Coordenação Geral de Investigação por Análise do DNA in vivo e post mortem da Defensoria Pública Geral do Estado do Rio de Janeiro.

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1 1 PERÍCIAS EM DNA: A COISA CERTA PODE SER FEITA DE FORMA ERRADA? UM ESTUDO DE CASO HIPOTÉTICO. Mary Christina Pitta Pinheiro de Souza Melgaço 1, André Luís dos Santos Figueiredo 2, 3, Eduardo Ribeiro Paradela 2, 3 1 Coordenação Geral de Investigação por Análise do DNA in vivo e post mortem da Defensoria Pública Geral do Estado do Rio de Janeiro. 2 DNA Forense Peritos Associados e Análises Laboratoriais LTDA. 3 Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO) Laboratório de Vínculo Genético (VINGENE). Resumo A introdução das técnicas para identificação humana por análise de DNA nos tribunais de países como os Estados Unidos da América foi cercada de desconfiança por uma significativa parcela da comunidade científica e dos operadores do direito. Esta objeção se deveu, em parte, a inexistência de regras definidas e padronizada s para os laboratórios envolvidos nestes exames. Embora tal período de crítica tenha contribuído para o estabelecimento de rígidos critérios para os serviços prestados, falhas ainda podem ocorrer. Neste artigo, é apresenta do um caso criminal hipotético em que se aplicou a genética forense como ferramenta investigativa. O objetivo é demonstr ar algumas possibilidades de erro já descritas na literatura especializada. 1. Introdução Na área criminal, um dos propósitos da identificação humana por DNA (genotipagem) é testar uma hipótese de que determina da pessoa é a fonte doadora de uma evidência biológica. Dentre os possíveis resultados desta investigação constam a exclusão - as amostras biológicas possue m origens diferentes; o laudo com resultados inconclusos - não é possível deter minar, com base nos resultados dos testes, se as amostras provêm ou não do mesmo doador; a inclusão (ou não exclusão) - as genotipagens são similares e originara m - se da mesma fonte. Esta última conclusão de similaridade genética meramen te descreve o fato de que não foram detectadas diferenças entre duas amostras através dos testes realizados (INMAN e RUDIM, 1997). As genotipagens de regiões STR através da técnica da PCR (reação em cadeia da polimerase) podem apresentar similaridades em três circunstâ ncias: 1- As amostras possue m a mesma fonte: a evidência biológica (mancha de sangue, saliva, esper ma etc) se origina da mesma pessoa que cedeu a amostra utilizada como referência; 2- A similaridade é coincidência: o doador da amostra referência e o verdadeiro doador do material biológico possue m alelos coincidentes em relação aos marcadores examinados; 1

2 2 3- A similaridade é acidental: isto decorre de erros durante os processos de coleta e/ou análise das amostras. Em casos de abuso sexual e em cenas de múltiplos assassinatos, por exemplo, é comum a análise de amostras contendo mistura de DNA de duas ou mais pessoas. Há situações em que os profissionais responsáveis não levam em consideração tais aspectos, fazend o pairar dúvidas a cerca de seus resultad os (PARADELA et al., 200). Em relação às investigações criminais, cada rastro biológico encontrado na cena de um crime ou no corpo da vítima pode represen tar um vestígio ou uma prova funda men tal para elucidar questões. Portanto, deve haver um cuidado absoluto no levanta ment o dos vestígios de material orgânico, quando todo e qualquer material passa a ter relevância. Sabese que a exposição do DNA a fatores como luz solar, microorganis mo s e compo nen tes químicos pode provocar a degradação da molécula. Logo, quanto melhor for a coleta e a preservação do material coletado, melhor será a análise do material genético extraído (PARADELA e FIGUEIREDO, 2007). Os erros mais comuns nas genotipagens envolvem troca ou contaminação de amostras e análise incorreta dos dados. Tal fato pode ser constatado a partir de algumas manchetes publicadas nos últimos cinco anos, tais como: DNA errors lead to murder case review (The Times on line, fevereiro de 2007); Forensic lab errors in hundreds of crime cases (The Guardian,fevereiro de 2007); POLICE FORENSICS: DNA mix- up prompt s audit at lab (Las Vegas Review- Journal, abril de 2002); Audit calls for changes in police DNA lab (Las Vegas Review- Journal, maio de 2002); Laboratório do PR é condenado por erro em exame de DNA (Folha de Londrina, julho de 200); More than 200 cases reopened after DNA error (The Independent, maio de 2007). Entretanto, se os exames forem corretamen te executados, as amostras estiverem em condições para análise (a degradação do DNA pode interferir nos resultados) e os cálculos forem apropriada me n te executados, a confiabilidade dos testes de DNA é absoluta. A seguir é apresenta do um caso hipotético de investigação de abuso sexual que exemplifica algumas das falhas descritas na literatura em análises desta nature z a. 2. O caso hipotético O caso: violência sexual contra mulher com vestígios de sêmen detectados no raspado vaginal coletado da vítima O laudo: o documen to em que a análise do material genético é apresenta d a informa a comparação de marcadores genéticos STR (regiões curtas repetidas in tanden) presentes nas seguintes amostras: EVIDÊNCIA BIOLOGICA - esfregaço vaginal coletado da vítima (V); AMOSTRAS REFERÊNCIA - amostras biológicas (sangue) cedidas pela vítima e pelo principal suspeito (S1). De acordo com o laudo, os alelos encontra dos foram visualizados com auxílio de 2

3 3 fluorescência e a razão de verossimilhança foi deter minada, não excluindo (S1) como doador das células esper máticas encontrada s na evidência biológica. Os resultados são parcialmente apresenta dos na Tabela 1. Tabela 1 Tipagens e avaliação dos resultados. locus V Evidência biológica F13B TPOX S Freqüência alélica 25,9 () 40,2 (10) 4 () 29(11) AVALIAÇÃO DOS DADOS DO LAUDO O estu d o dos picos de intensi da d e das bandas se faz necessário para deter mi n a r os componentes principal e secundário na mistu ra e eliminar a hipótese de o alelo encon t ra d o no esfregaço vaginal ser um STUTTER BAND (stutter band: tamb é m conhecido como banda fantas ma) relativo ao alelo 9 provenien te da vítima. Tais bandas são artefato s da reação em cadeia da polime ras e e pode m provocar equívocos de interpr e ta ção se certos cuidados não forem tomados. A análise dos picos de intensid a d e das bandas se faz necessária para deter mi n a r se o siste ma de amplificação usou como molde o material das células do acusa do e da vítima ou some n t e as desta última, visto que há coincidência alélica nas amos tra s de V e S1. Em casos de esfregaços vaginais conte n d o mistu ra de material biológico e send o o comp o n e n t e masculino predominante men te constit uíd o de células esper m á ticas é comu m a amplificação preferencial da principal contribuin te, ou seja, a vítima. 3

4 4 F13A0 1 vwa D13S ,2 () 25,4 (1) 23,4 (17) 27,1 (12) O alelo 13 prese n te na amos t ra de V não é verificado no prepa ra d o advind o do esfregaço vaginal. Isto pode decorrer do fenô me n o conhecido como AMPLIFICAÇÃO DIFERENCIAL, que é um artefato caracteriza d o pela diferença na eficácia de amplificação entre dois alelos (GILL et al, 1997; LYGO et al, 1994). Problema s no curso dos processo s de amplificação e detecção de alelos invalida m o uso deste locus, pois não se pode deter min a r com absoluta precisão se o material das células esper m á tica s foi amplificad o. Desta forma, a razão de verossi milha nça apresen ta d a no laudo deve ser recalculada. A deter min ação dos picos de intensida d e das bandas se faz necessária para determinar os componentes principal e secun dá rio na mist u ra e eliminar a hipóte se de o alelo 1 encon tra d o no esfregaço vaginal ser um STUTTER BAND relativo ao alelo 17 provenien te do DNA de V. A deter min ação dos picos de intensida d e das bandas se faz necessária para determinar os componentes principal e secun dá rio na mist u ra e eliminar a hipóte se de o alelo 12 encont ra d o no esfregaço vaginal ser um STUTTER BAND relativo ao alelo 13 provenie nte do DNA de V Análise do laudo técnico hipotético O uso de reações MULTIPLEX empregando corantes fluorescentes associado à detecção automatiza d a para determinação de alelos STR pela técnica da PCR fornece não só informação qualitativa dos alelos presentes na amostra (tipagem), mas também informação quantitativa referente às intensidades relativas das bandas. Como conseqüência, isto possibilita aferir a quantidade de DNA amplificado (CLAYTON et al, 199). Com freqüência, é possível separar as contribuições principal e secundária em misturas simples (BAN, 2000; CLAYTON et al, 199; EVETT et al, 199) e determinar a presença de STUTTER BANDS, bandas extras geradas pelo desliza mento da enzima TAQ POLIMERASE e que apresenta m uma unidade de repetição a menos que a verdadeira (GILL et al, 1997). Vale ressaltar que tal artefato de técnica é comum nas reações MULTIPLEX utilizadas neste caso. 4

5 5 No laudo técnico em questão não é mencionada a avaliação dos picos de intensidade ( PEAK AREAS ) das bandas referentes aos alelos identificados. Tal análise é importante para eliminar eventuais interpretações equivocadas dos resultados (BAN, 2000; CHANNELL, 2000; GUTIN et al, 1999; EVETT et al, 199; GILL et al, 199) e deter minar as freqüências estatísticas consideran d o - se somente os loci para os quais não há múltiplas possibilidades interpreta tivas. Todo o processo envolvido na análise de DNA é importante e a interpretação adequada dos resultados é essencial (MELENDEZ, 2001). As análises estatísticas são utilizadas para interpretar os resultados das genotipagens (SALDANHA, 2001). Quando o teste falha em excluir um acusado como possível contribuinte para uma evidência, deve- se calcular a representatividade estatística do emparelhame nt o (MELGAÇO, 199). Este cálculo depende da freqüência dos alelos encontra dos em determinado grupo populacional (MONSON e BUDOWLE, 199; ROEDER, 1994; WEIR, 199). A análise de misturas pode ser complexa uma vez que várias combinações de genótipos podem ser consideradas, de acordo com cada situação (CURRAN et al, 1999). Existem diferentes estratégias para tratament o estatístico de misturas (MAIA et al, 2001; SZAKACS, 2001). Embora o tipo de cálculo para deter minação da razão de verossimilhança utilizada neste caso seja reconhecida por alguns autores como uma maneira apropriada para interpretar evidências (AIKEN, 1995; EVETT e WEIR, 199), outros tratamen t o s estatísticos poderiam ser utilizado s para validar os resultados em situações que envolvem misturas de materiais biológicos (SZAKACS, 2001; CURRAN et al, 1999; WEIR et al, 199). Tais metodologias levam em consideração diferentes hipóteses para constr ução do perfil alélico em misturas como a encontra da no esfregaço vaginal da vítima. Considerações finais Em análises forenses de DNA, os resultados podem incluir ou excluir suspeitos como doadores de amostras encontradas em cenas de crime ou no corpo da vítima. O mesmo acontece quando o propósito do estudo é investigar a existência de vínculo genético, pode- se incluir ou excluir a possibilidade de ocorrência do parentesco analisado. As exclusões não requerem análise estatística desde que sejam absolutas, ou seja, haja diferenças entre as amostras que não justificadas por outra razão. As inclusões, por sua vez, devem ser analisadas estatisticamente, pois é preciso saber a freqüência em que o emparelhamento pode ocorrer. 3. Consideraçõe s gerais Para a aceitação de um trabalho pericial, dois componentes devem ser considerados: a acurácia (validade) e a consistência (reprodutibilidade) das análises. Em análises de DNA, o perito deve informar honesta m en te as limitações dos testes, quando estas existirem. Qualquer falha entre a coleta de amostras e a 5

6 divulgação dos resulta dos pode levar a conclusões equivocadas em exames de DNA. São recomendações básicas de quesitos para a elaboração do laudo pericial de análise de DNA: identificação do número do inquérito policial ou processo judicial; identificação das partes envolvidas e amostras; informação da etnia (raça) dos envolvidos, quand o possível e relevante; citação da metodologia empregada na coleta e armazena m en t o de materiais e, se necessário, esclarecimento dos cuidados empreendidos para manutenção da cadeia de custó dia destes materiais. Em adição, o laudo deve conter informações bibliográficas a cerca das metodologias utilizadas para a extração, quantificação e amplificação do DNA; forma de identificação dos alelos obtidos nos testes e funda me nt os empregados para os cálculos estatísticos (CHANNELL, 2000). As freqüências estatísticas utilizadas como base para os cálculos também devem ser mencionadas (US CONGRESS, 1990). 4. Conclusõe s O fato de duas amostras terem o mesmo perfil para um grupo de marcadores genéticos em especial não significa, obrigatoriamente, que elas possu a m a mesma origem. Quando a tipagem genética de duas amostras é igual, torna- se necessário expressar numericamente a significância deste evento. O número de marcadores empregados, a presença de subestr ut u r a s na população e a mistura de amostras podem interferir nos resultados. A expressão estatística dos resultados deve basear- se na presença ou não de misturas de material biológico, como é freqüentemente observado em casos de abuso sexual. Uma questão funda me nt al no uso do DNA como evidência é a validação científica dos métodos de análise. Em outras palavras, é preciso ter garantias científicas de que os testes podem inequivocamente identificar inclusões e exclusões para cada marcador genético utilizado. Inicialmente, a credibilidade dos testes deve partir da nature za das amostras biológicas utilizadas. Com freqüência, as amostras são encontra d as em superfícies não- estéreis, podend o sofrer danos após contato com a luz solar, microorganis mos e solventes. Existem procedimentos que podem minimizar a ação destes fatores de degradação do DNA. Entretanto, muitos cuidados devem ser tomados para evitar equívocos na interpretação. A amplificação pela PCR (reação em cadeia da polimerase) que é largamente empregada nas tipagens genéticas, pode produzir falhas e artefatos quand o a qualidade do material biológico está compro me tid a. Amostras parcialmente degrada das podem proporcionar, por exemplo, a amplificação preferencial de alelos e o surgimento das bandas fantasm as ( stutter bands ). No primeiro caso, tem- se a amplificação de um alelo em detrimento do outro. Isto pode gerar a falsa impressão de se tratar de um indivíduo homozigoto ao invés de heterozigoto para o locus em estudo. Já as bandas fantasm as decorrem de falhas no processo que geram bandas com uma unidade de repetição a menos que a do alelo original. Deste modo, pode- se interpretar equivocada men te o resultado como um falso heterozigoto ou identificar um alelo erronea men te.

7 7 Na atualidade, existem tecnologias, como os leitores por fluorescência capazes de dirimir dúvidas e evitar erros desta nature za. Contudo, estes equipamen tos são caros e poucos técnicos no Brasil estão capacitados a operálos. Outro fator importante é a reprodu tibilidade dos testes. Em Ciência, é preciso que os resultados sejam passíveis de reprodução para que sejam aceitos como verdade científica. No campo forense, não é incomu m a necessidade de repetição das tipagens. Isto pode encarecer o processo, mas não deve ser descartado, principalmente quando o que está sob suspeita é o teste em si. Para as análises de DNA, diversos quesitos podem ser postulados para a interpretação dos dados, incluindo- se neste ponto a escolha e o uso apropriad o das técnicas; as supracita das freqüências populacionais empregadas para os cálculos e o tipo de análise estatística empregada; os controles de qualidade adotado s; a documen tação dos procedimen to s; a qualidade dos equipamen to s e reagentes utilizados e a capacitação técnica dos profissionais envolvidos. Todas as etapas empreendidas para a tipagem do DNA, desde a coleta até a interpretação do significado estatístico dos dados obtidos, serão consubstanciadas em uma peça pericial escrita que servirá aos interesses de seus leitores. Em instância final, o laudo poderá ainda servir como elemen to de convicção para juizes, promotores e advogados nas ações penais. Cabe a advogados, juizes e a comunidade científica estar atentos ao fato de que os testes absoluta me n te não são infalíveis, como ocorre com qualquer outra atividade humana. Deve- se implementar no Brasil, confor me já ocorre em outros países, rigorosos padrões de qualidade para garantir a credibilidade de tão importante ferramenta. 4. Referências bibliográficas Ban JD. Interpreta tion of STR profiles- commu nity guidelines. Presentation in the 3 rd annual fluorescent STR megaplex technology workshop. SC, USA, Channell K. Writing a complicated STR report. Presentation in the 3 rd annual fluorescent STR megaplex technology workshop. SC, USA, Clayton TM, Whitaker JP, Sparkes R, Gill P. Analysis and interpretation of mixed forensic stains using DNA STR profile. Forensic Sci. Int. 91: Curran JM, Triggs CM, Buckleton J, Weir BS. Interpreting DNA mixtures in structure d populations. J. Forensic Sci.. 44 (5): Evett IW, Weir BS. Interpreting DNA Evidence: Statistical Genetics for Forensic Scientists. Sinauer Associates Ed, Sunderland, MA, US, 199. Gill P, Sparkes R, Kimpton C. Development of guidelines to desiguinate alleles using STR Multiplex systems. Forensic Sci. Int. 9:

8 Gutin S, Scholl T, Thomas A. Advancement in allele- calling accuracy and throughput. Proceedings of the 10 th International Symposium on Human Identification. FL, USA Inman K, Rudin N. An introduction to forensic DNA samples. CRC Press Lygo JE, Johnson P, Holdaway J, Woodroffe S, Whitaker JP, Clayton TM, Kimpton CP, Gill P: The validation of short tandem repeat (STR) loci for use in forensic casework. Int. J. Leg. Med. 107: Maia FAS, Paula KAA, Dalton GC. Análise de mistura de material genético em crimes sexuais envolvendo dois suspeitos. Anais do III simpósio latinoamericano de identificação humana. Curitiba, PR Melendez E. Razão de verossimilhança em casos complexos. Anais do III simpósio latino- americano de identificação humana. Curitiba, PR Melgaço, MCP. DNA e Paternidade: Falsa Exclusão. Revista de Direito da Defensoria. 12, 199. Monson KL, Budowle B. Effect of reference database on frequency estimates of polymerase chain reaction (PCR) Based DNA profiles. J. Forensic Sci. 43 (3): Paradela ER, Figueiredo ALS. Genética Forense - Coleta, Documentação e Transferência de Evidências Biológicas Destinadas a Testes Forenses de DNA. Trinolex, São Paulo, 11/01 / [Internet]. Disponível / w ww.trinolex.com / a r tigos_view.asp?icaso = a r tigos&id= Acesso em 02/05 /2007. Paradela ER, Figueiredo ALS, Smarra ALS. A identificação humana por DNA: aplicações e limites. In: Âmbito Jurídico, Rio Grande, 30, 30/0 / [Internet]. ISSN Disponível em / w w w.ambitojuridico.com.br / site /i n d ex.ph p n_link = revista_artigos_leitura&artigo_id = Acesso em 02/05 /2007. Roeder K. DNA fingerprint: a review of the controversy. Statstical Sci. 9(2): Saldanha G. Software para cálculos estatísticos de casos de investigação de vínculo genético. Anais do III simpósio latino- americano de identificação humana. Curitiba, PR Szakacs N. Perspective on DNA casework: unusu al exhibits mixture interpretatio n and profiles from inhibited PCR mixtures. Anais do III simpósio latino- americano

9 9 de identificação humana. Curitiba, PR US Congress, Office of Technology Assessment: Genetic witness: forensic uses of DNA tests. OTA- BA- 43. US Government Printing Office. Washington, DC Weir BS. Genetic Data Analysis II. Sinauer Associates Ed. Sunderland, MA, US, 199. Notas esclarecedoras: Marcadores STR ( short tande m repeats ) - seqüências que apresenta m repetições com unidade básica de 2-7 pares de base e o polimorfismo, assim como nos loci VNTR, também está baseado no número de repetições. Devido ao pequeno tamanho, geralmente menor que 350 pares de base, alelos STR podem ser analisados após amplificação pela técnica PCR. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - A PCR é um método in vitro que sintetiza seqüências específicas de DNA. Esta reação utiliza um DNA que é usado como "molde" (template em inglês) e primers, que são oligonucleotídeos (pequenas seqüências que complementa m o DNA), que hibridam com o molde de DNA para que a molécula seja copiada. A copia do molde é catalisada pela enzima Taq polimerase. Uma série de ciclos repetitivos faz com que o molde seja separado em suas hemi- hélices, os primers hibridem com o molde, a polimerase catalise a ligação de nucleotídeos para formar uma nova cópia da região de interesse do DNA. Como cada cópia produ zida em um ciclo pode servir de molde no próximo ciclo, a cópia do DNA ocorre de forma exponencial. Em aproxima da me n te 20 ciclos, a concentração de DNA aumenta aproximada me n te um milhão de vezes. 9