AGRADECIMENTOS II CONAC EMBRAPA AMAZÔNIA ORIENTAL - Belém (PA) Dr. Altevir de Matos Lopes

Transcrição

1 USO DE BIOLOGIA MOLECULAR NA IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS NA CULTURA DO FEIJÃO-CAUPI PAULO SERGIO TORRES BRIOSO Professor Associado - UFRRJ, Doutor 2009

2 AGRADECIMENTOS II CONAC EMBRAPA AMAZÔNIA ORIENTAL - Belém (PA) Dr. Altevir de Matos Lopes

3 PRODUÇÃO Região nordeste: 85 % da área colhida Região sudeste: 8 % da área colhida (mais da metade, no Estado do Rio de Janeiro) Região norte Região centro-oesteoeste

4 PRINCIPAIS FITOPATÓGENOS EM FEIJÃO-CAUPI BACTÉRIAS FUNGOS NEMATÓIDES VÍRUS Associações (vírus X vírus; fungos X nematóides?)

5 COMPLEXO CAUSAL Virulência do patógeno Efeito sinérgico entre patógenos Vetor Suscetibilidade da cultivar Idade da planta na época da infecção Condições Ambientais Grau de Severidade da Doença

6 PERDAS EM FEIJÃO-CAUPI OCASIONADAS POR VÍRUS 80% de perda - Gonçalves & Lima, 1988

7 DIAGNOSE VIRAL Testes Biológicos: Inoculação mecânica, enxertia, Cuscuta sp., vetores

8 INOCULACÃO MECÂNICA

9 ENXERTIA

10 CUSCUTA

11 AFÍDEOS

12 MOSCA BRANCA

13 COLEÓPTEROS

14 DIAGNOSE VIRAL Microscopia: Ótica, de Fluorescência, Eletrônica

15 Cucumber mosaic virus Inclusão (Microscopia Ótica)

16 Cucumber mosaic virus (Microscopia Eletrônica de Transmissão)

17 DIAGNOSE VIRAL Testes Sorológicos: ELISA, Eletrônica, Dot-ELISA, Imunofluorescência Imunomicroscopia Microscopia de

18 TESTE SOROLÓGICO DOT-ELISA E ELISA

19 DIAGNOSE VIRAL Testes Moleculares

20 BIOLOGIA MOLECULAR Avery, MacLeod & McCarty - DNA genômico de bactéria - transmissão de caracteres hereditários Hershey & Chase - DNA como material genético Watson & Crick - Modelo estrutural de dupla hélice da molécula de DNA

21 FITOPATOLOGIA MOLECULAR 1956: Gierrer & Schramm - Tobacco mosaic virus (TMV) e plantas de Fumo - RNA como material genético 1960: Anderer et al., Fraenkel-Conrat et al. - Seqüenciamento de aminoácidos do capsídeo do TMV Isolamento e uso de enzimas de restrição Ligação de fragmentos de DNA através da DNA ligase Construção de uma molécula de DNA circular recombinante Desenvolvimento em paralelo de inúmeras técnicas moleculares

22 TÉCNICAS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS EM FEIJÃO-CAUPI Extração e Eletroforese do ácido nucléico Clonagem e Seqüenciamento do ácido nucléico RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) Hibridização de ácidos nucléicos - Teste de Northern Blot, Teste de Southern Blot e Teste de Dot Blot) Polymerase Chain Reaction (PCR) e modalidades (RT-PCR, IC-PCR, Real Time- PCR, etc)

23 Açúcar Base Fosfato

24 SEQÜENCIAMENTO

25 SEQÜÊNCIAS DISPONÍVEIS DE FITOVÍRUS National Center for Biotechnology Information (NCBI)

26 FAMÍLIAS VIRAIS X SUSCETIBILIDADE DO FEIJÃO-CAUPI 1. Bromoviridae 2. Bunyaviridae 3. Caulimoviridae 4. Comoviridae 5. Geminiviridae 6. Luteoviridae 7. Partitiviridae 8. Potyviridae 9. Rhabdoviridae 10.Tombusviridae 11. Indeterminadas

27 Açúcar Base Fosfato

28 TESTE DE DOT BLOT SONDA NÃO RADIOATIVA SONDA RADIOATIVA Substrato Fluorescência amostra s F F Conjugado-AP Anti-Fluoresceina Sonda marcada com Fluoresceina amostras 32 P 32 P Sonda marcada com 32 P Membrana de Nylon NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO Sondas disponíveis para vírus de Feijão-caupi: 4 vírus 2 sorotipos

29 TESTE DE PCR 0) Ciclo inicial - 55ºC 1) Desnaturação do DNA - 90ºC 2) Anelamento dos Primers - 55ºC 3) Polimerização - 72ºC

30 TESTE DE PCR

31 TESTE DE RT-PCR DNA RNA

32 TESTE DE IMUNOCAPTURE- PCR

33 FAMÍLIAS VIRAIS X SUSCETIBILIDADE DO FEIJÃO-CAUPI 1. Bromoviridae 2. Bunyaviridae 3. Caulimoviridae 4. Comoviridae 5. Geminiviridae 6. Luteoviridae 7. Partitiviridae 8. Potyviridae 9. Rhabdoviridae 10.Tombusviridae 11. Indeterminadas

34 GÊNEROS VIRAIS X SUSCETIBILIDADE DO FEIJÃO-CAUPI Alphacryptovirus 2. Alfamovirus 3. Begomovirus 4. Bromovirus 5. Capillovirus 6. Carlavirus 7. Carmovirus 8. Comovirus 9. Cucumovirus 10.Curtovirus 11.Dianthovirus 12.Enamovirus 13.Fabavirus 14.Ilarvirus 15.Macluravirus 16.Nanovirus 17.Necrovirus 1. Nepovirus 2. Nucleorhabdovirus 3. Oleavirus 4. Ourmiavirus 5. Pecluvirus 6. Polerovirus 7. Potexvirus 8. Potyvirus 9. Sobemovirus 10.Soybean chlorotic mottle-like like viruses 11.Tobamovirus 12.Tobravirus 13.Tombusvirus 14.Tospovirus 15.Trichovirus 16.Tymovirus 17.Vitivirus 17.

35 SEQÜENCIAMENTO E DIAGNOSE MOLECULAR DE FITOVÍRUS (RNA) NO BRASIL Histórico: Andean potato mottle virus (APMoV) - Primeiro fitopatógeno completamente seqüenciado no Brasil Isolados virais oriundos de feijão-caupi caupi: Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) Isolados virais (que infectam o feijão-caupi) mas oriundos de outras culturas: Cucumber mosaic virus (CMV) Cowpea rugose mosaic virus (CPRMV)

36 PRINCIPAIS VÍRUS QUE INFECTAM O FEIJÃO- CAUPI NO BRASIL 1. Cucumber mosaic virus (CMV) - Bromoviridae 2. Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) - Comoviridae 3. Cowpea golden mosaic virus (CpGMV) - Geminiviridae 4. Bean common mosaic virus (BCMV) - Potyviridae 5. Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) - Potyviridae 6. Cowpea green vein banding virus (CGVBV) - Potyviridae 7. Cowpea rugose mosaic virus (CPRMV) - Potyviridae 8. Cowpea severe mottle virus (CPSMoV) - Potyviridae

37 TESTE DE RT-PCR, DOT-BLOT Brioso et al. (1996), Passos (1999), Figueiredo et al. (2000) e Passos et al. (2000) - CPSMV e o CABMV: Seleção inicial de plantas de feijão-caupi resistentes a vírus Diagnose precoce das espécies virais na cultura Detecção de vetores virulíferos (no caso, de besouro, pulgão)

38 Tamanho esperado do fragmento amplificado e posição correspondente dos oligonucleotídeos degenerados na seqüência do RNA 2 viral, elaborados a partir de regiões de aminoácidos conservados na subunidade maior e subunidade menor do capsídeo viral das espécies do gênero Comovirus. VÍRUS FRAGMENTO (pb) SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS AWSTQV GPN*GFE APMoV ** BPMV CPMV CPSMV RCMV SqMV APMoV - Andean potato mottle virus; BPMV - Bean pod mottle virus; CPMV - Cowpea mosaic virus; CPSMV - Cowpea severe mosaic virus; RCMV - Red clover mottle virus; SqMV - Squash mosaic virus; pb - Pares de bases nucleotídicas; * - N ou R; ** - Posição correspondente na seqüência nucleotídica do RNA 2 viral.

39 COMOVIRUS - ESPÉCIES VIRAIS Teste de RT-PCR - Par de oligonucleotídeos degenerados correspondentes às seqüências de aminoácidos conservados, AWSTQV e GPN*GFE (* = N ou R), nas subunidades do capsídeo das espécies do gênero Comovirus: L 1 kb DNA Ladder, A APMoV estirpe B, B APMoV estirpe C, C CPSMV sorotipo I, D N. rustica sadia, E Feijãocaupi sadio, F - CPSMV sorotipo II, G - BPMV (Brioso et al., 1996)

40 NORTHERN BLOT - CPSMV A) RNA middle APMoV estirpe C L) 1 kb DNA ladder B) RNA middle CPSMV sorotipo I C) RNA bottom CPSMV sorotipo I Brioso et al., 1996

41 SELEÇÃO INICIAL DE PLANTAS DE FEIJÃO- CAUPI RESISTENTES Passos (1999) - Técnica de RT-PCR, a partir de um par de oligonucleotídeos degenerados correspondentes às seqüências de aminoácidos conservados (CPSMV). Resistente ao Sorotipo I e Sorotipo II: BR 14 - Mulato, BR 17 - Gurguéia, TE F Resistente ao Sorotipo I e suscetível ao Sorotipo II: IT 89KD-260, TE E Resistente ao Sorotipo II e suscetível ao Sorotipo I: TE F, TE F, TE F, TE F.1, TE F.2, TE F.2, TE F

42 Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) sorotipo I L pb Eletroforese em gel de agarose a 1%, do fragmento amplificado por RT-PCR com primers específicos para o CPSMV: (L) Padrão de massa molecular 1kb DNA Ladder, (1) cv. Costelão sadio, (2) TE F infectada com o CPSMV sorotipo I, (3) Controle sem RNA

43 L Eletroforese em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio, do fragmento amplificado com primers específicos para o CPSMV, a partir de amostras de linhagens de feijão-caupi TE F e IT 89D-260 infectadas com o CPSMV sorotipo I (2) e CPSMV sorotipo II (3), respectivamente. Padrão de massa molecular, 1kb DNA Ladder (L). Feijãocaupi Costelão sadio (1). Controle sem RNA (4). (Nogueira et al., 2003)

44 Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV)

45 SELEÇÃO INICIAL DE PLANTAS DE FEIJÃO- CAUPI RESISTENTES Figueiredo et al. (2000) - RT-PCR, a partir de um par de oligonucleotídeos específicos ao CABMV - fragmento específico de 759 pb Resistente: Capela, IT , IT , IT , TE G, TE G Suscetível: BR-14-Mulato, BR-17-Gurguéia, CNC 0434, Costelão, Monteiro, Pitiúba, Seridó, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE E, TE E, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F, TE F

46 TESTE DE DOT BLOT/ CPSMV Cerotoma arcuata ML/Feijao/FeijaoCaupi/pragas_aereas.htm

47 Cowpea golden mosaic virus (CpGMV)

48 Cowpea golden mosaic virus (CpGMV) L L ,5 kb 1,2 kb Amostras foliares amplificadas com Primers específicos: (L) 1 kb; (1) Feijãocaupi com CpGMV; (2) Feijão-caupi sadio; (3) amostra sem DNA Amostras foliares amplificadas com Primers específicos: (L) 1 kb; (1) Feijão-caupi com CpGMV; (2) Feijão-caupi sadio; (3) amostra sem DNA

49 CULTIVAR DE FEIJÃO-CAUPI Nogueira (2003) e Nogueira et al. (2005): seqüenciamento produto amplificado; confecção de sonda molecular específica ao CPSMV e ao CABMV; identificar e selecionar plantas imunes a estes vírus; linhagens de feijão-caupi adaptadas para o Estado do Rio de Janeiro Primeira cultivar de feijão-caupi produtiva, imune ao CPSMV (sorotipo I e sorotipo II), CABMV e adaptada ao Estado do Rio de Janeiro

50 QUEBRA DE RESISTÊNCIA Nogueira et al., 2009 Capela Mosaico severo Infecção mista CMV + CABMV CMV (oriundo do feijão-caupi do Piauí/ 1982) 53% transmissão pela semente de feijão Rico 23

51 FITOPATOLOGISTA + MELHORISTA X FITOPATÓGENOS + Prêmio Frederico de Menezes Veiga 2009, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

52 2006

53 kg/ha

54 TÉCNICAS MOLECULARES Perguntas freqüentes: Tem custo elevado? É obrigatória a sua utilização? Vou ter que Laboratório? remodelar e re-aparelhar o

55 ESCOLHA DA TÉCNICA Custos e materiais necessários Finalidade Nº de amostras a serem processadas Precisão Sensibilidade Treinamento do operador

56 CONCLUSÃO Técnicas Moleculares - Ampla versatilidade, eficiência, precisão e sensibilidade Diferentes linhas de trabalho, independentemente do patógeno, do vetor e da cultura enfocada Linguagem comum entre Fitopatologistas e outros profissionais Técnica adotada em grande parte dos laboratórios de universidades e de empresas, públicas ou privadas na diagnose molecular de vírus (patógenos) de feijão-caupi

57 LABORATÓRIO OFICIAL DE DIAGNÓSTICO FITOSSANITÁRIO DA UFRRJ - EQUIPE Laboratório credenciado junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento para análise de fungos, procariotos, nematóides, vírus e viróides em produtos de origem vegetal e expedir laudo oficial de diagnóstico fitossanitário. Atualmente, a equipe é formada por Doutorando, 2 Mestrandos, 1 Estagiário, 5 Servidores 2 Docentes-doutores, 1

58 CONTATO Laboratório Oficial de Diagnóstico Fitossanitário Instituto de Biologia Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Caixa Postal Seropédica, RJ CEP: