AÇÃO ANTIFÚNGICA DE UM JATO DE PLASMA NÃO-TERMICO DE HÉLIO/AR COMPRIMIDO SOBRE BIOFILMES DE CANDIDA ALBICANS

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1 AÇÃO ANTIFÚNGICA DE UM JATO DE PLASMA NÃO-TERMICO DE HÉLIO/AR COMPRIMIDO SOBRE BIOFILMES DE CANDIDA ALBICANS Figueira, F.R. 1, Torello, G.R. 1, Oliveira, A.L.S. 1, Lima, J.S.B. 1,2, Figueira, J.A.N. 3, Maciel, H.S. 1,2,4, Pessoa, R.S. 1,2,4, Doria, A.C.O.C. 1, Khouri, S. 1,5 1 Universidade do Vale do Paraíba/IP&D/Laboratório de Biotecnologia e Plasmas Elétricos, Av. Shishima Hifumi, , São José dos Campos, SP, Brasil. Fone: , ferfig510@gmail.com,soniak@univap.br 2 Universidade do Vale do Paraíba/IP&D/Laboratório de Nanotecnologia e Processos a Plasma, Av. Shishima Hifumi, , Brasil. Fone: Instituto Tecnológico de Aeronáutica/Divisão de Engenharia Mecânica, Praça Marechal Eduardo Gomes, n 50, , Brasil. 4 Instituto Tecnológico de Aeronáutica/Departamento de Física, Praça Marechal Eduardo Gomes, , Brasil. Fone: Universidade do Vale do Paraíba, Núcleo de Estudos Farmacêuticos e Biomédicos da Faculdade de Ciências da Saúde, Av. Shishima Hifumi, 2911, São José dos Campos, SP, Fone: Resumo - Os biofilmes fúngicos são uma predominante causa de infecções crônicas associadas à utilização de cateteres e próteses, conferindo resistência aos antibióticos e fatores imunológicos do hospedeiro, sendo as leveduras, do gênero Candida spp, as mais frequentemente isoladas. O plasma não-térmico, operado à pressão atmosférica, vem ganhando destaque como uma nova estratégia antimicrobiana, inclusive para erradicação de biofilmes. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia da inativação de biofilmes de Candida albicans ATCC sobre substrato de poliuretano, utilizando jatos de plasma atmosférico de 6L/min de hélio e 4L/min de ar comprimido, alternando entre sistema contínuo e pulsado, com frequência de 60Hz e distâncias de 10 a 30mm entre o bocal e substrato. Após tratamento, realizou-se a contagem das unidades formadoras de colônia e a análise morfológica da superfície do biofilme por Microscopia Eletrônica de Varredura. O melhor grupo foi o plasma de modo pulsado com distância de 30mm com redução de 92% das unidades formadoras de colônia, demonstrando ser uma tecnologia promissora para o controle de biofilmes de C. albicans. Palavras-chave: Candida albicans, biofilme, plasma atmosférico, modo contínuo, modo pulsado. Área do Conhecimento: Biomedicina Introdução Leveduras do gênero Candida apresentam alta frequência de colonização e infecção oportunista em seres humanos. Podem ser encontradas no tubo gastrointestinal, trato vaginal, cavidade oral e na pele de adultos saudáveis. Estes micro-organismos comensais tornam-se patogênicos quando ocorrem alterações nos mecanismos de defesa do hospedeiro, ou no comprometimento das barreiras anatômicas, seja por queimaduras ou por procedimentos médicos invasivos, como, por exemplo, o uso de cateteres (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003; GULATI; NOBILE, 2016). As infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) representam graves problemas de saúde pública, a utilização de dispositivos médicos e implantes cirúrgicos são considerados um dos principais fatores de risco por serem fontes de infecção microbiana(silva, H. R.; REGINI, J. R. R.; NEGRI, 2013). A C. albicans é a espécie mais frequentemente isolada de infecções superficiais e invasivas em diferentes sítios anatômicos. Trata-se de levedura com potencial patogênico conhecido, apresentando como principais fatores de virulência: capacidade de aderência a diferentes mucosas e epitélios, dimorfismo com produção de estruturas filamentosas que auxiliam a invasão tissular, termo tolerância significativa e produção de enzimas como proteinases e fosfolipases (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). Dentre os fatores de virulência deste fungo, destacam-se a sua versatilidade de adaptação e a sua capacidade de adesão a diversos sítios, principalmente a formação de comunidades microbianas aderidas a diversas superfícies, conhecidas como biofilmes (SANTANA et al., 2013). Estes biofilmes 1

2 consistem da associação de micro-organismos aderidos a uma superfície por meio de uma matriz extracelular de polímeros, sendo assim mais resistentes aos antibióticos e aos fatores imunológicos, quando comparados às células planctônicas. Os biofilmes fúngicos constituem uma predominante causa de infecções crônicas, associadas à utilização de dispositivos médicos de longo período de uso, tais como cateteres (vasculares e urinários) e próteses (ortopédicas, cardíacas, vasculares) (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003). Estes dispositivos propiciam combinar um meio líquido altamente nutriente com a presença em potencial de micro-organismos, além da superfície porosa dos polímeros. A infecção relacionada ao cateter ocorre devido à formação do biofilme. Essas infecções são caracterizadas pela cronicidade, por causa de sua resistência ao tratamento antimicrobiano, tornando o diagnóstico microbiológico mais difícil (SILVA, H. R.; REGINI, J. R. R.; NEGRI, 2013). O plasma é definido como um gás ionizado com igual número de partículas carregadas positiva e negativamente. (SHINTANI et al., 2010). Os plasmas podem ser classificados de acordo com as condições de trabalho: quando os níveis de energia dos elétrons e das espécies reativas são próximos, o plasma resultante é chamado de plasma térmico, altamente ionizado e geralmente realizado à alta pressão (P 1 atmosfera). Em sistemas de baixa pressão, a energia média dos elétrons é muito maior do que das espécies reativas e o plasma resultante é chamado "plasma à frio" ou não- térmico (MOREAU et al., 2005). Os plasmas atmosféricos vêm demonstrando grande potencial em múltiplas aplicações nas áreas biomédicas, como também na área odontológica: indução de apoptose em células cancerígenas, esterilização de feridas e instrumentos cirúrgicos. Porém, dentre estas, a de maior interesse consiste na inativação microbiana, tanto na forma de biofilmes, como na forma de células planctônicas de bactérias, fungos, vírus e esporos. Os plasmas, nessas aplicações, apresentam a característica de produzir espécies reativas, mantendo-se à temperatura ambiente, o que permite sua aplicação segura em células vivas e tecidos. Vários tipos de espécies ativas são relevantes para os efeitos antimicrobianos do plasma: os tipos de elétrons, íons, radicais e luz UV. Essas espécies podem diferir de acordo com o gás utilizado na formação do plasma e no método escolhido para gera-lo (ARJUNAN; SHARMA; PTASINSKA, 2015; SHINTANI et al., 2010). Este trabalho avalia a ação de um jato de plasma de hélio/ar comprimido, operado em pressão atmosférica, contra biofilmes Candida albicans cultivados in vitro, investigando sua ação antifúngica. Metodologia A metodologia é baseada no estudo de DORIA et al., 2015, utilizando a cepa padrão ATCC (American Type Culture Collection) de C.albicans (10231), da qual foi preparada uma suspensão fúngica, na concentração de 10 6 UFC/ml em caldo Sabouraud-Dextrose (DIFCO). Neste trabalho, placas de poliuretano (substrato), medindo de 2 mm de espessura e área de 1 cm 2, lavadas com detergente multienzimático, foram inseridas em frascos contendo 20 ml da suspensão fúngica previamente preparada e incubados a 37ºC por 48 horas, sob agitação constante de 110 rpm, em incubadora shaker modelo MA 420 (Marconi). Após as primeiras 24 horas de incubação, o meio de cultura foi substituído, para manutenção dos nutrientes. Ao termino do período de incubação, as amostras foram removidas dos tubos e transferidas para novos frascos contendo tampão fosfato (PBS ph 7,2 ± 0,1). A Tabela 1 demonstra a divisão dos 5 grupos amostrais, assim como as condições de tratamento respectivas. Tabela 1 Divisão dos grupos amostrais e condições de tratamento das amostras Grupo Fluxo de Gás Modo Distância do Bocal (mm) Tempo 2 6L/min de He + 4L/min de ar comprimido Contínuo min 3 6L/min de He + 4L/min de ar comprimido Pulsado min 4 6L/min de He + 4L/min de ar comprimido Contínuo min 5 6L/min de He + 4L/min de ar comprimido Pulsado min 2

3 Neste estudo, foi utilizado um reator tipo plasma de arco deslizante. Os gases utilizados foram: Ar comprimido seco [gerado por compressor médico-odontológico modelo MSV6-30 (Schulz)] e hélio (pureza de 99,5%). Um porta-amostra foi colocado abaixo do reator, a uma distância de 10mm, para alguns dos experimentos, e de 30mm para os demais. Para a geração da descarga, foi utilizado um transformador de alta tensão (7.5 kv) de 500 W de potência. Para limitar a corrente e proteger o transformador, foi colocada uma resistência de 1 kω entre o transformador e a fonte de plasma. Os tratamentos foram realizados na região de pós-descarga do plasma elétrico. A aplicação dos plasmas hélio/ ar comprimido foi realizada logo após a lavagem das amostras com PBS. As tomadas de temperatura foram feitas por um termômetro infravermelho ScanTemp, modelo ST-600 (Incoterm) para monitorar a temperatura das amostras durante e após o tratamento. Um sistema eletrônico foi utilizado junto ao plasma, para controlar pulsos no mesmo com uma frequência de 60 Hz. O intuito era diminuir a temperatura de aquecimento do biofilme e do substrato de poliuretano, causada pela ação das espécies reativas advindas do jato de plasma. Após a aplicação do plasma, as amostras de poliuretano foram colocadas em novos tubos, contendo 10 ml de PBS, e realizou-se o desprendimento do biofilme por meio de um agitador de tubo tipo vórtex. Um volume de 0,1 ml desta suspensão foi semeado em ágar Sabouraud-Dextrose, pela técnica de espalhamento, e incubado a 37ºC por 48 horas, para a determinação das unidades formadoras de colônia (UFC/ml). Os resultados são expressos como percentagem de redução do número de colônias após o tratamento em relação ao número de colônias do controle, que foi considerado 100%. A análise estatística realizada utilizou o método ANOVA (Análise de Variância) com auxílio do software R de análises estatísticas versão (R Foundation for Statistical Computing). Para análise qualitativa, as amostras foram metalizadas com banho de ouro numa metalizadora modelo K550X (Emitech) e utilizou-se o Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV), modelo EVO MA 10 (Zeiss), para a análise da formação, distribuição e morfologia do biofilme. Resultados Os resultados obtidos estão sumarizados na Tabela 2. Os parâmetros de comparação são a contagem de UFC/ml, o percentual de redução obtidos para cada grupo e o nível de significância (α) das ANOVAS, com o objetivo de evitar erros estatísticos tipo I (rejeitar a hipótese nula quando esta é verdadeira). Tabela 2 Contagem de UFC/mL. Percentual de Redução Médio por Grupo, Temperaturas de tratamento e o nível de significância dos plasmas (α) Grupo UFC/mL % de Redução Médio T C Durante o tratamento T C Ao final do tratamento α 0 6,16x ,49x ,04% e ,17x ,32% e ,53x ,97% e ,52x ,11% e -10 Foi realizado um estudo comparativo entre o grupo controle (Grupo 0) e os grupos tratados com cada tipo de plasma. O grupo controle e cada grupo tratado estão representados pelo respectivo box plot, que apresentam a distribuição dos resultados da amostragem, incluindo os extremos mínimo e máximo. Os retângulos representam o intervalo compreendido entre 25% e 75% da amostragem (final do primeiro quartil e início do quarto quartil) de cada população tratada. O final do segundo quartil (50% da amostragem) é representado pela barra preta dentro do retângulo. O eixo Y corresponde à porcentagem. O grupo controle apresenta os eixos máximo considerado 100% e o mínimo aproximadamente 11% para uma melhor visualização da porcentagem de redução alcançada por cada tratamento (Figura 1). Os grupos 2, 3, 4 e 5 obtiveram um espalhamento menor em relação ao grupo controle. No grupo 2, observa-se que seu eixo máximo ficou muito próximo do primeiro quartil do controle, o que 3

4 corresponde a aproximadamente 20%. Comparando-se o gráfico com a porcentagem de redução alcançada pelo grupo, aproximadamente 88% de redução, percebe-se que a ação redutiva do plasma foi significativa. O mesmo é observado nos grupos 3, 4 e 5, sendo que este último alcançou a redução maior, de 92%. Figura 1 Gráficos Box plot do grupo controle e dos grupos tratados O: Controle T2: Contínuo, 10mm T3: Pulsado, 10mm T4: Contínuo, 30mm T5: Pulsado, 30mm As imagens obtidas por Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV), modelo EVO MA 10 (Zeiss), são apresentadas na Figura 2 com aumento de 1500x. Figura 2 Imagens de MEV dos biofilmes após tratamento com os plasmas Discussão As infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) estão entre as principais causas de morbidade e mortalidade, causando um aumento no tempo de internação, além dos altos custos 4

5 associados ao tratamento de pacientes graves (GUDLAUGSSON et al., 2003; HOTA, 2004). Inúmeros fatores estão relacionados ao desenvolvimentos das IRAS, porém constatou-se que medidas invasivas, como a caterização, são fatores de alta relevância, devido à complexidade envolvida, que vai desde contaminação microbiana de superfícies e infusões, até a formação de biofilme e desencadeamento da infecção. A colonização e a formação do biofilme podem ocorrer dentro de três dias de caterização, assim, além da contaminação da infusão, a superfície do cateter também é fonte de infecção (SILVA, H. R.; REGINI, J. R. R.; NEGRI, 2013). A pele e o hub (canhão do cateter) são as fontes mais comuns de colonização. Para cateteres de curta permanência, a pele no local de inserção é a principal fonte de colonização, da qual os micro-organismos migram ao longo da superfície externa do cateter, levando à colonização da ponta do cateter intravascular, que produz a infecção sanguínea. Desta forma, os cateteres intravasculares apresentam um risco substancial de desenvolver infecção sanguínea e causam um aumento considerável de morbidade e mortalidade em pacientes de Unidade de Terapia Intensiva (UTI) (STORTI, 2006). No intuito de minimizar, ou até mesmo, erradicar biofilmes microbianos em dispositivos médicos, muitos estudos têm sido voltados à esta área. Neste sentido, a tecnologia dos plasmas atmosféricos vem ganhando destaque. O mecanismo exato de inativação ainda não é bem elucidado. Acredita-se que a efetividade dos plasmas é devida a produtos oriundos do próprio plasma, como as espécies reativas de oxigênio (ERO), e as espécies reativas de nitrogênio (ERN). Estas desempenham papel importante em processos fisiológicos vitais. Em baixas doses, ERO e ERN atuam na promoção da sobrevivência, proliferação e migração celular. Já a concentração excessiva de ERO ocasiona estresse oxidativo, relacionado com o envelhecimento celular e com a iniciação e execução da apoptose (ARJUNAN; SHARMA; PTASINSKA, 2015; KONG et al., 2009). No trabalho de DORIA et al., 2015, investigou-se o efeito da região de pós-descarga, onde as amostras não estavam em contato com a pluma de plasma, em um jato de plasma não-térmico, sobre biofimes de Candida albicans. Foram utilizados os gases argônio e ar comprimido com os grupos:10l/min de argônio e 6L/min de argônio + 4L/min de ar comprimido, ambos a uma distância de 30mm, operando em modo contínuo, com 10 min de tratamento. Na contagem de unidades formadoras de colônia (UFC), foram alcançadas porcentagens de redução 85 e 88%, respectivamente. As duas composições de plasma obtiveram uma eficácia de 80% no controle das colônias cultivadas sobre poliuretano, porém o melhor resultado foi obtido com o grupo 6L/min de argônio + 4L/min de ar comprimido. Acredita-se que esse efeito foi devido ao aumento das ERO e ERN por consequência da mistura do ar comprimido ao gás de argônio. No presente trabalho, os grupos de uma maneira geral, obtiveram uma média de redução de, no mínimo, 84% das UFCs, confirmando o resultado positivo quanto ao uso do mesmo fluxo dos gases na geração dos plasmas. Contudo, nos testes de mudanças nos parâmetros, houve alterações nas contagens das UFCs. No grupo 5, por exemplo, utilizou-se o modo pulsado e com isso alcançou-se um resultado de 92% de redução. JONKERS et al. (2003) realizou um estudo no qual compara as diferenças de ionização entre os plasmas de hélio e argônio, operados a pressão atmosférica. Ele observou que, no plasma de hélio, os elétrons apresentam uma maior temperatura quando alcançam o primeiro estado de excitação, mas tem uma baixa densidade, diferenciando-se do plasma de argônio, que apresenta uma equidade operacional quando operado sob as mesmas condições externas. Tal fato se deve à maior capacidade de excitação e à menor massa do gás hélio. As diferenças de níveis de energia, entre o estado fundamental e o estado excitado, é maior no plasma de hélio do que no de argônio. Essa característica pode explicar os diferentes resultados alcançados com o uso do plasma de hélio no presente estudo. Na analise qualitativa, executada através do MEV, comprovou-se a presença do biofilme sobre os subtratos, assim como sua morfologia: além das leveduras, visualiza-se também a formação das hifas. Na análise estatística, o nível de significância (α) das ANOVAS dos grupos tratados no presente trabalho ficou bem abaixo do limiar de 5%, que é o nível de significância normalmente adotado. Isto é desejável e indica que os plasmas são estatisticamente relevantes na capacidade de efetuar a redução, ou inativação do biofilme estudado. Graficamente, os patamares superiores dos grupos 2, 3, 4 e 5 foram relativamente baixos, assim como seus respectivos espalhamentos, confirmando o resultado favorável, o que é uma evidência estatística da ação de esterilização dos plasmas. 5

6 Conclusão Os plasmas de hélio e ar comprimido e suas composições aqui estudadas, apresentaram uma satisfatória atividade antifúngica contra os biofilmes de Candida albicans. Em relação às UFC/mL, os grupos analisados apresentaram percentuais de redução distintos O percentual médio de redução, entre todos os grupos, foi de 84%, mas o de maior eficácia foi o grupo 5, que alcançou uma redução de 92%, demonstrando ser esta uma tecnologia limpa e bastante promissora para o controle de biofilmes de C. albicans. Referências ARJUNAN, K. P.; SHARMA, V. K.; PTASINSKA, S. Effects of atmospheric pressure plasmas on isolated and cellular DNA a review. International Journal of Molecular Sciences, v. 16, n. 2, p , COLOMBO, A. L.; GUIMARÃES, T. Epidemiology of hematogenous infections due to Candida spp. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 36, n. 5, p , DORIA, A. C. O. C. et al. Application of post-discharge region of atmospheric pressure argon and air plasma jet in the contamination control of candida albicans biofilms. Revista Brasileira de Engenharia Biomedica, v. 31, n. 4, p , GUDLAUGSSON, O. et al. Attributable mortality of nosocomial candidemia, revisited. Clinical Infectious Diseases, v. 37, n. 9, p , GULATI, M.; NOBILE, C. J. Candida albicans biofilms: Development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection, n. January, HOTA, B. Contamination, Disinfection, and Cross-Colonization : Are Hospital Surfaces Reservoirs for Nosocomial Infection? Clinical Infectious Diseases, v. 39, n. table 1, p , JONKERS, J. et al. On the differences between ionizing helium and argon plasmas at atmospheric pressure. Plasma Sources Science and Technology, v. 12, n. 1, p , KONG, M. G. et al. Plasma medicine: An introductory review. New Journal of Physics, v. 11, n. NOVEMBER, MOREAU, M. et al. Lethal effect of the gliding arc discharges on Erwinia spp. Journal of Applied Microbiology, v. 98, n. 5, p , SANTANA, D. P. et al. Novas abordagens sobre os fatores de virulência de Candida albicans. Revista De Ciências Médicas E Biológicas, v. 12, n. 2, p , SHINTANI, H. et al. Gas plasma sterilization of microorganisms and mechanisms of action. Experimental and Therapeutic Medicine, v. 1, n. 5, p , SILVA, H. R.; REGINI, J. R. R.; NEGRI, M. Biofilme : Ameaça Invísivel Em Ambientes Cirúrgicos Biofilm : Threat Environments in Surgical. Brazilian Journal of Surgery and Clinical Research - BJSCR, v. 4, p , STORTI, A. Colonização De Cateteres Venosos Centrais Por Biofilme Microbiano f. Tese (Doutorado). Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós-graduação em Análises Clínicas