Influência da superfície do implante sobre ações dos macrófagos e maturação celular

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1 53 Influência da superfície do implante sobre ações dos macrófagos e maturação celular Influence of the implant surface over the actions of macrophages and cell maturation Halim Nagem Filho 1 Nasser Hussein Fares 2 Ricardo Fun Furuyama 3 Júlio Celso Nogueira 3 Reinaldo Missaka 4 Resumo O escopo deste artigo foi avaliar o efeito da superfície do implante de titânio a respeito do estado de maturação das células osteogênicas e o papel desempenhado nas respostas da ativação dos macrófagos. As superfícies dos implantes têm uma importância extrema, uma vez que é nessa zona onde ocorrem as reações biológicas que induzem a osseointegração. As células interagem com a superfície de um material por meio de uma camada adsorvida de proteínas, açúcares e lipídeos presentes no sangue e fluido de tecidos. Os macrófagos são fagócitos específicos que migram para locais das feridas, como componente de uma tarefa de remoção de tecido necrosado, restos de células, bactérias e outras partículas. A secreção de uma glicoproteína pelos macrófagos parece ser um tanto generalizada como característica da resposta inflamatória. Descritores: Implante dental, osseointegração, macrófagos, citocinas. Abstract In this study we assessed whether osteogenic cells respond in a differential manner to changes in surface roughness depending on their maturation state and its role in the activation of macrophage responses. The surfaces of the implants are of extreme importance, since that is the area where biological reactions that induce osseointegration occur. Cells interact with the surface of a material by a layer of adsorbed proteins, sugars and lipids in the blood and tissue fluid. Macrophages are specific phagocytes that migrate to wound sites, with the task of removing necrosis tissue, cell debris, bacteria and other particles component. The secretion of a glycoprotein, macrophages seems to be somewhat generalized as a characteristic of the response to inflammatory response. Descriptors: : Dental implant, osseointegration, macrophages, cytokines. 1 Titular em Materiais Dentários FOB/USP. 2 Dr. em Dentística FOB/USP. 3 Dr. em Ciências Odontológicas FOUSP. 4 Esp. em Disfunção ATM CFO. do autor: halim.nagem@terra.com.br Recebido para publicação: 02/10/2014 Aprovado para publicação: 06/10/2014 Como citar este artigo: Nagem F o H, Fares NH, Furuyama RF, Nogueira JC, Missaka R. Influência da superfície do implante sobre ações dos macrófagos e maturação celular.

2 54 Introdução No campo odontológico implantes dentais, dispositivos de titânio, têm uma longa e bem-sucedida aplicação histórica de excelente desempenho em termos de segurança, usabilidade e estabilidade em longo prazo. O titânio possui uma camada de óxidos de titânio (TiO 2 ) com elevada energia de superfície extremamente reativa, que através desta camada se estabelecem as ligações com os componentes do sistema biológico 21. O comportamento passivo da camada de óxido de titânio é uma característica relevante para a aplicação biomédica. As interações com o meio biológico após a inserção de um implante estão diretamente interligadas com as propriedades físico-químicas da superfície do material implantado. O conceito de osseointegração desenvolvido por Brånemark et al. 3 (1969) foi definido como a conexão estrutural e funcional entre osso vivo e a superfície de um implante sob a ação de carga funcional 7. Outro conceito que pode então ser introduzido é o de osseocondução. Basicamente refere-se a este termo para designar a função de carregadores dos fatores de crescimento e diferenciação óssea (FCDO), assim, podem funcionar como veículo que induz a neoformação óssea. A osseoindução, segundo Nakamura et al. 17 (2010), tem sido utilizada para descrever o processo de diferenciação de células osteoprogenitoras em condroblastos e osteoblastos, resultando na regeneração do tecido danificado. Por fim, pode-se também dizer que o termo osseointegração ou osseopromoção compreende o mecanismo de osseoindução, e a osseocondução ou o mecanismo de formação óssea por exibição de competitividade celular através de introdução de barreira 8. As características da superfície dos implantes revestem-se de uma importância extrema, uma vez que é nessa zona onde ocorrem as reações biológicas que induzem a osseointegração quando as condições são favoráveis. A osseointegração é um processo influenciado por vários fatores, entre eles o material do implante, seu desenho e a topografia superficial do mesmo 20. A microtopografia, denominada também como rugosidade superficial, é importante condicionadora da osteogênese, desde as fases moleculares até às fases celulares, devendo ser analisadas sempre que se procuram interpretar resultados referentes ao fenômeno da osseointegração e ao desempenho de implantes. A reação do tecido ósseo, provocada pela instalação do implante, tem como características iniciais fenômenos congestivo-exsudativo, infiltrado inflamatório, zona necrótica, proliferação celular de macrófagos, linfócitos, monócitos e células de reparação óssea, osteoblastos e de remodelação dos osteoclastos 15. O escopo deste artigo foi avaliar o conhecimento adquirido com o levantamento da revisão da literatura do efeito da superfície do implante de titânio cp a respeito do estado de maturação das células osteogênicas e o papel desempenhado nas respostas da ativação dos macrófagos. Revisão de literatura Osseointegração caracterizada pela neoformação óssea quando em íntimo contato com a superfície do implante indubitavelmente é um resultado desejado para o suporte de implante dentário. Salthouse 19 (1984) encontrou macrófagos em contato íntimo em implantes após 24hs e observou essas células em abundância em substratos rugosos. Refai et al. 18 (2004) investigaram quatro topografias da superfície do titânio produzidas por meio de polimento mecânico, com jateamento de areia, condicionamento ácido e jateamento e ataque ácido (SLA). Este estudo demonstrou que in vitro, a superfície de SLA em particular, modula a produção de citocinas e quimiocinas, incluindo fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucinas IL-1β, IL-6 provenientes da linha celular dos macrófagos. Nagem Filho et al. 15 (2009) fizeram saber que a instalação do implante dental desencadeia um processo inflamatório como resposta do tecido ósseo provocado pelo trauma cirúrgico, no qual uma cascata de mediadores promove alterações circulatórias. O entendimento desses processos é fundamental para melhor escolha de materiais e procedimentos na instalação do implante dental. Os estudos in vitro 11 apoiam esta hipótese, porque osteoblastos apresentam uma maior fixação inicial de titânio com superfície rugosa. Após perfuração óssea e inserção do implante inicia o envolvimento de uma resposta inflamatória com infiltração celular rica em células fagocitárias como função precípua. São os neutrófilos e macrófagos responsáveis em limpar o local da ferida de bactérias diversas (se houver), de partículas e componentes insolúveis decorrentes do quadro agressivo. De acordo com Nagem-Aragão et al. 13 (2011), as células inflamatórias do tecido conjuntivo são estimuladas por produtos de degradação da matriz a repovoar a área do implante. As citocinas formam um grupo diversificado de proteínas de sinalização intercelular, que regulam não apenas as respostas inflamatórias, imunológicas locais e sistêmicas, como também a formação de osso novo. A instalação do implante dental desencadeia um processo inflamatório como resposta do tecido ósseo provocado pelo trauma cirúrgico. O procedimento cirúrgico induz vários graus de inflamação, danos tissulares resultantes da ativação de células vasculares e circulatórias efetuadas por estímulos físicos ou por sinalização química nas estruturas das células rompidas 16. Mais recentemente, estudos funcionais ou mecanicistas feitos por Thalji;Cooper 21 (2014) for-

3 55 neceram evidências de que determinados sinais topográficos podem ser especificamente integrados entre os muitos sinais extracelulares recebidos pela célula na sua rede de transdução de sinal. Tais investigações começam a definir as ligações entre o caráter da superfície do implante e respostas celulares aderentes, incluindo as células do sangue extravasado e do sistema imunitário como os monócitos. Antes da migração das células, a matriz extracelular (ECM) dos fluídos plasmáticos é depositada sobre o substrato e, em seguida, há a migração de monócitos. A matriz extracelular é o agrupamento de elementos intercelulares dos organismos multicelulares. Assim, corresponde ao complexo de macromoléculas, dentre elas componentes fibrosos, proteínas e polissacarídeos. As células formam adesões focais e polarizaram, em seguida, a migrar ou proliferar formando colônia. Discussão Um dos proeminentes princípios do sistema inflamatório é a defesa do hospedeiro quando da ocorrência de lesões acometidas após perfurações com brocas de diâmetros progressivos no tecido ósseo. Um dos componentes primaciais para o sucesso da osseointegração está associado à estrutura da superfície do implante dentário. À medida que alguns pesquisadores descreveram fracassos significativos dos implantes com superfícies lisas, quando instalados em maxilares com pouca altura de rebordo alveolar e com baixa densidade óssea, incrementou-se a pesquisa e o desenvolvimento da superfície texturizada 14. A propriedade de superfície dos materiais e a qualidade do osso contribuem para acolher resposta celular e, em última análise, determinar o êxito ou a falha de um biomaterial implantado. O grau de integração correlaciona-se positivamente com a deposição daquilo que nomearam de filme condicionador glicoproteico que, por sua vez, depende de dois fatores: da textura, com sua propriedade de adsorção molecular ( wettability ) e da energia de superfície, com sua propriedade de embricamento celular 14. A adsorção proteica ocorre rapidamente com a formação de uma camada de 2nm a 5 nm no primeiro minuto após o contato com sangue. Como regra geral, as células não se aderem diretamente às superfícies dos materiais, e sim à camada glicoproteica extracelular que está adsorvida na superfície do implante 4. Embora exista um contínuo debate sobre a natureza de uma adequada adesão ao implante, não existe dúvida de que em um determinado estágio as células são atraídas e se adequam para formar o tecido de integração. A instalação do implante dental desencadeia um processo inflamatório como resposta do tecido ósseo provocado pelo trauma cirúrgico, no qual uma cascata de mediadores promove alterações circulatórias. As células interagem com a superfície de um material por meio de uma camada adsorvida de proteínas, açúcares e lipídeos presentes no sangue e fluido de tecidos. Os primeiros elementos citados por Nagem Filho et al. 14 (2007) a entrar em contato com o implante no estágio inicial são células atraídas que aderem ao implante para formar o tecido de integração. A aderência de células à superfície do implante é um assunto complexo porque existem três distintos tipos de células envolvidas: tecido epitelial, tecido conjuntivo e tecido ósseo. Carter 5 (1967) sugeriu o termo haptotaxis para descrever uma hipótese para o movimento direcional das células envolvendo a mobilidade que ocorre como resultado da variação do grau de certas características adesivas no substrato. Após a cirurgia, umas séries de eventos celulares ocorrem na circunjacência do implante que normalmente envolve a formação sequencial de um coágulo de sangue fibroso, deposição de colágeno, angiogênese, formação de osteoide e mineralização 2. O implante inserido no osso torna-se rapidamente coberto por uma camada de exsudato de fluídos plasmáticos incorporado com proteínas do sangue, que irão aderir em contato íntimo à superfície, controlando através de processos enzimáticos a adesão inicial de células, imputando o tipo de interface do implante. Na transcorrência do processo inflamatório agudo evidencia-se o sistema ativação, a secreção de citocinas, moléculas de adesão, contato célula/célula e movimento (migração). Os neutrófilos oriundos da circulação são as primeiras células a alcançarem a região inflamada, sendo os tipos celulares predominantes entre o primeiro e segundo dias. Sua função principal neste processo é de eliminação de possíveis microrganismos pela fagocitose. A saturação de mediadores quimiotáticos dirigidos para um mesmo receptor torna a célula em migração irresponsiva a este e leva à regulação negativa de sua expressão na membrana 12 e os neutrófilos oriundos da circulação, após a diapedese, cessam a migração passando a residir difusamente no coágulo. Com a evolução do processo, a matriz extracelular que inicialmente era composta principalmente por proteínas derivadas de plaquetas e do plasma, passa por modificações em sua composição. A migração e ativação de macrófagos para a região, somada à presença de vasos neoformados, permitem que os componentes da nova matriz extracelular passem a ser localmente produzidos principalmente por essas células 1. Os macrófagos são fagócitos específicos que, juntos aos neutrófilos, migram para locais das feridas, como parte de uma operação de remoção de tecido necrosado, restos de células, bactérias e outras partículas. A secreção de uma glicoproteína, denominada de osteopontina (OPN) pelos macrófagos, parece ser um tanto generalizada como característica da resposta inflamatória após necrotizante lesão tecidual. Contudo, Nagem F o H, Fares NH, Furuyama RF, Nogueira JC, Missaka R.

4 56 a expressão OPN fornece um gradiente quimiotáctico que induz o recrutamento de macrófagos adicionais no local da ferida que, por sua vez, produz OPN adicional 11. Uma vez visto principalmente como uma força motriz da inflamação crônica, os macrófagos também podem funcionar na regulação imune e cicatrização de feridas. Os macrófagos contribuem para a reparação de tecidos e atuam como células compostas de antigênicos, que são necessários para a indução de respostas imunitárias específicas. Esses fenótipos funcionais de acordo com Barth et al. 2 (2013) são realizados por dois subgrupos de macrófagos: (a) a clássica ativada ou macrófagos não especializados M1 e (b) a alternativa ativada ou macrófagos especializados M2. O fenótipo M1 é ativado pelo reconhecimento de receptores de interferon-y (IFN-y), o TNF-α, ou receptores de células T, envolvidos em padrões moleculares associados aos receptores antígenos-específicos essenciais para a resposta imune. Estão presentes na superfície externa dos linfócitos T (TCR). Os macrófagos clássicos ativados (M1) produzem citocinas inflamatórias envolvidas na inflamação crônica, na limpeza de ferida de bactérias e de tecidos danificados. Os fenótipos M2 são provocados por uma variedade de estímulos endógenos. Macrófagos de alternativa ativada (M2) são ativados por IL-10, complexo- imune, bem como células apoptóticas. Sua principal função é de regular negativamente a inflamação pela secreção do imunossupressor citocina IL-10. Propriedades de superfície, incluindo topografia, energia de superfície, a química e a carga de superfície são, em grande parte, responsáveis por esta interação. Uma apreciação geral para os fenômenos de adesão celular em superfícies de implantes endósseos inclui específicos papéis para proteínas aderentes (ECM) da matriz extracelular como fibronectina, osteopontina e transmembrana e a receptores (por exemplo, integrinas) presentes na célula aderente 21. A instalação do implante dental desencadeia um processo inflamatório como resposta do tecido ósseo provocado pelo trauma cirúrgico, no qual uma cascata de mediadores promove alterações circulatórias 16. As citocinas formam um grupo diversificado de proteínas de sinalização intercelular, que regulam não apenas as respostas inflamatórias, imunológicas locais e sistêmicas, como também a formação de osso novo. Para regular a atividade celular, as citocinas utilizam seus atributos de pleiotropismo e equilibram o funcionamento tanto na iniciação quanto na manutenção das respostas inflamatórias, além de determinarem o tipo de mecanismo do efeito que medeia a resistência. A resposta é controlada por uma cascata de citocinas iniciada pela síntese de interleucinas 15. A hipótese de que a superfície rugosa pode ativar fenótipos em macrófagos é suportado pelos recentes estudos in vivo de Chehroudi et al. 6 (2010) que observaram uma superior densidade de macrófagos e mais rápida mineralização em superfícies rugosas quando comparados com implantes lisos. Madden et al. 10 (2010) também constataram uma osseointegração, a angiogênese, ou reduzida encapsulação fibrosa em substratos rugosos ou porosos em tempos mais curtos. Embora haja evidências abundantes de que a topografia da superfície pode influenciar o comportamento de muitos tipos de células, incluindo osteoblastos, células epiteliais, fibroblastos e macrófagos, os mecanismos moleculares específicos através do qual os efeitos topográficos são produzidos não são bem compreendidos. A superfície rugosa promove diferenciação osteogênica de células imaturas, aumentando sua capacidade de resposta. Com a maturação das células elas exibem uma sensibilidade reduzida ao substrato, mas até mesmo o osteócito terminal sua diferenciação é afetada por mudanças na rugosidade da superfície 9. Conclusão Em face das inferências observadas na exposição teórica deste trabalho, pode-se concluir que: A rugosidade superficial é um fator importante para a escolha do implante porque aumenta a área de osseointegração no contato osso e implante. As características topográficas das superfícies influenciam diretamente nas respostas celulares, potencializando estas respostas e, consequentemente, influenciando todo o processo de osseointegração. Os macrófagos são fagócitos específicos que migram para locais das feridas, como componente de uma tarefa de remoção de tecido necrosado, restos de células, bactérias e outras partículas. Os macrófagos contribuem para a reparação de tecidos e atuam como células compostas de antigênicos. Os macrófagos também podem funcionar na regulação imune e cicatrização de feridas. Referências 1. Balbino CA, Pereira LM, Curi R. Mecanismos envolvidos na cicatrização: uma revisão. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas jan./mar; 41(1): Barth KA, Waterfield JD, Brunette DM. The effect of surface roughness on RAW macrophage phenotype. J Biomed Mater Res A Sep; 101(9): Brånemark PI, Adell R, Breine U, Hansson BO, Lindström J, Ohlsson A. Intra-osseous anchorage of dental prostheses I. Experimental studies. Scand J Plast Reconstr Surg. 1969; 3(2): Brunette DM. The effects of implant surface topography on the behavior of cells. Int J Oral Maxillofac Implants. 1988; 3: Carter SB. Haptotaxis and the mechanism of cell motility. Nature. 1967; 213(5073): Chehroudi B, Ghrebi S, Murakami H, Waterfield JD, Owen

5 57 G, Brunette DM. Bone formation on rough, but not polished, subcutaneously implanted Ti surfaces is preceded by macrophage accumulation. J Biomed Mater Res A 2010 May; 93(2): Goto T. Osseointegration and dental implants. Clin Calcium Feb; 24(2): Kienapfel H, Sprey C, Wilke A, Griss P. Implant fixation by bone ingrowth. J Arthroplasty Apr; 14(3): Lohmann CH, Bonewald LF, Sisk MA, Sylvia VL, Cochran DL, Dean DD, Boyan BD, Schwartz Z. Maturation state determines the response of osteogenic cells to surface roughness and 1,25-dihydroxyvitamin D3.J Bone Miner Res Jun; 15(6): Madden LR, Mortisen DJ, Sussman EM, Dupras SK, Fugate JA, Cuy JL, Hauch KD, Laflamme MA, Murry CE, Ratner BD. Proangiogenic scaffolds as functional templates for cardiac tissue engineering. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107: McKee MD, Pedraza CE, Kaartinen MT. Osteopontin and wound healing in bone. Cells Tissues Organs. 2011; 194(2-4): Murdoch C1, Finn A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood May 15; 95(10): Nagem Aragão VD, Nagem HD, Nagem-Filho H, Campi Jr L. Remodelação das estruturas teciduais da interface osso/ implante. Full Dent. Sci (7): Nagem Filho H, Francisconi PAS, Campi Jr L, Fares N. Influência da textura superficial dos implantes. Rev. Odonto Ciênc; 2007 jan.-mar; 22(55): Nagem-Filho H, Erxleben J, D Azevedo MTFS, Fiuza CT. Aspectos histofisiológicos do tecido ósseo na instalação do implante dental. Full Dent. Sci (1): Nagem Filho H, Nagem HD, Fiuza CT, D Azevedo MTFS, Campi Jr L. Biologia e mecanismo bioquímico ósseo durante a osseointegração. Full Dent. Sci Out. Dez; 3(9): Nakamura M, Nagai A, Tanaka Y, Sekijima Y, Yamashita K. Polarized hydroxyapatite promotes spread and motility of osteoblastic cells. J Biomed Mater Res A Feb; 92(2): Refai AK, Textor M, Brunette DM, Waterfield JD. Effect of titanium surface topography on macrophage activation and secretion of proinflammatory cytokines and chemokines. J Biomed Mater Res A Aug 1; 70(2): Salthouse TN. Some aspects of macrophage behavior at the implant interface. J Biomed Mater Res Apr; 18(4): Sykaras N, Iacopino AM, Marker VA, Triplett RG, Woody RD. Implant materials, designs, and surface topographies: their effect on osseointegration. A literature review. Int J Oral Maxillofac Implants Sep-Oct; 15(5): Thalji G, Cooper LF. Molecular assessment of osseointegration in vitro: a review of current literature. Int J Oral Maxillofac Implants Mar-Apr; 29(2):e