerindo a disseminação do vírus suíno de humano para humano (revisado por Myers et al., 2007), como são os casos do Fort Dix (Gaydos et al., 1977) e do vírus Influenza H1N (Neumann et al., 2009). A presença de receptores para vírus humanos e aviários no trato respiratório de suínos (Ito e Kawaoka, 2000) e sua capacidade de atuar como sítio de mistura fazem dessa espécie um potencial hospedeiro intermediário dos vírus influenza. Dessa forma, o suíno tem papel importante na epidemiologia da influenza humana e pode ser responsável pelo surgimento de cepas virais com potencial pandêmico para a população não imunizada (Brown, 2000). 23

26 H1N1 pandêmico 2009 Em março de 2009, um novo vírus de origem suína H1N1 (ph1n1) foi identificado em humanos e se disseminou rapidamente na população mundial, levando a Organização Mundial de Saúde a declarar fase de pandemia 6 após poucas semanas (CDC, 2009b). O novo vírus ph1n1 é resultante do rearranjo quádruplo entre vírus influenza tipo aviários circulantes em suínos na Europa e Ásia, e vírus de rearranjo triplo circulantes em suínos norte-americanos (Smith et al., 2009). Portanto, o H1N1 pandêmico possui genes derivados de linhagens aviárias (PB2 e PA), humanas H3N2 (PB1) e do vírus suíno clássico (HA, NP e NS) presentes no vírus norte americano, e genes derivados do vírus suíno tipo aviário da Eurásia (NA e M) (Smith et al., 2009). O ph1n1 pode infectar e se disseminar em suínos (Lange et al., 2009; Brookes et al., 2010) e a infecção natural de suínos com o vírus pandêmico já foi demonstrada em diversos países, geralmente relacionada ao contato prévio com seres humanos que apresentavam sinais clínicos respiratórios (Pasma e Joseph, 2010; Pereda et al., 2010; Sreta et al., 2010; Schaefer et al., 2011c). Suínos infectados pelo ph1n1 apresentam sinais clínicos e lesões semelhantes aos observados na infecção pelo IAV sazonal (Pasma e Joseph, 2010; Pereda et al., 2010) e a resposta imune gerada por exposição prévia a vírus endêmicos resulta apenas em proteção parcial contra o ph1n1 (Vincent et al., 2010b). Além disso, animais infectados apresentaram eliminação viral nas secreções respiratórias por 11 a 20 dias, período mais prolongado que na infecção pelo influenza suíno sazonal (Lange et al., 2009; Pasma e Joseph, 2010; Pereda et al., 2010). 24 Patogênese O vírus replica em células epiteliais de todo o trato respiratório, como mucosa nasal, tonsilas, traqueia, pulmão e linfonodos traqueo-bronquiais (Nicholls et al., 2007). A infecção geralmente fica restrita ao trato respiratório, mas a viremia de curto prazo e título baixo já foi detectada em casos raros (Brown et al., 1993). No entanto, o vírus não foi detectado em nenhum tecido não respiratório (Vincent et al., 2009a; Brookes et al., 2010). O tropismo por tecidos específicos ocorre devido à expressão de proteases necessárias para a ativação viral (Rot et al., 1995). O pulmão é o principal órgão alvo da infecção e títulos virais podem chegar a 10 9 dose infecciosa 50% em ovo (EID 50 /ml) (Haesebrouck et al., 1985), uma vez que o IAV apresenta tropismo elevado pelo epitélio bronquiolar e se replica rapidamente nessas células (Brown et al., 1993; Olsen et al., 2006a). As lesões celulares causadas diretamente pelo IAV estão atribuídas a apoptose, desencadeada pelas proteínas NA e PB1-F2 (Schultz-Cherry e Hinshaw, 1996; Gibbs et al., 2003). No entanto, as citocinas próinflamatórias iniciais, produzidas por células não imunes no local da infecção durante a fase aguda, possuem papel fundamental para o desenvolvimento da reação inflamatória local e de alguns sinais clínicos sistêmicos. As citocinas iniciais como o Interferon-α (IFNα), fator de necrose tumoral-α (TNFα), interleucina-1 (IL-1) e IL-6, têm sido associadas à ocorrência de febre, prostração e anorexia (Van Reeth, 2000; Jo et al., 2007). TNFα e IL-1 estimulam moléculas quimioatrativas de neutrófilos e macrófagos, como IL-8, levando à rápida infiltração dessas células fagocíticas no trato respiratório (Ulich et al., 1991). As citocinas tardias são produzidas principalmente pelos linfócitos T após reconhecimento de antígenos, e são moduladores importantes da resposta imune específica (La Gruta et al., 2007). Apesar de participar no estímulo à

27 resposta inflamatória, as citocinas iniciais e tardias também contribuem para a injúria pulmonar, com aumento da permeabilidade vascular, hemorragia e edema (Ulich et al., 1991). A duração da infecção pelo IAV é curta e o clearance viral é extremamente rápido. Não é possível detectar o vírus na secreção nasal e no pulmão a partir de sete dias após a infecção natural ou experimental (Brown et al., 1993; Jo et al., 2007). Sinais clínicos e lesões A Influenza suína é uma doença aguda de rebanho, com alta morbidade (pode chegar a 100%) e baixa mortalidade (inferior a 1%). As principais perdas econômicas da Influenza resultam dos altos custos de medicações, mortalidade aumentada e produtividade diminuída nos rebanhos acometidos. O aparecimento da doença é súbito, após um período de incubação de um a três dias e recuperação rápida após quatro a sete dias (Maes et al., 1984). A doença clínica geralmente é restrita a animais susceptíveis sem proteção imune contra o vírus, e a faixa etária mais acometida em propriedades de ciclo completo é de animais com idade de até 16 semanas (creche, recria e terminação) (Loeffen et al., 2009). As manifestações clínicas da infecção pelo IAV em suínos são febre (40,5 a 41,7 C), apatia, inapetência, prostração e anorexia, que resultam em perda de peso significativa. Tosse, espirros, conjuntivite, rinite e descargas nasais são sinais comuns da infecção. Sinais de angústia respiratória, como respiração abdominal e com a boca aberta, podem ocorrer (Alexander e Brown, 2000; Richt et al., 2003). Ocasionalmente alguns sinais reprodutivos podem ser observados, como abortos, natimortos, infertilidade e leitegadas pequenas e fracas (Wallace e Elm, 1979; Vannier, 1999; Wesley, 2004). Além da doença clínica aparente, a doença subclínica ocorre frequentemente. Diversos fatores podem alterar a gravidade de sinais clínicos, como estado imune do animal, idade, infecções concomitantes e condições climáticas (Olsen et al., 2006a). Apesar de geralmente resultar em doença branda, a infecção por IAV em suínos pode apresentar complicações quando ocorre infecção intercorrente com outros patógenos. A infecção bacteriana secundária com Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis e Streptococcus suis tipo 2 pode aumentar a gravidade e a duração de sinais clínicos da Influenza (Thacker et al., 2001; Choi et al., 2003). A co-infecção com vírus respiratórios, como Coronavírus Respiratório Suíno (PRCV), Circovírus Suíno tipo 2 (PCV2) ou Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína (PRRSV), também pode agir como fator de complicação da Influenza, aumentando o curso e a gravidade da doença (Choi et al., 2003; Hansen et al., 2010). As alterações patológicas são predominantes nos lobos apical e cardíaco e os lobos diafragmático e acessório são menos afetados. Macroscopicamente observa-se consolidação vermelho-escura bem demarcada, geralmente na porção crânioventral. Edema pulmonar grave, principalmente nos septos interlobulares, e pleurite serosa ou serofibrinosa são achados comuns na necropsia, além de vias aéreas repletas de exsudato fibrinoso a mucopurulento e linfonodos mediastinais edemaciados (Olsen et al., 2006a). Achados microscópicos comuns consistem em necrose e descamação das células epiteliais bronquiolares e acúmulo de restos celulares, fluído proteináceo e leucócitos no lúmen de vias aéreas (Van Reeth et al., 2008). Também podem ser observadas 25

28 infiltração leucocitária peribronquial e perivascular, e pneumonia intersticial de intensidade variada (Richt et al., 2003). Resposta imune A resposta imune contra a infecção com IAV é rápida, envolve tanto a imunidade humoral como a celular, e resulta no clearance viral completo dentro de uma semana após a infecção. A infecção leva à ativação da imunidade inata e liberação de IL-6 e IFNα pelas células epiteliais, além de estimular a atividade de células natural killers (NK) para lise de células infectadas (Wright et al., 2007). A correlação entre a resposta humoral e a resposta mediada por células é necessária para desencadear a imunidade protetora contra a infecção com o vírus influenza. A imunidade humoral tem papel importante na prevenção e resistência contra a infecção e contra a manifestação clínica. Os anticorpos produzidos durante a infecção são direcionados contra as proteínas HA, NA, M e NP, no entanto apenas aqueles específicos contra HA e NA são capazes de neutralizar a infectividade viral, enquanto que os demais podem interferir na liberação da progênie viral da célula hospedeira (Cox et al., 2004). Todas as principais imunoglobulinas (IgA, IgG e IgM) podem ser identificadas na infecção pelo IAV em soro e lavados nasal e broncoalveolar de suínos (Heinen et al., 2000). Anticorpos específicos contra o vírus Influenza podem ser detectados no soro três dias após a infecção e em suabes nasais quatro dias após a infecção (Lee et al., 1993). A IgA secretória é a principal imunoglobulina neutralizante contra o IAV no trato respiratório e é detectada em altos títulos na secreção nasal e broncoalveolar após a fase aguda (Heinen et al., 2000). A proteção clínica contra a Influenza geralmente está diretamente relacionada aos níveis de anticorpos capazes de inibir a hemaglutinação (HI), que são direcionados 26 contra a proteína HA (Cox et al., 2004). Os anticorpos HI podem ser detectados de sete a 10 dias após a infecção e apresentam pico entre duas e três semanas, se mantendo em níveis elevados por várias semanas. Os títulos começam a declinar por volta de 10 semanas após a infecção, mas são mantidos até o abate (Renshaw, 1975; Desrosiers et al., 2004; Van Reeth et al., 2004). Títulos consideráveis de anticorpos podem ser detectados até seis meses após a infecção (Olsen et al., 2006a). Após a recuperação da infecção primária, é estabelecida a imunidade duradoura. Diante de um contato secundário, o sistema imune monta resposta rápida e forte. No entanto, a proteção imune humoral contra uma nova infecção só ocorre contra vírus homólogos, mas a infecção com vírus diferentes pode ocorrer (Vincent et al., 2008). Anticorpos maternos são capazes de reduzir a manifestação clínica, mas não impedem a infecção com vírus diferentes. Em rebanhos com circulação viral contínua, animais lactentes podem se infectar e eliminar vírus nas secreções mesmo na presença de anticorpos passivos, mas quanto maior os níveis de anticorpos, menor a gravidade de sinais clínicos (Renshaw, 1975; Loeffen et al., 2003a; Kitikoon et al., 2006; Vincent et al., 2008). A imunidade celular tem papel importante na recuperação da Influenza e no clearance viral (Flynn et al., 1998; Woodland et al., 2001), mas não contribui significativamente na prevenção da infecção. Linfócitos específicos para o IAV foram detectados no sangue, linfonodos do trato respiratório, mucosa faríngea e nasal e no baço de animais infectados experimentalmente (Larsen et al., 2000). A lise de células infectadas é mediada por linfócitos TCD8+ em associação com anticorpos específicos e com o Complemento (Cox et al., 2004). A resposta T citotóxica contra o IAV pode ser detectada a partir de sete dias de infecção em suínos e os TCD8+ apresentam reatividade

29 cruzada contra vírus Influenza do mesmo tipo (Larsen et al., 2000). A lise de células infectadas por células TCD8+ ocorre através da apresentação de peptídeos pelos receptores do Complexo de Histocompatibilidade Principal de classe I (MHC I) e sua atividade é direcionada aos epítopos mais conservados das proteínas NP e M (Heinen, 2002). Diagnóstico O diagnóstico definitivo da infecção pelo IAV em suínos deve ser realizado através da associação entre diagnóstico clínico e laboratorial, uma vez que outras afecções respiratórias apresentam sinais clínicos semelhantes. A Influenza pode ser diagnosticada através de isolamento viral, detecção de RNA e/ou proteínas virais, ou pela detecção de anticorpos específicos. A detecção de anticorpos contra o IAV não indica necessariamente infecção atual, uma vez que anticorpos podem ser detectados vários meses após a infecção (Olsen et al., 2006a). O IAV pode ser isolado de secreções respiratórias coletadas através de suabe nasal ou naso-faringeal de animais vivos, durante a fase aguda da doença. Em animais eutanasiados ou que morrerem durante o estágio agudo, amostras de tecido de traqueia ou pulmão podem ser utilizadas para isolamento. Suabes e amostras de tecido devem ser mantidos refrigerados a 4 C para serem testados em até 48 horas. Em caso de estoque por maior período, as amostras devem ser mantidas a -80 C, uma vez que o vírus não é estável a -20 C (OIE, 2010). As suspensões preparadas a partir de suabes nasais ou de tecidos podem ser inoculadas na cavidade alantoide de ovos embrionados com 10 a 11 dias de incubação ou em cultura de células. A confirmação da presença do vírus é realizada através da reação de Hemaglutinação (HA) (Meguro et al., 1979; Clavijo et al., 2002). A técnica padrão para isolamento do vírus influenza é a inoculação em ovos embrionados, entretanto devido à sua longa duração, o isolamento em cultura de células Madin- Darby de rim canino (MDCK) é amplamente utilizado. Entretanto, é necessária a utilização de meio de cultura contendo tripsina, importante para a clivagem da HA (Tobita et al., 1975; Herman et al., 2005). Técnicas moleculares para identificar material genético do vírus vêm sendo aprimoradas e largamente utilizadas no diagnóstico da Influenza, uma vez que apresentam alta sensibilidade, rapidez de resultados e possibilidade de teste de grande número de amostras ao mesmo tempo (Hall et al., 2009). A transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) tem sido amplamente utilizada na detecção de vírus humanos e animais (Schorr et al., 1994; Lorusso et al., 2010), e algumas RT-PCR multiplex para detecção e subtipagem simultâneas do vírus já foram desenhadas (Choi et al, 2002b; Lee et al., 2008). A RT- PCR em tempo real é amplamente utilizada, apresenta maior sensibilidade e segurança que a RT-PCR convencional, além de gerar resultados mais rápidos (Spackman et al., 2002). Os testes rápidos para detecção do vírus influenza (RIDT) detectam antígenos virais em secreções respiratórias (lavados ou suabes) através de imunoensaios enzimáticos ou ópticos, geram resultados rápidos (30 minutos) e têm custo baixo, mas sua eficiência depende do tipo e qualidade da amostra e do tipo do vírus Influenza a ser testado (Gavin e Thomson, 2003; CDC, 2009a). Mas esses testes parecem ter baixa sensibilidade para o vírus pandêmico 2009 (Drexler et al., 2009). Atualmente, a reação de inibição da hemaglutinação (HI) é o método sorológico mais utilizado para detecção da infecção causada pelo IAV. Esse teste baseia-se na habilidade da proteína HA da superfície viral de aglutinar eritrócitos e na presença no soro de anticorpos capazes de inibir tal atividade. 27

30 Alguns problemas do teste estão relacionados à presença de inibidores inespecíficos da hemaglutinação ou à ocorrência frequente de alterações genéticas dos vírus circulantes, que podem levar a resultados errôneos (Wood et al., 1994; Julkunen et al., 1985). Além da HI, também podem ser utilizados o teste de soro neutralização (SN) e o ensaio de imunoadsorção ligada à enzima (ELISA) (Julkunen et al., 1985). Atualmente existem testes ELISA comerciais disponíveis para detecção de anticorpos contra H1N1 e H3N2 (Lee et al., 1993; Leuwerke et al., 2008), que são de fácil execução e geram resultados rápidos, mas que demonstraram uma sensibilidade reduzida e custo elevado (Yoon et al., 2004). A SN detecta anticorpos neutralizantes capazes de impedir a infecção do vírus em células (Leuwerke et al., 2008). Esse teste é trabalhoso e é vírus-específico (Julkunen et al., 1985). A existência de anticorpos maternos contra o IAV em leitões lactentes ou desmamados pode levar à ocorrência de resultados falso-positivos nos métodos sorológicos (Kitikoon et al., 2006). Outros métodos de detecção do IAV ou seus antígenos são a reação de imunofluorescência (IF) em tecido pulmonar, células nasotraqueais ou lavado broncoalveolar; ou imunohistoquímica (IHQ) em tecidos fixados em formol e embebidos em parafina (Vincent et al., 1997). A IF gera resultados mais rápidos que o isolamento, mas exige habilidade técnica e necessita de microscópio de fluorescência (Rabalais et al., 1992; Selleck et al., 2003). A IHQ é um teste relativamente rápido, de baixo custo e de fácil execução. O vírus presente em células epiteliais, macrófagos ou pneumócitos, pode ser visualizado e sua presença pode ser associada a lesões microscópicas características da doença (Vincent et al., 1997). Esse teste também é útil em estudos retrospectivos em que tecidos frescos podem não estar disponíveis (Haines et al., 1993). 28 Prevenção e vacinação As principais formas de prevenção da Influenza suína são a biossegurança e a vacinação. Algumas medidas podem prevenir a introdução do vírus em uma propriedade, como o controle da entrada de novos animais, quarentena, limpeza e desinfecção de instalações antes da entrada de um novo lote e prevenção do contato com outras espécies, especialmente aves ou humanos com sinais de influenza (Olsen et al., 2006a). Segregação e depopulação parcial de animais infectados, além de medidas rigorosas de higiene são essenciais para controlar a disseminação do IAV dentro de um plantel e para minimizar os efeitos da doença no rendimento econômico da granja (Kothalawala et al., 2006). A vacinação é o método específico mais utilizado na prevenção da Influenza suína, geralmente utilizado em fêmeas reprodutoras. As vacinas atuais são compostas por vírus inativado re-suspendido em adjuvante oleoso, sendo geralmente preparadas por propagação em ovos embrionados (Ma et al., 2010). A vacinação induz altos títulos de IgG pulmonar e sistêmica em cerca de 2-6 dias, que reduzem a ocorrência e gravidade de sinais clínicos, mas a proteção total só ocorre quando a proteína HA vacinal é geneticamente relacionada à HA do vírus que causa a infecção (vírus homólogos). No entanto, a replicação e eliminação viral em secreções respiratórias são reduzidas (Poland et al., 2001; Kothalawala et al., 2006). A vacinação em plantéis susceptíveis geralmente consiste de duas aplicações pela via intramuscular (IM) com intervalo de duas a quatro semanas entre elas (Olsen et al., 2006a). Vacinas comerciais para suínos contra IAV estão disponíveis em vários países. Como existem diferenças genéticas e antigênicas entre as cepas virais circulantes nos diferentes continentes, a composição vacinal também difere. Nos Estados Unidos, são utilizadas vacinas bivalentes contendo

31 ch1n1 e rearranjo triplo H3N2, mas também existem vacinas trivalentes ou mesmo pentavalentes contendo vírus de rearranjo (Kitikoon et al., 2006; Vincent et al., 2008; Vincent et al., 2010a). Na Europa, as vacinas utilizadas são compostas por vírus H1N1 (A/New Jersey/8/76 ou Sw/Netherlands/25/80) e vírus H3N2 (A/Port Chalmers/1/73) (Van Reeth et al., 2003). A constante variação genética que ocorre nos vírus influenza de suínos resultou numa ampla diversidade de IAV circulando nos suínos do mundo. A influenza suína não é mais considerada sazonal, e existe um número elevado de variantes virais circulando, dificultando, assim, a produção de vacinas comerciais eficazes. Consequentemente, o uso de vacinas autógenas com cepas específicas do rebanho de origem está aumentando como medida alternativa de controle da enfermidade (Vincent et al., 2008; Ma e Richt, 2010). A utilização de vacinas autógenas preparadas de culturas de vírus após inativação deve ser restrita àquele rebanho e de acordo com a legislação vigente no país, além de que o acompanhamento veterinário deve ser preconizado (BRASIL, 2003; Ma e Richt, 2010). Vacinas vivas modificadas são capazes de aumentar a imunidade local e promover proteção cruzada para outros subtipos (Thacker e Janke, 2008). Entretanto a utilização de vacinas vivas gera a possibilidade de rearranjo entre vírus vacinais e vírus de campo e o surgimento de novos vírus, portanto vacinas vivas para Influenza não estão disponíveis para suínos (Erdmann e Crabtree, 2006). Vacinas de DNA são uma alternativa para a proteção contra a Influenza e vêm sendo amplamente estudadas. Esse tipo de vacina utiliza DNA viral para a produção de antígenos virais intracelulares que serão apresentados por moléculas MHC I e MHC II, induzindo a resposta humoral e celular de longa duração (Thacker e Janke, 2008). Vacinas de DNA mostram-se vantajosas por levarem à produção de resposta imune contra diversos subtipos e não sofrerem interferência de anticorpos maternos (Kim e Jacob, 2009). Entretanto, testes experimentais mostraram que são eficientes apenas como estímulo primário e que existe a necessidade de revacinação com vacinas inativadas convencionais (Heinen et al., 2002; Larsen e Olsen, 2002). Além disso, existe a preocupação de integração do DNA vacinal à célula hospedeira, aumentando o risco de malignidade e ocorrência de doenças auto-imunes (Kim e Jacob, 2009). Vetores vacinais contra a infecção com IAV vêm sendo estudados para suínos, utilizando alphavirus (Vander Veen et al., 2009), adenovírus (Wesley et al., 2004) ou vírus da pseudoraiva (Tian et al., 2006). O uso de baculovírus vem sendo utilizado na vacinação de humanos e aves, mas ainda não é empregado em suínos (King Jr et al., 2009). Embora a ocorrência de antigenic drift nos suínos seja menos frequente que em humanos, a variabilidade genética e antigênica do IAV resulta na perda de eficácia vacinal devido à discordância entre o antígeno vacinal e a amostra viral circulante no campo. Dessa forma, a vigilância epidemiológica global do IAV é uma ferramenta necessária para a atualização frequente de cepas circulantes e para melhorar os resultados vacinais (Thacker e Janke, 2008; Ma e Richt, 2010). Além disso, outro obstáculo importante para a vacinação bem sucedida é a presença de anticorpos maternos, que consequentemente reduz a eficiência vacinal e aumenta a incidência da doença na fase em que os níveis de anticorpos colostrais reduzem. Anticorpos passivos podem suprimir a resposta de anticorpos e de linfócitos T específicos para o IAV resultante da vacinação (Kitikoon et al., 2006). 29

32 A cartografia antigênica é uma ferramenta importante para auxiliar na vacinação, é um método computacional que permite a visualização da distância antigênica entre antígenos e anti-soros, auxiliando na detecção de reação cruzada entre eles (de Jong et al., 2007; Garten et al., 2009; Lorusso et al., 2011). Além da vacinação, drogas antivirais podem ser utilizadas para controlar a Influenza. Bloqueadores dos canais de íon M2 (amantadina e rimantadina) e inibidores da NA (zanamivir e oseltamivir) são exemplos de drogas utilizadas no tratamento da Influenza em humanos. No entanto, não existe nenhum tratamento antiviral contra IAV aprovado para uso em suínos, e seu emprego não é economicamente viável (Vincent et al., 2008). 30

33 CAPÍTULO 2: EVIDÊNCIA SOROLÓGICA DA CIRCULAÇÃO DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS DE MINAS GERAIS, BRASIL 1 Introdução O vírus da influenza suína (SIV) é um Orthomixovirus que causa doença respiratória aguda em suínos. A doença é caracterizada por surtos explosivos, com alta morbidade e baixa mortalidade (Olsen et al., 2006a). Sinais clínicos comuns da influenza suína são hipertermia, anorexia, tosse e descargas nasais (Brown, 2000). Desde seu primeiro relato em 1931 (Shope, 1931), três subtipos de SIV têm circulado na população de suínos mundial (H1N1, H1N2 e H3N2), entretanto estes subtipos diferem na origem e caracterização genética em diferentes continentes e regiões (Olsen et al., 2006a). O vírus influenza suíno clássico H1N1 (ch1n1) era o subtipo predominante nos Estados Unidos (Chambers et al., 1991), mas a introdução de um novo vírus H3N2 em 1998 levou a rearranjos que resultaram na circulação de outros genótipos H1N1, bem como de novos subtipos H1N2 e H3N1 (Vincent et al., 2008). Na Europa, o vírus H1N1 tipo aviário se tornou o subtipo predominante infectando suínos, mas o vírus rearranjo H3N2 suíno também é endêmico em rebanhos suínos europeus (Van Reeth et al., 2008). A infecção pelo SIV na população suína brasileira não é bem definida, e apenas poucos estudos evidenciam essa infecção 1 Artigo publicado na revista Influenza and Other Respiratory Viruses, DOI: /j x. Ver ANEXO I. por diagnóstico sorológico (Brentano et al., 2002; Mancini et al., 2006). Minas Gerais é o Estado com o quarto maior efetivo de suínos do Brasil, representando 12,9% do total de animais. Além disso, o município com maior efetivo está situado em Minas (Uberlândia) (IBGE, 2010). Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a presença de anticorpos contra o vírus influenza em suínos e demonstrar sua circulação no Estado de Minas Gerais, Brasil. Material e Métodos Foram utilizadas 355 amostras de soro originadas de explorações de suínos de Minas Gerais, gentilmente cedidas pelo Laboratório Microbiologia Veterinária Especial (MICROVET). As amostras de sangue foram coletadas entre Janeiro e Março de 2009, anteriormente à ocorrência da pandemia H1N1 2009, através de punção da veia jugular. As amostras foram centrifugadas e, após separação do soro, mantidas a -20ºC até o processamento. O tamanho amostral e a localização das propriedades foram baseados na disponibilidade de amostras do banco de soros. Foram testados animais na idade de reprodução (marrãs e porcas) em 17 granjas comerciais de suínos distribuídas ao acaso no Estado de Minas Gerais, localizadas nas mesorregiões: Triângulo Mineiro; Zona da Mata; Metropolitana de Belo Horizonte; Sul e Sudoeste; Oeste; Norte e Noroeste de Minas (Fig. 2). Em cada propriedade foram testados pelo menos 10 animais. Os rebanhos eram de ciclo completo com sistema todos dentro - todos fora, localizados em áreas com alta densidade de suínos e sem histórico de vacinação para SIV. Nenhum sinal respiratório foi relatado nos animais amostrados. 31

34 Figura 2. Mapa das mesorregiões em que as granjas estudadas estavam localizadas. Cada amostra foi testada com três vírus referência, um humano A/WSN/1933 (H1N1) (H1N1h) e dois suínos: A/swine/Iowa/15/1930 (H1N1) (H1N1 SIV) gentilmente cedido pelo Laboratório Nacional Agropecuário em Minas Gerais (LANAGRO-MG); e A/swine/Iowa/8548-2/98 (H3N2) (H3N2 SIV) gentilmente cedido pela EMBRAPA Suínos e Aves. Os vírus foram cultivados em ovos embrionados com 10 dias de incubação. Os ovos foram inoculados na cavidade alantoide com 0,1mL de inóculo e incubados a C por 4 dias. Diariamente foi realizada a ovoscopia para detectar possível morte do embrião. Caso ocorresse morte nas primeiras 24 horas após a inoculação, o ovo era descartado, se a morte ocorresse após 24 horas o líquido alantoide era coletado, clarificado a 2000 rpm por 20 minutos e armazenado a -80ºC (WHO, 2002; OIE, 2010). As amostras de soros testadas contra os vírus H1N1 foram inativadas a 56 C por 30 minutos e tratadas com suspensão de Caolin 20% por 20 minutos. Em seguida foram tratadas com suspensão de hemácias de galo 0,5% por 30 minutos, para eliminar inibidores inespecíficos e aglutininas séricas. Após centrifugação a 1500rpm por cinco minutos foi coletado o sobrenadante (soro tratado) para ser utilizado na reação de inibição da hemaglutinação (HI) (WHO, 2002; OIE, 2010). Para serem testadas contra o H3N2 SIV, as amostras de soro foram tratadas com tripsina 0,4% a 56 C por 30 minutos, seguido por tratamento com periodato de potássio 0,01M por 15 minutos. A mistura foi então acrescida de glicerol 1% e incubada a temperatura ambiente por 15 minutos (Dowdle et al., 1979; Boliar et al, 2006). Para a HI, a diluição inicial utilizada para as amostras de soro tratado foi de 1:10. Foi então realizada a diluição seriada na base dois até 1: em tampão salina fosfato (PBS; NaCl 137 mm, KCl 2.7 mm, Na 2 HPO 4 10 mm, KH 2 PO 4 mm, ph7,4) em placas de fundo V de 96 poços, no volume de 25µL. Em seguida, 25µL do vírus referência (H1N1 SIV, H3N2 SIV ou H1N1h) contendo 4 unidades hemaglutinantes (4UHA/25µL) foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada a temperatura ambiente por 60 minutos. Finalmente, 50µL de suspensão de hemácias de galo 0,5% foram adicionados e a placa foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos. O título dos anticorpos foi determinado pelo inverso da maior diluição do soro capaz de inibir completamente a aglutinação das hemácias, em unidades de inibição da hemaglutinação (UHI). Foram utilizados controles de suspensão de eritrócitos e de soro positivo (diluição 1:64), obtido através de pool de soros testados previamente contra cada um dos antígenos utilizados. Uma coluna foi utilizada para controle de soros teste para observar a presença de inibidores inespecíficos (Pedersen, 2008). Os soros apresentando título de anticorpos igual ou superior a 40 foram considerados positivos (WHO, 2002; Choi et al., 2002a). Amostras com títulos iguais a 40 e 80 foram consideradas com título baixo; 160 e 320, título médio; e 640, título alto. Um rebanho era considerado 32

35 positivo se apresentasse ao menos um animal positivo. Intervalos de confiança de 95% foram calculados para as prevalências de rebanhos e animais e a estatística descritiva foi calculada para os títulos de anticorpos de rebanhos positivos e negativos. Resultados Dos 355 soros testados, 158 (44,5%) possuíam anticorpos contra o H1N1 SIV, 36 (10,1%) contra H3N2 SIV e 136 (38,3%) contra H1N1h. Dos 17 rebanhos testados, 11 (64,7%) foram considerados positivos para H1N1 SIV, 4 (23,5%) para H3N2 SIV e 10 (58,8%) para H1N1h (Tab. 2). As médias de títulos HI para rebanhos positivos e negativos estão relatadas na Tab. 3. As médias e medianas dos títulos de anticorpos foram relativamente baixas nos rebanhos positivos para os vírus H1N1 suíno e humano, com valores próximos ao ponto de corte, o que é corroborado pelo percentual elevado de animais negativos e com títulos baixos para esses vírus na maior parte das granjas (Fig. 3). Já para o H3N2 SIV, tanto a média como a mediana dos títulos HI nos rebanhos positivos foram abaixo do ponto de corte, o que se justifica pelo alto percentual de animais nãoinfectados nesses rebanhos (Fig. 3). O percentual de fêmeas positivas para múltiplos antígenos foi calculado (Tab. 4). Figura 3. Distribuição dos títulos de anticorpos contra o vírus da influenza suína (SIV) H1N1, H3N2 SIV e vírus influenza humano H1N1 nas granjas positivas. Amostras negativas (titulo <40); com título baixo (40 e 80); título médio (160 e 320); e título alto ( 640). 33

36 Tabela 2. Ocorrência da influenza suína no Brasil para animais e rebanhos. H1N1 SIV H3N2 SIV H1N1h Variável Animal Rebanho Animal Rebanho Animal Rebanho Número de amostras testadas Número de positivos Prevalência, % (IC 95%) 44,5 (39,33 49,67) 64,7 (41,98 87,42) 10,1 (6,97 13,23) 23,5 (3,34 43,66) 38,3 (33,24 43,36) 58,8 (35,4 82,2) IC = Intervalo de confiança; H1N1 SIV = H1N1 suíno; H3N2 SIV = H3N2 suíno; H1N1h = H1N1 humano Tabela 3. Títulos de Inibição da Hemaglutinação para rebanhos positivos e negativos. Rebanhos Positivos Rebanhos Negativos Variável H1N1 SIV H3N2 SIV H1N1h H1N1 SIV H3N2 SIV H1N1h Número de valores Título mínimo 29,97 14,64 19,10 11,89 10,34 10,68 Mediana 46,30 22,36 46,08 13,19 11,49 12,03 Título máximo 146,72 26,70 118,19 16,62 14,32 20,00 Média 59,34 21,02 47,50 13,58 11,59 13,27 Desvio padrão 16,77 13,27 16,82 11,45 10,91 12,61 Erro padrão 11,69 11,52 11,79 10,57 10,25 10,91 IC 95% 41,90-83,98 13,41-32,97 32,76-68,92 11,78-15,66 11,00-12,22 10,71-16,44 IC = Intervalo de confiança; H1N1 SIV = H1N1 suíno; H3N2 SIV = H3N2 suíno; H1N1h = H1N1 humano Tabela 4. Percentual de animais com anticorpos contra múltiplos antígenos de vírus influenza em Minas Gerais, Brasil. H1N1 H3N2 H1N1 SIV + H1N1 SIV + H3N2 SIV + Três H1N1h SIV SIV H3N2 SIV H1N1h H1N1h antígenos Número Percentual (%) 16,05 1,13 11,83 3,38 20,84 1,41 4,22 H1N1 SIV = H1N1 suíno; H3N2 SIV = H3N2 suíno; H1N1h = H1N1 humano Discussão Foi observada uma alta ocorrência de animais com anticorpos anti-influenza H1N1 nas amostras analisadas no Estado de Minas Gerais, provavelmente devido à infecção prévia, pois a vacinação não era realizada nos rebanhos avaliados. No entanto, um menor percentual de animais obteve resultado positivo para o subtipo H3N2. Até o momento, poucos estudos foram realizados no Brasil com o intuito de demonstrar a 34

37 presença de anticorpos contra o vírus influenza em suínos, e este é o primeiro estudo a relatar a distribuição de animais com anticorpos anti-influenza em Minas Gerais. As taxas observadas neste estudo de 44,5% e 38,3% de animais com anticorpos contra H1N1 suíno e humano, respectivamente, são semelhantes àquelas encontradas em estudos de prevalência da influenza em suínos nos Estados Unidos (66,3%), Itália (46,4%) e Espanha (38,5%) (Choi et al., 2002a; Van Reeth et al., 2008). Entretanto, a prevalência de anticorpos anti-siv em outro estudo na Espanha foi inferior à observada aqui, e evidências mostram que um SIV H1N2 recentemente introduzido nos rebanhos suínos está amplamente distribuído naquele país (Maldonado et al., 2006). Mancini et al. (2006) observaram taxa muito elevada (85,3%) de animais positivos para H1N1 em um único rebanho do Estado de São Paulo, enquanto que Brentano et al. (2002), em um estudo abrangendo diversos Estados brasileiros, observaram uma prevalência para esse subtipo viral muito inferior (2,2%) àquela encontrada no presente estudo, mas foi utilizado na HI apenas antígeno humano. Já para H3N2, estes estudos revelaram taxas de 85,3% e 16,7%, respectivamente. A taxa de 10,1% de animais positivos para H3N2 encontrada no presente trabalho foi semelhante à de 20% observada em um estudo recente realizado no Estado do Paraná (Caron et al., 2010) e também semelhante à taxa observada na Irlanda (4,2%) anteriormente (Van Reeth et al., 2008). Entretanto, foi inferior às ocorrências observadas na Itália (41,7%), Espanha (38%) e Estados Unidos (33,7%) (Choi et al., 2002a; Van Reeth et al., 2008). Mesmo que tenha sido observado um percentual elevado de animais positivos para H1N1, poucos animais apresentaram títulos altos, provavelmente por se tratar de circulação viral antiga ou pressão de infecção baixa nos rebanhos. Dessa forma, embora anticorpos contra o SIV tenham sido detectados, os animais não apresentavam proteção imune adequada. A proporção de animais com anticorpos para ambos os vírus H1N1 (20,84%) foi superior à proporção para apenas um deles (16,05% para H1N1 SIV e 11,83% para H1N1 humano). Alguns animais foram positivos para ambos os vírus suínos (3,38%) e uma porcentagem de animais também foi positiva para todos os três antígenos (4,22%). Portanto, diferentes cepas virais de influenza estão co-circulando na população de suínos brasileiros, causando infecção mista e possibilitando o rearranjo genético entre esses vírus. Também foi observada uma alta prevalência de granjas positivas para H1N1 SIV (64,7%) e H1N1 humano (58,3%) neste estudo, semelhante àquela observada em rebanhos na Coréia (71,5%) (Jung et al., 2002), e ligeiramente inferior à prevalência de 83,1% observada em porcas no Canadá (Poljak et al., 2008). Para H3N2, a ocorrência encontrada neste estudo foi inferior às observadas para H1N1, além de ser inferior à observada no estudo recente no Paraná (46%) (Caron et al., 2010). Os resultados positivos tanto para H1N1 suíno e humano, como para H3N2 suíno em amostras coletadas previamente à ocorrência da pandemia de 2009 indica a circulação do vírus Influenza em suínos no Brasil anterior à introdução do vírus pandêmico. Além disso, os resultados obtidos neste estudo indicam que o vírus influenza está disseminado em Minas Gerais e que pode ser endêmico na população de suínos do Brasil. 35

38 CAPÍTULO 3: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO CLÍNICO- PATOLÓGICA DO VÍRUS INFLUENZA EM SUÍNOS NO BRASIL Introdução A primeira descrição clínica da influenza em suínos ocorreu em 1918, simultaneamente à ocorrência da Gripe Espanhola em humanos (Koen, 1919 citado por Zhimer et al., 2009; Webster, 1992). Desde então, os vírus influenza A são associados ao complexo de doença respiratória suína (CDRS), em conjunto com outros patógenos como Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (PRRSV) e circovírus suíno tipo 2 (PCV2) (Thacker et al., 2001; Vincent et al., 2008). A influenza em suínos é causada pelo vírus influenza A (IAV), que é envelopado, com genoma de RNA segmentado, pertencente à família Orthomyxoviridae (Palese e Shaw, 2007). Três subtipos antigenicamente distintos de influenza A circulam em suínos no mundo, H1N1, H3N2 e H1N2, e são endêmicos e frequentemente isolados nos Estados Unidos, Europa e Ásia (Van Reeth, 2007). A influenza suína é uma doença respiratória aguda, cuja gravidade depende de diversos fatores, incluindo estado imune do hospedeiro, cepa viral e infecções secundárias (Vincent et al., 2008). Os sinais clínicos da influenza em suínos são semelhantes aos observados em humanos, incluindo febre, tosse, espirros, descarga nasal, angústia respiratória, prostração, anorexia e conjuntivite (Alexander e Brown, 2000; Richt et al., 2003). As lesões macroscópicas associadas à influenza em suínos são áreas de 36 consolidação pulmonar vermelho escura bem delimitada, multifocal a difusa, com localização principalmente crânio-ventral. Microscopicamente observa-se necrose do epitélio bronquiolar e presença de restos celulares, fluído proteináceo e leucócitos no lúmen de vias aéreas. A necrose é acompanhada de infiltrado linfocitário peribronquiolar e pneumonia intersticial (Vincent et al., 2008). Estudos anteriores mostraram que o SIV está disseminado nos suínos brasileiros (Brentano et al., 2002; Mancini et al., 2006; Ciacci-Zanella et al., 2011a; Schaefer et al., 2011a,b,c), mas a enfermidade não está bem caracterizada nos suínos nacionais. O objetivo deste estudo foi identificar e realizar a caracterização clínica e patológica da influenza em suínos no Brasil. Material e Métodos 1. Amostras clínicas Foram utilizadas 86 amostras de pulmão de casos de diagnóstico de rotina recebidas pelo Laboratório de Diagnóstico Instituto de Pesquisas Veterinárias Especializadas (IPEVE) e por Médicos Veterinários após visita técnica. As amostras foram coletadas durante surtos de doença respiratória em 37 rebanhos suínos de ciclo completo e duas Unidades Produtoras de Leitões (UPL), com sistema todos dentro todos fora sem histórico de vacinação para o SIV, localizados em Minas Gerais (24), São Paulo (2), Paraná (1), Rio Grande do Sul (4), Santa Catarina (1) e Mato Grosso (7). Os dados clínicos foram obtidos junto ao laboratório após serem fornecidos pelos proprietários e médicos veterinários. Os fragmentos foram coletados assepticamente durante a necropsia, resfriados e processados em até 48 horas após a coleta. As amostras de tecido foram maceradas, pesadas e acrescidas de meio essencial mínimo (MEM) contendo antibióticos

39 (200U/mL de penicilina, 200µg/mL de estreptomicina e 1,25µg/mL de anfotericina B) para obter uma suspensão 10% p/v. A mistura foi então centrifugada a 2000 rpm a 4ºC por 30 minutos e o sobrenadante foi coletado e filtrado com filtro de seringa 0,22µm (Clavijo et al., 2002). Uma porção do tecido original e uma alíquota da suspensão 10% p/v foram armazenadas a 80ºC. A detecção viral nos fragmentos de pulmão foi realizada pelo isolamento viral em cultura de MDCK, PCR em tempo real (PCRrt) e Imuno-histoquímica (IHQ) (Fig. 4). Figura 4. Figura esquematizando os procedimentos realizados para detecção do vírus influenza em fragmentos de pulmão suíno. 2. Isolamento viral em cultivo celular Para isolamento viral, foram utilizadas monocamadas confluentes de células MDCK em placas de 24 poços. As células foram cultivadas na concentração de 8x10 4 células/cm 2, em MEM contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) e antibióticos (200U/mL de penicilina, 200µg/mL de estreptomicina e 1,25µg/mL de anfotericina B), e mantidas em atmosfera umidificada com 5% de CO 2 a 37ºC. A monocamada foi lavada três vezes com PBS esterilizado. Para cada amostra, 0,2mL da suspensão 10% p/v de pulmão com diluição 1:2 em MEM de inoculação (contendo albumina sérica bovina 5% e antibióticos) foram inoculados em três poços de cultivo celular. O inóculo foi incubado com a monocamada a 37ºC por 60 minutos em estufa com 5% de CO 2. Foi então acrescido MEM contendo tripsina (2 µg/ml) e as placas foram incubadas a 37ºC e 5% de CO 2 por até sete dias e avaliações diárias do efeito citopático (ECP) foram realizadas. O ECP é caracterizado por arredondamento de células, formação de grumos e lise da monocamada (OIE, 2010). Após observação de ECP ou após sete dias da inoculação, o sobrenadante foi coletado assepticamente e testado para atividade hemaglutinante pela reação de hemaglutinação (HA). Amostras que apresentaram hemaglutinação positiva foram consideradas positivas. Na ausência de hemaglutinação, uma nova passagem em MDCK foi realizada (WHO, 2002). 37

40 3. Reação de hemaglutinação (HA) A reação de hemaglutinação (HA) foi realizada para confirmar o isolamento viral e para a titulação viral. Cinquenta µl de sobrenadante de cada amostra foram diluídos em série na base dois até 1:1.024 em placas de fundo V de 96 poços. Os sobrenadantes foram então incubados com mesmo volume de suspensão de hemácias de galo a 0,5% por 30 minutos ou até que botões de células fossem observados no fundo dos poços de controle de hemácias (última coluna) (Killian, 2008). Para cada placa foi utilizada a amostra referência A/swine/Iowa/15/1930 (H1N1) como controle do vírus. O título de hemaglutinação foi determinado pelo inverso da maior diluição capaz de aglutinar completamente as hemácias. 4. Imunocitoquímica Para confirmar a replicação viral nas células inoculadas e o resultado do isolamento, os sobrenadantes das amostras positivas na HA foram testados em duplicata pela imunocitoquímica (ICQ). Os sobrenadantes foram inoculados com diluição 1:10 em MEM com tripsina, em placas de 96 poços com monocamadas confluentes de MDCK. Após 24 horas as placas foram fixadas com formalina 4% em PBS por 30 minutos a temperatura ambiente. Para coloração das placas foi utilizado o protocolo da imunohistoquímica detalhado a seguir, com anticorpo monoclonal anti-influenza A contra a nucleoproteína viral, pelo método da streptavidina-biotina marcada com peroxidase e revelação com solução de cromógeno AEC (3-amino-9-etilcarbazol). 5. Titulação viral de amostras isoladas Foram utilizadas placas de 96 poços com monocamadas confluentes de MDCK para a titulação viral de amostras positivas no isolamento. A monocamada foi lavada com PBS esterilizado e o sobrenadante obtidos após o isolamento viral de cada amostra foi testado em triplicata em MEM contendo tripsina em diluições seriadas na base dez, de 10-1 a A última linha foi utilizada como controle negativo, contendo apenas meio de cultura. As amostras foram inoculadas e incubadas por 48 horas, e então os sobrenadantes foram submetidos à reação de hemaglutinação. O título viral foi calculado pela dose infecciosa 50% em cultura de tecido (TCID50/mL) utilizando o método de Reed e Muench (Reed e Muench, 1938). 6. Extração de RNA e transcrição reversa O RNA viral foi extraído de 140µL de sobrenadante após isolamento, utilizando o kit QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, EUA) de acordo com especificações do fabricante. Para a transcrição reversa, 10 µl de RNA (1-2µg) foram aquecidos por 2 minutos a 94ºC e imediatamente resfriados em gelo. O RNA foi então acrescido de 0,2µM de primer universal para vírus Influenza (primer Uni12 5 -AGCAAAAGCAGG-3 ), complementar à terminação 3 conservada dos segmentos de RNA dos vírus influenza A (Hoffmann et al., 2001), e 0,2µM de primer reverso para o gene da proteína ribossomal S26 canina (Primer S26 5 -CGATTCCGGACTAC CTTGCTGTG-3 ). A mistura foi aquecida a 70ºC por 5 minutos para retirar estruturas secundárias, e imediatamente resfriada em gelo. A transcrição reversa foi realizada a 42ºC por 60 minutos utilizando 100 unidades de transcriptase reversa M-MLV (Promega, Madison, WI, EUA), 5 µl de tampão de reação 5X, 0,8mM de cada dntp, 40 unidades de inibidor de ribonuclease RNaseOUT (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e água livre de RNAse para o volume final de 25 µl. 38

41 7. PCR em tempo real Antes da análise quantitativa, todas as amostras foram previamente submetidas a PCR em tempo real (PCRrt), pela análise de presença/ausência, para confirmar a infecção por IAV nos animais coletados. Foram utilizados primers e sondas para o segmento M do vírus influenza e o protocolo recomendado pelo Center for Disease Control and Prevention/Organização Mundial de Saúde (CDC/OMS) (WHO, 2009), com algumas modificácões. A PCRrt foi realizada utilizando-se sistema TaqMan de detecção, um par de iniciadores para detecção de ácidos nucléicos do vírus Influenza A baseados em sequência conservada do segmento da matriz (InfA) e um par de iniciadores para detecção do gene da proteína ribossomal S26 canina (S26) para controle interno da reação. Para cada amostra foram realizadas duas reações de amplificação, uma para Influenza e outra para controle interno, em duplicata. As sequências de iniciadores e sondas estão descritas na Tab. 5. Tabela 5. Conjunto de iniciadores e sondas para uso na PCR quantitativa em tempo real para detectar ácidos nucléicos do vírus influenza após isolamento viral. Iniciadores e Sondas Sequência (5 >3 ) InfA Forward InfA Reverse Sonda InfA* S26 Forward S26 Reverse GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG CGT GCT TCC CAA GCT GTA CGT GA CGA TTC CGG ACT ACC TTG CTG TG Sonda S26* CTC CAT TAC TGC GTG AGT TGT GCC A *As sondas foram marcadas com fluorocromo repórter 6-carboxifluoresceína (FAM) na extremidade 5 e com quencher 6-carboxi-tetrametilrodamina (TAMRA) na 3. A amplificação foi realizada em uma reação de 20µL utilizando o kit TaqMan Universal PCR Master Mix e o sistema de detecção Applied Biosystems 7500 Real- Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As concentrações de iniciadores InfA e S26 foram otimizadas a partir de 0,2µM, 0,4µM e 0,8µM, e as concentrações das sondas InfA e S26 foram otimizadas a partir de 0,05µM, 0,1µM e 0,2µM. As concentrações de 0,8µM e 0,2µM foram selecionadas como concentração final de iniciadores e sondas, respectivamente. As reações foram incubadas a 50 C por 2 minutos, 95 C por 10 minutos, seguidas de 45 ciclos a 95 C por 15 segundos e 60 C por 1 minuto. A fluorescência foi coletada a 60 C. A reação final otimizada consistiu em 10µL de TaqMan Universal PCR Master Mix (2X), 0,8µM de cada primer, 0,2µM da sonda, 2 µl de cdna (1µg) e água livre de RNAse para 20µL. Para cada reação foram utilizados dois controles negativos, um no-template e um de sobrenadante de MDCK não infectada, e um controle positivo de MDCK infectada com a amostra referência (A/swine/Iowa/15/1930 (H1N1)). Todas as amostras e o controle de MDCK não infectada deveriam apresentar curva de amplificação para S26 cruzando o threshold em até 38 ciclos. As amostras foram consideradas positivas se a curva de crescimento para InfA cruzasse o threshold em até 40 ciclos. 39

42 8. Clonagem e construção da curva padrão A amostra referência foi clonada e utilizada para a construção da curva padrão da PCR quantitativa em tempo real (qpcrrt), após ser submetida à transcrição reversa como descrito anteriormente. Para a obtenção do plasmídeo recombinante, os primers InfA forward e InfA reverse (Tab. 5) foram utilizados em uma reação de PCR convencional para gerar um amplicon de 106pb do gene M do vírus Influenza. A reação consistiu em 5µL de tampão 5X e 0,15µL de GoTaq HotStart DNA Polimerase (Promega, Madison, WI, EUA), 2mM de MgCl 2, 0,2mM de cada dntp, 0,2µM de cada primer, 1µL de cdna (0,5µg) e água livre de DNAse para 25µL. A amplificação foi realizada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 94 C por 5 minutos, seguida de 30 ciclos com desnaturação a 94 C por 30 segundos, anelamento de primers a 60 C por 30 segundos e extensão a 72 C por 3 minutos, concluindo com uma extensão final a 72 C por 7 minutos. Os produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose 1% e purificados utilizando a técnica freeze and squeeze (Hartman, 1991). O produto purificado foi, então, ligado ao vetor pgem- T-Easy (Promega, Madison, WI, EUA), numa reação que consistiu em 7,5µL de tampão 2X Rapid ligation, 1µL de vetor pgem-t Easy, 1,5µL de T4 DNA ligase e 5,0µL do produto da PCR purificado para um volume final de 15µL, de acordo com o protocolo do fabricante. A reação foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora e em seguida a 4 C overnight (aproximadamente 16 horas). A seguir, foi realizada a transformação em Escherichia coli XL10 quimicamente competente (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), adicionando-se ng da reação de ligação a 50µL de bactérias competentes com incubação por 30 minutos em gelo, 40 seguida de incubação a 42ºC por 90 segundos e imediato retorno ao gelo por 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 500µL de meio PSI (meio LB, KCl 10mM, MgSO 4 4mM) aos tubos, sendo esta mistura incubada a 37 C por 1,5 horas sob agitação a 180 rpm. Posteriormente, 200µl da suspensão de bactérias foram plaqueados em placas de petri contendo o meio LB (Luria Bertani, contendo ampicilina 100µg/mL). As placas foram incubadas invertidas a 37 C por 24 horas. O DNA plasmidial foi extraído utilizando o protocolo Miniprep, em que 4mL de bactérias crescidas foram centrifugados a 1000 g por 10 minutos, a temperatura ambiente. O pellet foi então ressuspendido em 200µL da solução GET/RNase (glicose ou dextrose; Tris-HCl ph 8,0 1M; EDTA 0,2M; Água Milli-Q q.s.p. 100mL; RNAse 10mg/mL), adicionando-se em seguida 400µL da solução de lise (SDS 20%; NaOH 10N; água Milli-Q q.s.p.100ml). Após três minutos, foram adicionados 400µL da solução de neutralização (solução de acetato de potássio 13%, ph 4,8). Os tubos foram incubados em gelo por minutos e então centrifugados a g a 8 C, por 15 minutos. Em seguida, 800µL do sobrenadante foram transferidos para tubos contendo 600µL de isopropanol, homogeneizados e centrifugados a g a 8ºC por 10 minutos. Foram adicionados 500µl de etanol 70% aos precipitados, que foram homogeneizados e centrifugados a g por cinco minutos. Os tubos foram drenados, o DNA foi diluído em água Milli- Q e quantificado por meio de um espectrofotômetro (NanoVue Plus Spectrophotometer/ GE Healthcare, Waukesha, WI, EUA). A confirmação do recombinante foi realizada através de digestão enzimática com a enzima de restrição PST I (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Aproximadamente 650ng de DNA plasmidial foram digeridos em 100U de PST I, 2 µl de tampão H 10X

43 (500 mm Tris-HCl, 100 mm MgCl 2, 10 mm Dithiothreitol, mm NaCl) e água para uma solução final de 20µL, e a mistura foi incubada a 37 C por uma hora, seguida de inativação a 80 C por 20 minutos. O produto da digestão foi confirmado em gel de agarose a 1%. O DNA plasmidial contendo o inserto de 106pb foi quantificado no NanoVue, e o número de moléculas/µl foi estimado (Whelan et al., 2003). Foram então realizadas diluições seriadas na base dez para a construção da curva padrão, que consistiu de seis diluições diferentes (10 7 ; 10 6 ; 10 5 ; 10 4 ; 10 2 ; 10 cópias de cdna). 9. Quantificação de amostras positivas pela PCRrt As amostras com resultado positivo na PCRrt foram submetidas à PCR quantitativa em tempo real (qpcrrt), através da quantificação absoluta. As reações foram realizadas como descrito acima, utilizando apenas iniciadores InfA. As amostras foram testadas em duplicata e a curva padrão foi utilizada em triplicata. 10. Diagnóstico histológico e imunohistoquímico Das 86 amostras de pulmão estudadas, 60 foram avaliadas no diagnóstico histológico e pela técnica de imuno-histoquímica (IHQ), pois as demais amostras foram recebidas congeladas. Os fragmentos de tecidos foram fixados em formol tamponado 10% e incluídos em parafina. As lâminas para análise histológica foram processadas por métodos histológicos de rotina (Luna, 1968) e coradas com hematoxilina-eosina (HE). Os fragmentos foram também corados pela IHQ utilizando anticorpo monoclonal anti- Influenza A (anti-nucleoproteína, clones A1, A3 Blend; Millipore, Billerica, MA, EUA), pelo método da streptavidina-biotina marcada com peroxidase (Universal LSAB + Kit/HRP, Rabbit/Mouse/Goat; Dako, Glostrup, Dinamarca) e solução de cromógeno AEC (3-amino-9-etilcarbazol). Os cortes de tecido foram desparafinizados em xilol e re-hidratados em concentrações decrescentes de etanol. A inativação de peroxidases endógenas foi realizada através da incubação com 3% de peróxido de hidrogênio diluído em PBS por 30 minutos. Em seguida foi realizada a digestão com Proteinase K 0,05% por cinco minutos a 37 C para aumentar a reatividade entre anticorpo e antígeno, e incubação com leite em pó desnatado 2,5% por 30 minutos para inibir a ligação inespecífica de anticorpos. A incubação com o anticorpo primário foi feita por 45 minutos a 37 C. Em seguida foi realizada a incubação com o anticorpo biotinilado por 30 minutos e com a Streptavidina por mais 25 minutos à temperatura ambiente. A reação foi revelada com solução AEC e montada em meio aquoso. Foi utilizado como controle positivo fragmento de pulmão de suíno em bloco de parafina gentilmente cedido pelo Dr. Kurt Rossow, do Laboratório de Diagnóstico Veterinário (VDL), da Universidade de Minnesota, EUA. Foram consideradas positivas as amostras com marcação de cor vermelha no citoplasma e/ou núcleo de células respiratórias. A marcação na IHQ foi classificada em grau I: focal leve; grau II: multifocal moderada; grau III: multifocal intensa. Todas as avaliações foram realizadas pelo mesmo observador. 11. Análise estatística Os dados foram tratados no Excel 2011 (Microsoft Corporation, USA) e Intervalos de Confiança de 95% (IC 95%) foram calculados para frequências de positivos nos testes utilizados. A análise estatística foi 41

44 realizada pelo GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Resultados 1. Achados clínicos As amostras estudadas eram de pulmões de suínos de creche, recria ou terminação, com idade entre 29 e 150 dias. Em geral, os sinais clínicos observados foram tosse, espirros, secreção nasal, hipertermia, apatia, anorexia, redução na ingestão de ração, perda de peso e refugagem, que permaneciam por cinco a 10 dias. Alguns rebanhos apresentaram mortalidade aumentada na fase de creche e recria. Em um rebanho, os sinais mais intensos foram observados em porcas, que apresentavam secreção nasal, tosse, hipertermia e taxa de abortos aumentada. Cinquenta amostras de pulmão foram testadas para infecção por outro(s) patógeno(s) respiratório(s) (dados não mostrados), e algumas apresentaram diagnóstico positivo para um ou mais agentes, como Mycoplasma hyopneumoniae (4), Pasteurella multocida (18), Bordetella bronchiseptica (7), Haemophilus parasuis (12), Streptococcus suis (11), PCV2 (23). Dessas, 32 apresentaram infecção concomitante com IAV, seja pela PCR em tempo real ou pela imunohistoquímica. 2. Isolamento viral, hemaglutinação e imunocitoquímica Das 86 amostras submetidas ao isolamento viral, 30 (34,9%; IC 95%: 24,83-44,97%) apresentaram ECP, sendo que cinco apresentaram ECP após dois dias, 10 após três dias, duas após quatro dias e 11 após cinco dias. Duas amostras apresentaram ECP apenas após a segunda passagem. Uma amostra não apresentou ECP em nenhuma das duas passagens, embora tenha apresentado resultado positivo na hemaglutinação, sendo considerada positiva no isolamento viral. Portanto, 31 amostras (36,0%; IC 95%: 25,86-46,14%) foram positivas no isolamento viral. Nenhum sobrenadante apresentou crescimento bacteriano após o isolamento viral (dados não apresentados). Os títulos de HA variaram de dois a 64, e os títulos virais variaram de 10 2,25 a 10 6,75 TCID50/mL, com média de 10 4,54 TCID50/mL. Todas as amostras positivas no isolamento viral apresentaram marcação positiva na imunocitoquímica. As amostras isoladas foram submetidas ao sequenciamento e análise filogenética dos genes HA e NA, e todos os isolados foram classificados como sendo do subtipo H1N1 (resultados apresentados no capítulo 5). 3. RT-PCR em tempo real e quantificação Ácidos nucléicos do vírus influenza foram detectados em 36 (41,9%; IC 95%: 31,5-52,3%) das 86 amostras submetidas à PCRrt. Os CTs variaram de 14,97 a 37,88, com média de 25,27 (Fig. 5), e o limiar de detecção dos primers InfA foi de 10 cópias de cdna/µl. Todas as amostras apresentaram amplificação para o gene S26, com CT variando de 24,45 a 35,15 e média de 29,61, indicando que a extração de RNA viral e a transcrição reversa foram realizadas adequadamente. Em todas as reações, o controle positivo apresentou amplificação para influenza A e S26, o controle notemplate não apresentou amplificação e o controle de MDCK não infectada mostrou amplificação apenas para S26 (Fig. 5). As 36 amostras positivas apresentaram quantificação variando de 10 1,22 a 10 7,85 cópias de cdna/µl (média 10 4,92 cópias/µl). A reação apresentou 95,469% de eficiência, Slope de 3,435 e R 2 de 0,997 (Fig. 6). 42

45 Figura 5. Gráficos de amplificação na PCR em tempo real para detecção de ácidos nucleicos da proteína ribossomal canina S26 (A) e do vírus influenza (B). Figura 6. Gráficos representativos da curva padrão da PCR em tempo real quantitativa para quantificação de ácidos nucleicos do vírus influenza. Gráfico da eficiência da reação (A) e de amplificação da curva padrão (B). A B 43

46 4. Diagnóstico histológico e imunohistoquímico A principal alteração macroscópica observada foi hepatização vermelho escura nos lobos cardíaco, apical e diafragmático, variando entre 30% e 70% de acometimento. As principais alterações microscópicas observadas nas amostras com resultado positivo na IHQ foram a presença de infiltrado de neutrófilos, linfócitos, e/ou macrófagos de intensidade variada no lúmen de alvéolos, brônquios e bronquíolos; necrose com descamação do epitélio bronquiolar e acúmulo de restos celulares no lúmen; além de espessamento de septo alveolar ou interlobular. Este espessamento de septos era devido ao infiltrado linfocítico e histiocitário, e, nos septos interlobulares, também devido a dilatação de linfáticos e acúmulo de material proteináceo amorfo (edema). Outras alterações observadas foram congestão, hemorragia e edema, acúmulo de muco no lúmen de brônquios e bronquíolos e hiperplasia de tecido linfoide bronco associado (BALT). Os principais diagnósticos histopatológicos encontrados foram bronquiolite necrotizante e broncopneumonia neutrofílica. Algumas alterações observadas estão ilustradas na Fig. 7 (A, C, E). Pleurite fibrino-purulenta foi observada em casos isolados. Das 60 amostras avaliadas pela IHQ, 38 (63,3%) tiveram marcação positiva para a presença de antígeno do vírus da influenza tipo A. Das amostras positivas, 14 (36,8%) foram classificadas com grau I, 15 (39,5%) com grau II e nove (23,7%) com grau III. Foi observada a marcação evidente no citoplasma e núcleo de células do epitélio bronquial, bronquiolar, pneumócitos e macrófagos alveolares, e com frequência em glândulas bronquiais (Fig. 7 B, D, F). Figura 7. Fotomicrografias de fragmentos de pulmão suíno com lesões histológicas (A, C, E) e detecção de antígenos do vírus Influenza A pela Imuno-histoquímica (B, D, F). (A): Parede bronquial com infiltrado neutrofílico e linfocítico intenso na lamina própria da mucosa e submucosa, particularmente ao redor de glândulas bronquiais. Hematoxilina e eosina, 100X. (B): Marcação positiva em vermelho da nucleoproteína viral no citoplasma de células do epitélio bronquiolar, 200X. (C): bronquiolite necrotizante com descamação do epitélio bronquiolar devido à necrose e infiltração linfocitária na lamina própria, 100X. (D): mesma área de C, corada pela imuno-histoquímica, com intensa marcação no epitélio de revestimento bronquiolar remanescente, 100X. (E): Intenso infiltrado inflamatório neutrofílico no lúmen alveolar, associado ao espessamento de septo interlobular devido ao edema e discreto infiltrado linfocitário, 40X. (F): Intensa marcação positiva em vermelho para nucleoproteína viral em glândulas (setas) e epitélio bronquiais, 40X. 44

47 45