Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós Graduação em Engenharia Biomédica THAISA BAESSO SANTOS

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1 Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós Graduação em Engenharia Biomédica THAISA BAESSO SANTOS MODIFICAÇÃO DE SUPERFÍCIES VIA TECNOLOGIA DE PLASMA VISANDO PREVENÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA Surfaces modification by plasma technology aiming formation prevention yeast biofilm of candida species São José dos Campos - SP 2015

2 Thaisa Baesso Santos MODIFICAÇÃO DE SUPERFÍCIES VIA TECNOLOGIA DE PLASMA VISANDO PREVENÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica Orientador: Profª Drª Lúcia Vieira São José dos Campos, SP 2015

3 Ficha Catalográfica

4 Folha de Aprovação

5 Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus, por tudo que me tem concedido, por guiar meus passos e auxiliar minhas escolhas. Á minha mãe, pelo amor, carinho e afeto. Ao meu pai, por tudo que me deu e me ensinou, pela generosidade, simplicidade e amor incondicional. Terei sempre uma eterna gratidão. Ao meu marido, pelo companheirismo, amor e pelo exemplo de persistência, determinação e competência. Á minha orientadora Profª Drª Lúcia Vieira, pela paciência, incentivo e por dedicar seu tempo a me transmitir um pouco do seu conhecimento. Á Profª Drª Sônia Khouri por me incentivar a iniciar o mestrado e pelo apoio durante a execução deste trabalho. Á amiga Anelise C. O. C. Dória, não só pela amizade, mas por todo o auxílio durante os anos de graduação e mestrado e por estar sempre pronta para compartilhar seu conhecimento. Aos colegas e professores do laboratório de Nanotecnologia e Processos a Plasma, Profº Drº Homero Maciel, Profº Drº Rodrigo Pessoa, Drº Fabiano Pinto Pereira, Drª Pollyana Alves, Giorgio Testoni, Augusto Lopes, Jhonatan Brandão e Fernanda Lucas, por estarem sempre dispostos a me ajudar no que fosse preciso. financeiro. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES, pelo apoio Á Universidade do Vale do Paraíba, pela infraestrutura oferecida. Ao INPE e ao CNPEM pela liberação no uso de equipamentos. Á todos aqueles que colaboraram para a elaboração deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.

6 Resumo A aderência de micro-organismos em superfícies sólidas é um fenômeno de ocorrência natural. Muitas espécies microbianas vivem e crescem sob as condições em que se encontram ligadas a superfícies naturais, frequentemente se incorporando à sua própria matriz de polímero orgânico, o biofilme. A aderência de bactérias e determinados fungos e a subsequente formação de biofilmes sobre superfícies sintéticas, tais como superfícies de equipamentos hospitalares de longo uso, como cateteres e implantes, é bem conhecida e tem efeitos indesejáveis podendo ocasionar processos infecciosos. Geralmente, a formação de biofilme protege os micro-organismos nele embutidos contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e a antibióticos, e pode levar à sua persistência indesejável e sobrevivência em equipamentos hospitalares. Nas últimas duas décadas, a prevenção da formação de biofilmes tem sido objeto de diversas investigações que visam prevenir os efeitos indesejáveis do mesmo, como por exemplo, incrustações e degradação de polímeros industriais para aplicação em equipamentos hospitalares. Dentre as possibilidades de prevenção, tem-se a modificação da superfície visando o efeito anti-adesivo e consequentemente menos sujeito à contaminação e a formação de biofilmes, bem como a ação fungicida. Neste trabalho de mestrado, foram realizados estudos relativos ao revestimento fungicida de superfícies de materiais de uso hospitalar. Um método versátil para modificação de superfícies é o tratamento por plasma elétrico em baixa pressão com aplicação de um filme a base de carbono do tipo amorfo (do inglês Diamond-like carbon - DLC). Foi investigado o efeito do revestimento de carbono contendo um agente fungicida aplicado a substratos de poliuretano, usados na fabricação de cateteres. O revestimento desses materiais foi realizado via reator de plasma (PECVD - plasma-enhanced chemical vapor deposition) usando precursores de hexano com inserção de uma substância fungicida, a cânfora. Subsequente as deposições, os filmes foram investigados quanto suas propriedades, químicas, morfológicas e adesivas pelas técnicas de Espectroscopia Raman, Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), e Microscopia de Força Atômica (AFM) no Modo de Contato Intermitente. Por fim, foram realizados testes de crescimento e desenvolvimento de biofilmes de leveduras do gênero Candida cultivados in vitro. Foi utilizado o método quantitativo para determinação de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/ml) e um método qualitativo utilizando a técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Os principais resultados observados foram que os substratos que continham revestimento de DLC com e sem cânfora tiveram um percentual de redução das UFC s bastante elevados, 99% e 91% respectivamente. O que nos leva a crer que o revestimento de materiais utilizados em dispositivos hospitalares invasivos com filmes finos de DLC dopados com alguma substância antifúngica pode se tornar uma alternativa válida para a diminuição de infecções hospitalares. Palavras-chave: Cateter. Biofilme. Candida. Plasma elétrico. Revestimento. DLC.

7 Abstract Microorganisms adherences in solid surfaces is a naturally occurring phenomenon. Many microbial species lives and grow under the conditions in which they are linked to natural surfaces, often incorporating to its own array of organic polymer, the biofilm. Bacteria adhesion of any certain fungi and the subsequent formation of biofilms on synthetic surfaces, such as medical equipment surfaces of long use, such as catheters and implants, is well known and has undesirable effects and may cause infectious processes. Generally, the formation of biofilm protects microorganisms embedded in it against mechanisms of defense of the host and the antibiotics, and can lead the microorganisms persistence and survival undesirable in hospital equipment. In the past two decades, the prevention of biofilm formation has been the subject of several investigations aimed at preventing the undesirable effects of the same, as for example, fouling and degradation of industrial polymers for use in hospital equipment. Among the possibilities for prevention, there is a surface modification to the non -adhesive effect and consequently less subject to contamination and biofilm formation, as well as the fungicide action. In this work, master's studies were carried out concerning the fungicide coating of materials surfaces for use in hospitals. A versatile method for surfaces modification is the treatment by electric plasma in low pressure with application of a carbon-based film of amorphous type Diamond-like carbon-dlc. Was investigated the effect of carbon coating containing a fungicide agent applied to polyurethane substrates, used in the manufacture of catheters. The coating was prepared via plasma reactor -plasma-enhanced chemical vapour deposition (PECVD) using hexane precursors with insertion of a fungicide substance, camphor. Subsequent depositions, the films were investigated as their chemical, morphological properties, and adhesives by Raman Spectroscopy, scanning electron microscopy techniques (MEV), and Atomic force microscopy (AFM) in Intermittent Contact mode. Finally, tests were conducted of biofilm growth and development of yeasts of the genus Candida in vitro grown. It will be used. Quantitative method was used for determination of colony-forming units of Colonies (UFC/ml) and a qualitative method using the technique of scanning electron microscopy (SEM).The main results were observed at substrates that contain DLC coating with and without camphor with a percentage of reduction of UFC were quite high 99 %and 91% respectively. Which leads us to believe the coating materials used in invasive medical devices with DLC thin films doped with some antifungal substance can become a valid alternative for reducing hospital-acquired infections. Keywords: catheter. Biofilm.Candida.Electric plasma.dlc Coating.

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Reação de formação de um poliuretano Figura 2 - Esquema da estrutura química da cânfora. C10H16O Figura 3 - Segmentos de poliuretano Figura 4 - Substrato revestido de DLC em ágar Saboraund difundido para teste de esterilidade Figura 5 - Esquema do preparo do teste de halo de inibição Figura 6 - Reator de plasma atmosférico, modelo NPE-4000 PECVD Figura 7 - Dispositivo acoplado ao reator de plasma para inserção da cânfora Figura 8 - Dispositivo acoplado ao reator de plasma para inserção da cânfora Figura 9 - Incubadora shaker (Marconi) Figura 10 - Agitador tipo vórtex Figura 11 - Sistema automatizado de contagem de colônias Figura 12 - Metalizadora modelo K550X (Emitech) Figura 13 - Microscópio Eletrônico de Varredura pelo MEV - EVO MA Figura 14 - Micro Raman de Espectrometria (Renishaw 2000) Figura 15 - Microscópio de Força Atômica (Park NX10) Figura 16 Resultados de espectroscopia Raman com espectros sobrepostos do filme de DLC, DLC com canfora e Poliuretano Figura 17 - Resultados de Espectroscopia Raman de Canfora, DLC puro e Poliuretano com e sem leveduras Figura 18 - Micrografias do substrato de poliuretano puro Figura 19 - Micrografias do poliuretano com biofilme de C. albicans Figura Micrografias do substrato revestido com DLC Figura 21 - Substrato de poliuretano revestido de DLC com leveduras de C. albicans analisado por MEV em amplitude de Figura 22 - Substrato polimérico revestido com DLC com cânfora Figura 23 - Substrato polimérico revestido com DLC com cânfora e contaminado com levedura de C. albicans Figura 24 - Placas utilizadas na contagem de UFC s de substratos de poliuretano puro Figura 25 - Placas utilizadas na contagem de UFC s de substratos revestidos com DLC Figura 26- Placas utilizadas na contagem de UFC s de substratos revestidos com DLC e cânfora... 45

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Parâmetros de deposição de DLC no reator de plasma atmosférico Tabela 2 Percentual de redução da contagem de UFC/mL... 45

10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVO GERAL Objetivos específicos REVISÃO DA LITERATURA EPIDEMIOLOGIA DAS CANDIDEMIAS CATETER VENOSO CENTRAL POLIURETANO BIOFILME PLASMAS ELÉTRICOS DIAMOND-LIKE CARBON CÂNFORA TÉCNICAS DE CARACTERIZAÇÃO Microscopia Eletrônica de Varredura Espectrometria Raman Microscopia de Força Atômica no Modo Contato Intermitente METODOLOGIA PREPARAÇÃO DOS SUBSTRATOS Teste de esterilidade Teste de halo de inibição PROCESSO DE DEPOSIÇÃO DOS RECOBRIMENTOS FUNGICIDAS FORMAÇÃO DO BIOFILME ANÁLISE QUANTITATIVA CARACTERIZAÇÃO DOS SUBSTRATOS POLIMÉRICOS Microscopia Eletrônica de Varredura Espectroscopia Raman Microscopia de Força Atômica RESULTADOS E DISCUSSÃO ESPECTROSCOPIA RAMAN MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA E ESPECTROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA ANÁLISE QUANTITATIVA DO BIOFILME CONCLUSÃO... 46

11 5.1 TRABALHOS FUTUROS REFERÊNCIAS... 50

12 12 1 INTRODUÇÃO Taxonomicamente são descritas cerca de 200 espécies de Candida pertencentes ao Reino Fungi, sendo que 10% destas leveduras são reconhecidas como agentes etiológicos em infecções humanas. 1 Candida albicans pode aderir à superfície de dispositivos médicos, como o cateter, formando biofilmes, o que facilita a infecção da corrente sanguínea pelos mesmos. Estima-se que pelo menos metade dos pacientes admitidos em hospitais receba terapias intravenosas. 2 Uma vez que os procedimentos médicos invasivos aumentaram, com eles, houve também, uma incidência maior de infecção relacionada ao uso do cateter, 3, 4, 5 sendo esta uma das causas mais frequentes de morbidade e mortalidade nos hospitais. Devido a esse fato, os plasmas elétricos vem sendo estudados para utilização na higienização das mãos de profissionais da saúde, esterilização de determinados materiais, feridas crônicas de pacientes, tratamentos odontológicos e pacientes queimados (para regeneração celular), com a grande vantagem de reduzir a carga microbiana. O plasma, quando gerado em um reator de deposição química a vapor com atmosfera e parâmetros controlados, pode depositar DLC (Diamond-like carbon) em determinados substratos e ter aplicações na área biomédica, pois esse material apresenta baixo atrito, inércia química, compatibilidade biológica, suavidade e resistência ao desgaste. Pode-se agregar ainda a todas essas vantagens, uma substância fungicida, para diminuir a infecção relacionada a materiais médico-hospitalares. 1.1 OBJETIVO GERAL O objetivo deste trabalho foi o estudo relativo à modificação da superfície de polímeros do tipo poliuretano utilizado na fabricação de cateteres com o intuito de inibir o crescimento de biofilme fúngico Objetivos específicos a) Verificar a capacidade do revestimento de DLC de impedir a adesão fúngica no substrato polimérico;

13 13 sem canfora; b) Investigar a morfologia dos filmes finos de carbono amorfo depositados com e c) Avaliar a capacidade fungicida da cânfora (Cinnamomun camphora) em biofilmes formados por leveduras do gênero Candida.

14 14 2 REVISÃO DA LITERATURA De acordo com o ministério da Saúde do Brasil, infecção hospitalar é toda aquela adquirida após admissão do paciente no hospital e que se manifesta durante a internação ou após a alta. Geralmente aparecem de 48 a 72 horas de internação e podem ser localizadas ou sistêmicas. 6 As infecções hospitalares e a resistência aos antifúngicos são problemas crescentes na saúde pública. 7 Nas últimas décadas teve-se um grande aumento, levando ao óbito cerca de 60% dos pacientes 8,9 sobretudo em alguns grupos especiais, como neonatos e transplantados. 5 Os fatores são inúmeros e estão relacionados com a antibioticoterapia prévia, nutrição parenteral, ventilação mecânica, prematuridade, imunossupressão, uso de corticóides, neutropenia, quimioterapia, hospitalização prévia, uso de cateter venoso central e outros dispositivos invasivos. 10 Essas infecções apresentam alto custo hospitalar, pois aumentam o tempo de internação do paciente, além de causarem elevada mortalidade. 11 Cerca de 80% das infecções hospitalares causadas por fungos são originadas por espécies do gênero Candida. Estima-se que em torno de 25% a 38% dos pacientes que desenvolvem candidemia chegam ao óbito. 8 Em um estudo realizado em 2012, 12 observouse um aumento de 207% de infecções da corrente sanguínea causadas por fungos e Candida nos Estados Unidos, entre 1979 e Agravando este quadro epidemiológico, o uso incorreto de antibióticos de amplo espectro de ação tem levado ao surgimento de cepas de micro-organismos resistentes aos agentes quimioterápicos. 13 As características terapêuticas e epidemiológicas apresentadas pelas diferentes espécies de Candida revelam a necessidade de identificar as leveduras ao nível de espécie e avaliar a susceptibilidade a antifúngicos. Permitindo assim, melhor abordagem terapêutica ao paciente EPIDEMIOLOGIA DAS CANDIDEMIAS Leveduras do gênero Candida spp são micro-organismos eucariotos sem pigmentação fotossintetizantes, com parede celular composta basicamente por quitina e membrana plasmática fosfolipídica com vários esteróis, sendo o ergosterol o mais

15 15 predominante. 1 São fungos que microscopicamente apresentam-se como blastoconídeos, pseudo-hifas e/ou hifas verdadeiras; macroscopicamente, são colônias de coloração branca a creme, aspecto liso com ou sem brilho. 14 Seu crescimento é favorecido em temperaturas variando entre 20ºc a 38ºC e ph ácido, com a faixa ideal entre 2,5 até 7,5. 1 Possuem adesinas, biomoléculas que promovem a aderência do fungo às células do hospedeiro ou às células ligantes. 6 São comensais ao homem, habitam normalmente o aparelho digestivo, respiratório, mucosa vaginal, oral e tegumento cutâneo, podendo ser oportunistas em certas ocasiões 14 isto é, dependendo da idade e da imunidade do indivíduo, podem levar a severas infecções. Os fatores que precedem a infecção e a doença são alterações nas células de defesa, na fisiologia ou na microbiota normal do indivíduo. 15 A candidemia é a maior causa de infecção da corrente sanguínea em pacientes hospitalizados, representando importante problema de saúde pública mundial. 16 Pisos, alimentos, fômites, ar e outras superfícies podem ser reservatórios de Candida spp em hospitais e o modo de transmissão pode ser através do cateter, próteses e infecções cruzadas. 7,8 A Candida albicans era a espécie de maior interesse clínico, porém, evidenciou- se nos últimos anos um aumento de infecções da corrente sanguínea por espécies não- albicans (como por exemplo: C. Parapsilosis, C. Tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilhermondii e C. lusitaniae), a razão para esse fato pode estar relacionada com o potencial de virulência (ou patogenicidade) destes micro-organismos, que é um conjunto da capacidade da levedura de aderir, infectar e causar doença e ainda, sua resistência a antifúngicos. 8, 10 Em estudo realizado em 2012, com 91 isolados clínicos de Candida spp provenientes de pacientes internados em um hospital, obteve-se 38 de C. albicans (41,8%), 23 de C. tropicalis (25,3%), 16 de C. glabrata (17,6%), 10 de C. parapsilosis (10,9%) e quatro de C. krusei (4,4%). 10 Entretanto, uma pesquisa feita em 2014 revelou que apesar da epidemiologia da Candida albicans ser muito estudada nos Estados Unidos e na Europa, o mesmo não é feito na América Latina, sendo que no Brasil as taxas de incidência são fragmentadas ao considerar os dados de todas as regiões do país. 11 O aumento significativo das infecções nosocomiais oportunistas e terapia

16 16 antifúngica limitada resultam na necessidade de antifúngicos mais eficientes e menos tóxicos CATETER VENOSO CENTRAL Cateteres venosos centrais são dispositivos que facilitam o tratamento e o diagnóstico, sendo utilizados principalmente em Unidades de Terapia Intensiva (UTI) e em pacientes sob quimioterapia para administração de medicamentos, hemoderivados e soluções de nutrição parenteral, para monitorar a condição hemodinâmica, e facilitar o acesso 4, 5, 11, 12, 16 vascular para hemodiálise. Podem ser classificados em: de curta permanência (utilizados em UTI, mono ou duplo lúmen, cateter para hemodiálise, etc) e de longa permanência (utilizados em terapia endovenosa prolongada). 16 Os de longa permanência são classificados em semi- implantáveis (indicado a crianças muito pequenas ou para indivíduos com necessidade diária de punção) ou totalmente implantáveis (geralmente inseridos na região infraclavicular). 17 Cerca de 15 milhões de CVC são utilizados por ano nos Estados Unidos em UTI s, sendo que aproximadamente 80 mil deles são infectados, aumentando o custo em saúde. 5 Aproximadamente 65% das infecções resultam da migração de micro- organismos que compõem microbiota da pele, a partir do sítio de inserção do cateter. Os fatores de risco relacionados à infecção por cateteres estão associados à duração do cateterismo, o local de inserção, o material do qual é constituído, a presença de múltiplos lumens, a repetição do cateterismo, a manipulação frequente, o tipo de curativo usado, os micro-organismos envolvidos na colonização do cateter, a doença de base, a gravidade do estado clínico do 5, 18 paciente, e a condição imunológica do mesmo. 2.3 POLIURETANO O poliuretano possui sigla comercial PU e é representado quimicamente por uma cadeia de unidades orgânicas unidas por ligações de uretano, a fórmula estrutural do monômero está representada na figura 2.

17 17 Pode ter uma variedade de densidades e de durezas, que mudam de acordo com o tipo de monômero usado na sua produção e de acordo com a adição ou não de aditivos. Os aditivos também podem melhorar a resistência à combustão e a estabilidade química, entre outras propriedades. O PU é um material versátil e utilizado em revestimentos, adesivos, elastômeros termoplásticos, compósitos e como matéria prima de vários componentes, como por exemplo: cateteres, colchões, preservativos, sapatos. 19 Alguns cateteres de iserção periférica são fabricados a partir de resinas aromáticas da família dos poliuretanos, por serem um material biocompatível e radiopaco (que facilita perfeita visualização aos raios-x). Esses materiais apresentam a mesma flexibilidade do silicone, com a vantagem de terem a parede mais fina, porém, com mais resistente. As paredes mais finas permitem que seu diâmetro interno seja maior, se comparado aos cateteres de silicone, esse diâmetro reduzido, evita flebites, tromboses e melhora o conforto do paciente. 20 Figura 1 - Reação de formação de um poliuretano Fonte: Caetano BIOFILME Biofilme (ou slime) é um conjunto de micro-organismos que convivem em associação 21 e é o responsável pela infecção relacionada ao cateter 22, 8 sua produção é considerada um fator de virulência e permite que o micro-organismo tenha maior adesão as superfícies, reduzindo a resposta imune aos fagócitos e interferindo nos mecanismos de defesa do hospedeiro. 23 A maioria dos micro-organismos, envolvidos na colonização do cateter, não são virulentos na forma planctônica, mas podem causar infecção persistente, quando estão agrupados. Estudos com Microscópio Eletrônico de Transmissão e

18 18 Varredura mostraram que praticamente todos os cateteres venosos centrais inseridos são colonizados por micro-organismos incrustados em uma matriz de biofilme. 22,16 Os micro-organismos têm acesso ao cateter venoso central pela via extraluminal, ao migrarem através da pele ou por contaminação na manipulação do dispositivo. 5 A colonização de um cateter pode ocorrer em 24h em função do filme condicionante produzido pelo hospedeiro (plaquetas, plasma e proteínas tissulares). 22 Os eventos no processo de formação de biofilme são a adesão microbiana e o processo de maturação do mesmo. Após a aproximação da levedura com o substrato, inúmeros acontecimentos físico-químicos tornam possível a adesão inicial do microorganismo a esta superfície. Em um biofilme maduro coexistem muitas microcolônias, constituídas por distintas espécies de leveduras, que são envolvidas por uma matriz extracelular na qual ocorre a passagem de água e nutrientes. 16 A adesão e formação de biofilme sobre os dispositivos médicos é um grande problema na medicina. Todas as variantes morfológicas conhecidas (leveduras, pseudohifas e hifas) crescem em biofilme e geralmente expressam propriedades diferentes das suas respectivas células planctônicas PLASMAS ELÉTRICOS Plasmas elétricos comumente são descritos como o quarto estado da matéria, mas, essa definição não é muito adequada, pois, a passagem de um gás para a forma de plasma não ocorre através de uma transição de fase bem definida. 25 O termo plasma, que oriunda do grego, foi descrito pelo físico americano, Irving Langmuir em 1928, quando estudava descargas elétricas em gases. Plasmas são gases parcialmente ionizados, portanto, consistem de íons, elétrons e espécies neutras. Um gás se torna um plasma quando a adição de calor ou outra forma de energia faz com que um número significante de seus átomos libere alguns ou todos os seus elétrons. Estes átomos que perdem elétrons ficam "ionizados", ou seja, com uma carga positiva resultante, e os elétrons separados de seus átomos ficam livres para se mover pelo gás, interagindo com outros átomos e elétrons. 25

19 LTE. 25 Isso é devido a poucas ou muitas colisões, dependendo da pressão do gás; que 19 Os plasmas podem diferir em muitos aspectos, e são classificados conforme os mesmos, como por exemplo: temperatura, densidade de elétrons e íons, comprimento de Debye, etc. Outro parâmetro importante na descrição de um plasma é a presença de campos elétricos e/ou magnéticos. A maioria dos plasmas estudados é do tipo gás ionizado produzidos por descargas elétricas em gases a baixa pressão. Os plasmas são categorizados como naturais ou de laboratório, e cobrem uma grande faixa de temperatura e pressão. Como exemplos de plasmas naturais citam-se corona solar, nebulosas, vento solar, aurora boreal, descarga elétrica atmosférica, centro do Sol, ionosfera terrestre. 25 Os principais plasmas laboratoriais são os de alta temperatura (ou fusão) e os de baixa temperatura (ou descarga de gás). 23 Podem ser divididos em plasmas de equilíbrio térmico (onde a temperatura de todas as espécies é a mesma) LTE ou aqueles que não estão em equilíbrio térmico (onde as temperaturas das espécies não são as mesmas, pois as temperaturas do s elétrons são muito mais elevadas do que as partículas restantes) não- quando alta gera muitas colisões, além do comprimento de descarga ou a distância entre os eletrodos. Descargas LTE são caracterizadas por temperatura bastante elevadas e utilizadas para aplicações onde é necessário calor (por exemplo, corte, pulverização e soldadura); plasmas não-lte são usados para situações em que o calor não é necessário (por exemplo, erosão e deposição de camadas finas). 25 Os plasmas elétricos vêm sendo estudados para utilização em tratamentos odontológicos, medicina esportiva, pacientes queimados (para regeneração celular), higienização das mãos de profissionais da saúde, esterilização de determinados materiais e de feridas crônicas de pacientes, com a grande vantagem de reduzir a carga microbiana. 2.6 DIAMOND-LIKE CARBON O carbono por existir em três diferentes hibridizações, sp 3, sp 2 e sp, forma uma grande quantidade de estruturas, tanto cristalinas quanto amorfas, além disso, é um material abundante, o que torna-o, um material estratégico para estudos e aplicações tecnológicas. Assim, a pesquisa e o desenvolvimento de materiais a base de carbono com

20 20 propriedades avançadas é necessária para o avanço das indústrias aeroespaciais, biomédicas, microeletrônicas, entre outras. 23 O DLC é uma forma metaestável de carbono amorfo que contém uma parte significativa de ligações sp 3 e sp 2. Pertence a uma nova classe de material, cujas propriedades físicas e químicas são próximas às do diamante, tais como, dureza e módulos de elasticidade relativamente elevados, trazendo as vantagens de ser mais facilmente obtido e poder ser depositado em grandes áreas. Podem conter uma quantidade de hidrogênio em sua estrutura, que variam de quantidades menor que 1% (classificado como a-c) até aproximadamente 50% (classificado como a-c:h), logo suas propriedades variam de acordo com suas estruturas e composições. 22 Por conta dessas variações na composição e na estrutura, este material reúne propriedades químicas e físicas atraentes, tais como: elevada dureza mecânica, baixo coeficiente de atrito, elevada resistência ao desgaste, estabilidade química, transparência óptica (R). Devido a essas diversas propriedades, esses filmes vêm sendo utilizados em discos rígidos magnéticos, peças de motores de automóveis e aviões, revestimentos protetores em janelas ópticas e em lentes, dispositivos microeletrônicos, próteses e implantes médicos e odontológicos, como revestimento tribológico em satélites, entre outras. Obtendo-se alta qualidade e aderência desse material em substratos, podem-se ampliar ainda mais suas aplicações. 23 Existem muitas formas de se depositar DLC em um sbstrato, mas a mais comum é através do processo CVD (chemical vapor deposition), onde utiliza-se um reator constituído por dois eletrodos de área diferentes que com a adição de um gás gera um plasma. A mobilidade dos elétrons no plasma cria uma bainha ao lado dos eletrodos com excesso de íons. Esse espaço tem uma carga positiva, de modo que o plasma desenvolva uma tensão positiva no que diz respeito aos eletrodos, que equaliza os elétrons e íons. Para a deposição de DLC o plasma deve ser operado em pressão mais baixa possível, pois a espessura da camada diminui com o aumento da pressão. 23

21 CÂNFORA A cânfora é um material orgânico composto por três grupos metílicos associados em uma estrutura em forma de anel. 24 A figura 1 mostra a estrutura química dessa substância. Figura 2 - Esquema da estrutura química da cânfora. C10H16O Fonte: Ciência 37 É extraída da canfoeira Cinnamomun camphora, originárias da China, de Taiwan e do Japão. Fisicamente, são cristais brancos ou incolores, em massas cristalinas ou grânulos, com odor característico penetrante e pungente, que se volatiliza lentamente à temperatura ambiente. É praticamente solúvel em água; muito solúvel em álcool, em clorofórmio e em éter; facilmente solúvel em dissulfeto de carbono, hexano e em óleos fixos e voláteis. Sua faixa de fusão varia de 174 C a 179 C 25. A cânfora é utilizada em grandes quantidades como plastificante da nitrocelulose na indústria de celulose, na forma de álcool canforado, compressas ou injeções na área de medicina e também como desinfetante e repelentes contra traças e insetos 25. Em estudo realizado em 1979, pesquisadores estudaram a atividade antifúgica dessa substância. Foram colocadas diferentes quantidades de cristais de cânfora em placas contaminadas com Fusarium oxysporium, Macrophomina phaseolina, Phytophthora cinnamomi, Pythium aphanidermatum, Rosellinia necatrix, Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani (uma espécie em cada placa), com ágar PDA. Eles observaram que a maioria dos fungos deixou de crescer quando foram expostos a concentração de 40 mg. 26

22 TÉCNICAS DE CARACTERIZAÇÃO Microscopia Eletrônica de Varredura O microscópio eletrônico de varredura é capaz de reproduzir imagens de alta resolução da superfície de uma amostra, de maneira tridimensional. Utiliza-se um feixe de elétrons de pequeno diâmetro que explora a superfície da amostra, ponto a ponto, através de linhas sucessivas que transmitem o sinal do detector a uma tela catódica, cuja varredura está em perfeita sintonia com a do feixe incidente. Através de um sistema de bobinas de deflexão, o feixe pode ser guiado para varrer a superfície da amostra conforme uma malha retangular. O sinal captado pelo detector é usado para modular o brilho do monitor, permitindo a observação Espectrometria Raman O efeito Raman foi descoberto em 1928 pelos Doutores Chandrasekhara Venkata Raman e K. S. Krishnan e está relacionado às propriedades vibracionais dos materiais através da interação com uma fonte de luz. 27 É uma técnica fotônica, amplamente utilizada na caracterização de diferentes tipos de materiais (orgânicos e inorgânicos), não necessita de preparo especial das amostras a serem analisadas, na maioria dos casos não é destrutiva e leva poucos minutos para ser realizado, o que lhe confere grande vantagem Microscopia de Força Atômica no Modo Contato Intermitente A microscopia de Força Atômica vem sendo utilizada para obter informações sobre superfícies poliméricas com resolução nanométrica. Esta técnica se baseia em uma sonda de silício que oscila em sua frequência natural de ressonância, sobre a superfície de uma amostra, tocando-a periodicamente. Durante uma varredura, as variações na interação sondaamostra resultam em mudanças na frequência, amplitude e fase da vibração da sonda. A imagem formada revelará vários tipos de heterogeneidades na capacidade de dissipação de energia mecânica da superfície polimérica. Os principais fatores de dissipação da energia da

23 23 sonda e consequente alteração de fase são as propriedades viscoelásticas, adesivas e topográficas da região que está sendo examinada. 29

24 24 3 METODOLOGIA A metodologia apresentada foi dividida nos seguintes passos: preparação dos substratos, processo de deposição do filme fino de DLC, caracterização do filme e avaliação microbiológica. 3.1 PREPARAÇÃO DOS SUBSTRATOS Utilizou-se segmentos de poliuretano de 2 cm 2, com cerca de 2 mm de espessura, da empresa 3R Plásticos que foram limpos em detergente multienzimático (da marca 3M) e lavados com água destilada estéril antes do tratamento a plasma. A figura 3 mostra uma fotografia dos substratos de poliuretano onde pode-se observar o aspecto transparente e leitoso característico dos substratos de poliuretano usados nesse trabalho, antes de qualquer tratamento. Figura 3 - Segmentos de poliuretano Fonte: Autor Teste de esterilidade Para comprovar que somente esse processo de descontaminação seria eficaz, foi realizado um teste de esterilidade onde após a limpeza do substrato com o detergente

25 25 multienzimático, o mesmo foi posicionado em uma placa estéril contendo ágar Saboraund Dextrose e incubado a 37ºC durante 48h, a fim de observar se haveria ou não crescimento de micro-organismos. O mesmo foi realizado com o substrato após o revestimento com DLC com e sem cânfora. A figura 4 mostra uma fotografia da placa de petri com ágar Saboraund difundido, contendo o substrato revestido de DLC para teste de esterilidade. Figura 4 - Substrato revestido de DLC em ágar Saboraund difundido para teste de esterilidade Fonte: Autor Teste de halo de inibição Com o intuito de confirmar o efeito fungicida da cânfora, foi realizado um teste de halo de inibição, onde foram feitas suspensões fúngicas com ATCC (American Type Culture Collection) de C.albicans (10231) na ordem de 0,5 da escala de Mac Farland, ou seja, cerca de 1,5 x 10 8 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. Semeou-se100 µ l dessa suspensão em ágar Saboraund Dextrose (DIFCO) através da técnica de Spread-Plate (semeadura por espalhamento), em seguida, pesou-se um tablete (2,870g) de cânfora refinada sintética (Farm. Bras.) que foi colocado no centro da placa e incubado em estufa por 48 horas a 37ºC. A figura 5 mostra duas fotografias contendo o aparato experimental

26 26 usado para o teste de halo de inibição: (a) suspensão fúngica feita com a ATCC de C. albicans em tubos de ensaio e (b) tabletes de cânfora já nas placas inoculadas. O mesmo teste foi realizado também com o substrato de poliuretano revestido com DLC com e sem cânfora. Todos os testes foram realizados em triplicata. Figura 5 - Esquema do preparo do teste de halo de inibição Nota: a) Cândida albicans ATCC 10231; b) Segmentos de cânfora em ágar Saboraund inoculado Fonte: Autor 3.2 PROCESSO DE DEPOSIÇÃO DOS RECOBRIMENTOS FUNGICIDAS. Foi utilizado o reator PECVD, equipamento profissional (modelo NPE-4000, empresa Nanomaster Inc.) com fonte DC pulsada, que está alocado no Laboratório Nanotecnologia e Processos a Plasma do Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba São José dos Campos. O procedimento de deposição do filme de DLC foi realizado em duas etapas: primeiramente o processo de limpeza utilizando argônio seguido do processo de deposição propriamente dito. A Tabela 1 ilustra todos os

27 27 parâmetros utilizados para o revestimento. Primeiramente realizou-se uma limpeza física e química no reator, a fim de garantir a boa qualidade do filme fino. Essa limpeza ocorre através de um processo de lixamento físico com lixa de granulometria 600, para remoção de possíveis filmes aderidos à sua superfície, aspira-se qualquer resíduo presente e utiliza-se álcool isopropílico. Tabela 1 Parâmetros de deposição de DLC no reator de plasma atmosférico Fonte: Autor

28 28 A cânfora foi escolhida por ser popularmente conhecida como agente fungicida e ser solúvel em precursores de carbono como, por exemplo, o hexano. A evaporação da mistura hexano e cânfora ocorreram em um dispositivo de vidro acoplado ao reator de plasma. Após ser ionizada, com controle de potência do plasma para preservar as propriedades da cânfora, essa mistura formou um filme de carbono que se depositou no substrato polimérico. As figuras 6 e 7 mostram fotografias do reator e do aparato dispersor de cânfora acoplado na lateral do reator. Figura 6 - Reator de plasma atmosférico, modelo NPE-4000 PECVD Fonte: Autor Figura 7 - Dispositivo acoplado ao reator de plasma para inserção da cânfora Fonte: Autor

29 29 O hexano é um precursor de carbono e um meio de carrear a substância fungicida para dentro do reator durante o processo de formação do filme. No interior do reator de plasma parte destas moléculas foram ionizadas e parte foi reordenada na forma cíclica. Na figura 8, mostra-se um desenho esquemático do reator de plasma atmosférico. Com marcações em vermelho realçando as regiões de: sistemas de vácuo, fontes de potência, eletrodos, câmara de processos e região de injeção de gases. Figura 8 - Dispositivo acoplado ao reator de plasma para inserção da cânfora Fonte: Grill 33

30 FORMAÇÃO DO BIOFILME A metodologia empregada consistiu na preparação de suspensões fúngicas, decepas padrão dec.albicans, da ordem 0,5 da escala de Mac Farland em caldo Sabouraud. Essas cepas foram cedidas pelo Núcleo de Estudos Farmacêuticos e Biomédicos (NUFABI) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) e processadas e mantidas no Laboratório de Biotecnologia e Plasmas Elétricos do Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento (IP&D) da UNIVAP. Os substratos foram introduzidos em Erlenmeyers (um corpo de prova em cada) logo após o processo de deposição, com 15 ml das suspensões e incubados a 37ºC por 48 horas, sob agitação constante de 110 rpm em incubadora shaker modelo MA 420 (Marconi). A figura 9 mostra uma fotografia da a incubadora shaker utilizada.onde mostra os frascos de erlenmeyers em cultivo. Figura 9 - Incubadora shaker (Marconi) Fonte: Autor

31 31 Posteriormente, foram removidas e transferidos para tubos contendo tampão fosfato (PBS ph 7,2 ± 0,1) e homogeneizadas em vórtex durante um minuto. A figura 10 mostra o equipamento agitador tipo vórtex utilizado. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Figura 10 - Agitador tipo vórtex Fonte: Autor 3.4 ANÁLISE QUANTITATIVA Para a análise quantitativa, cerca de 100µl da suspensão fúngica preparada anteriormente, foi semeada em placas de Petri estéreis, já contendo cerca de 20 ml de ágar Sabouraud solidificado, pela técnica de Spread-Plate. Incubou-as a 37º C por 48 horas e em seguida colocou-se as placas em um contador automático de colônias para a determinação das unidades formadoras de colônia (UFC/ml). A figura 11 mostra uma fotografia do contador automático utilizado para essa técnica.

32 32 Figura 11 - Sistema automatizado de contagem de colônias Fonte: Autor 3.5 CARACTERIZAÇÃO DOS SUBSTRATOS POLIMÉRICOS Os substratos poliméricos modificados foram investigados quanto suas propriedades morfológicas, químicas e adesivas pelas técnicas de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Espectroscopia Raman e Microscopia de Força Atômica (AFM) Microscopia Eletrônica de Varredura Para a análise qualitativa, os substratos foram transferidos para um recipiente estéril e colocados em estufa por aproximadamente 3 horas para a secagem, então, foram remanejados assepticamente com o auxílio de uma pinça, para um porta-amostra ( stub ), que possui um carbono coloidal para a condutividade dos elétrons e posterior preparação de metalização da superfície com banho de ouro na metalizadora modelo K550X (Emitech). Logo após, foi realizada a análise por Microscopia Eletrônica de Varredura pelo MEV - EVO MA 10, que se localiza no Laboratório de Microscopia Eletrônica de Varredura do IP&D da UNIVAP. A figura 12 mostra uma fotografia da metalizadora usada na preparação de amostra para o MEV e a figura 13 mostra uma fotografia do microscópico eletrônico de varredura.

33 33 Figura 12 - Metalizadora modelo K550X (Emitech) Fonte: Autor Figura 13 - Microscópio Eletrônico de Varredura pelo MEV - EVO MA 10 Fonte: Laboratório Espectroscopia Raman A estrutura química dos filmes de DLC foi estudada através do sistema micro Raman de Espectrometria, equipamento Renishaw 2000 com laser iônico de Ar + (λ = 514,5 nm) e geometria de retroespalhamento, esse sistema está alocado no Laboratório de

34 34 Sensores e Materiais (LAS) do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais INPE, em São José dos Campos. A figura 15 mostra uma fotografia do sistema micro Raman de Espectrometria utilizado nas caracterizações de estrutura quimica. Figura 14 - Micro Raman de Espectrometria (Renishaw 2000) Fonte: Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais. Laboratório associado de sensores e materiais Microscopia de Força Atômica A Microscopia de Força Atômica foi realizada com o equipamento Park NX10 que está alocado no Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano), localizado no CNPEM Centro Nacional de Pesquisa em Energias e Materiais. O AFM Park NX10 possui uma largura de digitalização de µ m e altura em z de até 15 µ m. A resolução de z é 0,006 nm devido a eletrônica moderna de 24 bits. Além de imagens de topografia, o equipamento possui uma grande variedade de técnicas SPM que podem ser realizadas, cabe mencionar entre elas: microscopia de força magnética(mfm), microscopia de força elétrica (EFM) e microscopia por sonda de força Kelvin (KPFMKFM). O equipamento opera também no estado líquido e pode-se aquecer amostras. O microscópio em si é montado dentro de uma caixa de acrílico, permitindo uma atmosfera controlada, especialmente a umidade pode ser variada de 0,1 a 80 saturação relativo da água. Na figura 16 observa-se microscópio de Força Atômica utilizado.

35 35 Figura 15 - Microscópio de Força Atômica (Park NX10) Fonte: LNNano 36

36 36 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO A deposição de DLC pode ser feita via várias técnicas, mas entre elas uma se destaca: processo CVD (deposição química a vapor) assistido por plasma em sistema de vácuo. Neste processo é possível realizar a deposição de um filme fino de DLC que reveste todo o material, de forma tridimensional e em baixa temperatura foram: Após a realização da metodologia detalhada no item anterior, os resultados obtidos: 4.1 ESPECTROSCOPIA RAMAN A espectroscopia Raman foi utilizada para analisar o efeito da cânfora na estrutura química do filme de DLC. A figura 16 mostra um gráfico contendo 4 espectros Raman sobrepostos para comparação de bandas: linha azul: espectro característico dos filmes de DLC; linha verde: composto pela mistura de DLC e cânfora sobre poliuretano; linha preta: cânfora; linha vermelha: poliuretano puro. Pode ser observado neste gráfico, nas regiões marcadas pela faixa em azul e em amarelo, que o espectro em linha verde apresenta um alargamento de banda quando comparado com o espectro em linha azul. Esse alargamento de banda é devido a sobreposição de bandas contribuintes da cânfora e do poliuretano. O alargamento de banda em espectros pela contribuição de outras substâncias é conhecido na literatura. 30 Nos filmes de DLC para a banda D posicionada em 1350cm -1 e ocorre devido ao aumento da desordem das ligações sp2 + sp3. Para a banda G centrada em 1580cm -1 o alargamento indica o aumento da amorfização da fase grafítica.

37 37 Figura 16 Resultados de espectroscopia Raman com espectros sobrepostos do filme de DLC, DLC com canfora e Poliuretano. Fonte: Autor A Figura 17 mostra um conjunto de três espectros das substâncias puras: DLC; cânfora e poliuretano. Mostra também mais três espectros da contaminação dessas substâncias com leveduras de C. albicans. Os espectros estão com as deconvoluções típicas para cada substância pura estão apresentados. Pode-se observar que o espectro de DLC apresenta as bandas D e G características nas posições de 1350cm -1 e 1580cm -1 para as bandas D e G respectivamente. O filme de DLC com cânfora mostrado na figura 16 linha verde apresentou alargamento de bandas. A presença de leveduras apresentou alargamento de banda nos espectros de poliuretano indicando que a levedura apresenta componentes característicos que podem interferir no deslocamento Raman quando comparado com os

38 38 espectros de poliuretano puro. Nesse aspecto, mais estudos via espectroscopia Raman e via técnicas com FTIR pode ser feito para especificação do tipo de ligação oriunda de leveduras. Figura 17 - Resultados de Espectroscopia Raman de Canfora, DLC puro e Poliuretano com e sem leveduras Fonte: Autor

39 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA E ESPECTROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA A figura 18 (a) mostra uma fotomicrografia obtida por Microscopia Eletrônica de Varredura, do substrato de poliuretano puro. Nota-se que o substrato está totalmente limpo e sem qualquer contaminação. A figura 18 (b) mostra a mesma amostra observada via Microscopia de Força Atômica com análise de rugosidade. Na imagem de AFM foi calculado a rugosidade do poliuretano com valor de Ra (rugosidade aritmética) de 50,0 nm e (Rms) rugosidade média de 58,6nm. Figura 18 - Micrografias do substrato de poliuretano puro Nota: (a) Fotomicrografia eletrônica de varredura do poliuretano com ampliação de 1500x; (b) Imagem obtida via microscopia de força atômica (AFM) do mesmo substrato de poliuretano Fonte: Autor

40 40 A figura 19 (a) mostra uma fotomicrografia obtida por MEV do poliuretanocom o biofilme com ampliação de 1500x. Pode-se notar a presença de hifas de Candida albicans cultivadas no período de 48h em que o substrato ficou imerso em suspensão fúngica. A imagem 19 (b) mostra uma imagem de AFM com detalhamento das hifas. Pode ser observado que as hifas apresentam contraste de material em toda sua extensão. Figura 19 - Micrografias do poliuretano com biofilme de C. albicans Nota: (a) Imagem do poliuretano com biofilme fúngico obtido por MEV; (b) Imagem do poliuretano com biofilme realizada por AFM Fonte: Autor

41 40 A figura 20 mostra uma fotomicrofotografia do substrato de poliuretano com revestimento de DLC e canfora, em (a) obtida através de Microscopia Eletrônica de Varredura e em (b) obtida via Microscopia de Força Atômica. Nota-se que o substrato é mais rugoso devido ao revestimento de DLC quando comparado com a figura 18 que mostra a superfície do poliuretano puro. O poliuretano com DLC apresenta um valor de rugosidade superior a dez vezes o valor da rugosidade do poliuretano puro. O Poliuretano com DLC tem rugosidade aritmética de 650,0 nm e rugosidade média de 800,0 nm. Figura 20 - Micrografias do substrato revestido com DLC Nota: (a) Imagem da superfície do poliuretano revestido com DLC observada em MEV (b) Mesma amostra vista em AFM Fonte: Autor Em um estudo semelhante realizado com DLC dopado com prata, revestindo PMMA (polimetilmetacrilato) e subsequentemente induzindo a formação de biofilme fúngico de C. albicans, Queiroz et al (2013) chegaram a conclusão de que a modificação química do substrato, bem como a hidrofobicidade e baixa energia de superfície reduzia a formação de biofilme e não a rugosidade da amostra. 32 A figura 21, mostra uma fotomicrografia obtida por MEV do substrato de poliuretano revestido de DLC com leveduras de C. albicans em amplitude de 1500X. Pode ser observado nessa imagem a contaminação com as leveduras de C. albicans e que o fundo também é rugoso e apresenta poucas leveduras, cujas hifas se misturam com o filme fino, ficando

42 41 presas às suas tramas. As leveduras apresentadas nessa imagem foram uma das colônias encontradas após o período de incubação de 48h. Observou-se que as hifas não preencheram a superfície do substrato de poliuretano contendo DLC, podendo-se afirmar que não houve proliferação da levedura no filme de DLC quando comparado a figura 19 (a), que contém apenas o substrato de poliuretano revestido com leveduras. Os focos fúngicos não foram localizados, nas análises de AFM. Figura 21 - Substrato de poliuretano revestido de DLC com leveduras de C. albicans analisado por MEV em amplitude de 1500 Fonte: Auto r

43 42 A figura 22 mostra uma fotomicrofotografia de uma região do substrato de poliuretano com revestimento de DLC com cânfora, obtida através de Microscopia Eletrônica de Varredura em amplitude de 1500x. Pode ser visto nessa imagem a canfora não modifica a morfologia do filme de DLC quando comparado com a figura 20 na mesma ampliação. Figura 22 - Substrato polimérico revestido com DLC com cânfora Fonte: Autor A figura 23 mostra uma fotomicrografia do substrato de poliuretano revestido com DLC com cânfora contendo pequena região com fúngico, realizada em MEV. Pode-se notar que os fundos das imagens são muito semelhantes aos dos substratos anteriores, ainda que esse revestimento possua também cânfora. Pode ser observada a presença de leveduras, porém é possível verificar que visualmente aparentam estar em menor número que as dos substratos anteriores e que as leveduras não preencheram a superfície do substrato de

44 43 poliuretano contendo DLC com cânfora, podendo-se afirmar que não houve proliferação da levedura no filme de DLC com canfora quando comparado a figura 19 (a), que contém apenas o substrato de poliuretano revestido com levedura de C. albicans. Os focos fúngicos não foram localizados, nas análises de AFM. Figura 23 - Substrato polimérico revestido com DLC com cânfora e contaminado com levedura de C. albicans Fonte Autor 4.3 ANÁLISE QUANTITATIVA DO BIOFILME A figura 24 mostra as placas semeadas com suspensões fúngicas retiradas de substratos de poliuretano puro. Pode-se observar uma baixa quantidade de Unidades Formadoras de Colônias, devido ao fato de terem sido realizadas diluições em séries 1:1000.

45 44 Figura 24 - Placas utilizadas na contagem de UFC s de substratos de poliuretano puro Fonte: Autor A figura 25 mostra as placas semeadas com suspensões fúngicas retiradas de substratos que continham DLC. Pode ser observado grande quantidade de UFC s, mas deve-se levar em consideração que foi realizada diluição seriada de 1:10 apenas. Figura 25 - Placas utilizadas na contagem de UFC s de substratos revestidos com DLC Fonte: Autor A figura 26 mostra as placas semeadas com suspensões fúngicas de substratos que continham poliuretano revestidos de DLC com cânfora. Observa-se a presença de algumas UFC s, porém em número muito reduzido, quando comparado as imagens anteriores, ainda que tenha sido realizada diluição seriada de 1:10.