TÉCNICAS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS EM FEIJÃO-CAUPI

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1 TÉCNICAS MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS EM FEIJÃO-CAUPI P. S. T. BRIOSO 1 No Brasil, de acordo com os dados do Censo Agropecuário de 1996/IBGE ( foram produzidas toneladas de feijão-caupi, em uma área de ,143 ha, sendo a região nordeste responsável por mais de 85 % da área colhida. Dos 15 % restantes, mais de 8 % da área foi colhida na região sudeste, tendo sido mais da metade (2.682,880 ha) no Estado do Rio de Janeiro. Vários são os agentes patogênicos que podem incidir na cultura e provocar perdas na qualidade e no rendimento, em especial fungos, bactérias, nematóides e vírus (Santos et al., 1999). A virulência do patógeno, o efeito sinérgico entre patógenos, a suscetibilidade do cultivar, a idade da planta na época da infecção, além das condições ambientais, irão determinar o grau de severidade da doença. A Fitopatologia, definida de forma ampla como o estudo das doenças de plantas e, especificamente, como o estudo da interação entre patógeno, hospedeira e meio ambiente, passou a ter, progressivamente a partir da década de 1950, a Biologia Molecular como uma forte aliada, seja na taxonomia, na etiologia, na diagnose, no estudo da interação entre patógeno e hospedeira ou vetor e, também, no controle. A Biologia Molecular praticamente iniciou em 1944, com o trabalho de Avery, MacLeod & McCarty, que indicou que o DNA contido no genoma de uma bactéria seria o material genético da célula e o responsável pela transmissão de seus caracteres hereditários. Isso foi confirmado em 1952, por Hershey & Chase, a partir do uso de um bacteriófago contendo o DNA viral marcado radioativamente que, injetado numa bactéria, promoveu o aparecimento de novas partículas virais, confirmando o papel do DNA como material genético; e culminou em 1953, com a proposta de modelo estrutural de dupla hélice da molécula de DNA desenvolvida por Watson & Crick (Lambais, 1995; Agrios, 1997; Barros & Moreira, 2000). No entanto, o marco inicial da dita Fitopatologia Molecular pode ser considerado o trabalho de Gierrer & Schramm, em 1956, utilizando como modelo o Tobacco mosaic virus (TMV) e plantas de fumo, confirmando que o RNA viral era o responsável pela infecção das células vegetais e pela reprodução de novas partículas virais, demonstrando assim o papel do RNA como material genético. Em 1960, a partir das informações obtidas por Anderer et al. e por Fraenkel-Conrat et al., através do seqüenciamento de aminoácidos do capsídeo do TMV, foi decifrado o código genético deste vírus (Matthews, 1991; Agrios, 1997). Outros avanços da Biologia Molecular, como o isolamento e uso de enzimas de restrição, a ligação de fragmentos de DNA através da DNA ligase e a construção de uma molécula de DNA circular recombinante, com o desenvolvimento em paralelo de inúmeras técnicas moleculares, impulsionaram a atual Fitopatologia Molecular, um híbrido entre a Fitopatologia e a Biologia Molecular. Como principais técnicas moleculares utilizadas na diagnose dos fitopatógenos e seus possíveis vetores temos a Extração e Eletroforese do ácido nucléico; o RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ); a Clonagem e Seqüenciamento do ácido nucléico; a Hibridização de ácidos nucléicos (Teste de Northern Blot, Teste de Southern Blot e Teste de Dot Blot) e o Polymerase Chain Reaction (PCR) nas suas diferentes modalidades. Em relação a esta última técnica, diversas variações foram desenvolvidas, podendo também estar combinada a outras técnicas (Brioso, 2000). Dependendo do princípio e das condições de condução, os testes moleculares podem ser eficientes para discriminar gêneros, espécies, estirpes e subgrupos de fitovírus (Brioso et al., 2001). 1 Instituto de Biologia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Caixa Postal 74585, CEP: , Seropédica, RJ. brioso@bighost.com.br

2 Em muitos países, as doenças viróticas são o fator limitante para a produção do caupi. No mundo, esta leguminosa apresenta suscetibilidade a cerca de 34 gêneros virais envolvendo mais de 119 espécies virais (Tabela 1). Tabela 1. Relação de alguns gêneros e famílias virais para os quais o caupi (V. unguiculata) é suscetível. Gênero viral Família viral Alphacryptovirus Partitiviridae Alfamovirus Begomovirus Geminiviridae Bromovirus Capillovirus - Carlavirus - Carmovirus Comovirus Cucumovirus Curtovirus Geminiviridae Dianthovirus Enamovirus Luteoviridae Fabavirus Ilarvirus Macluravirus Potyviridae Nanovirus - Necrovirus Nepovirus Nucleorhabdovirus Rhabdoviridae Oleavirus Ourmiavirus - Pecluvirus - Polerovirus Luteoviridae Potexvirus - Potyvirus Potyviridae Sobemovirus - Soybean chlorotic mottle-like viruses Caulimoviridae Tobamovirus - Tobravirus - Tombusvirus Tospovirus Bunyaviridae Trichovirus - Tymovirus - Vitivirus - Métodos biológicos, sorológicos e físico-químicos, com suas vantagens e desvantagens, têm sido utilizados para detectar, diagnosticar e classificar os vírus vegetais durante décadas. Com o avanço da Biologia Molecular, parâmetros moleculares também começaram a ser amplamente explorado no estudo desses fitopatógenos. Com a automatização do seqüenciamento houve um aumento expressivo no número de seqüências disponíveis para os diferentes fitovírus, que podem ser acessadas no endereço eletrônico do National Center for Biotechnology Information (NCBI) -

3 Entrez/index.html ou através de diferentes sistemas computadoracionais (por exemplo, VAX/VMS, UNIX, IBM-PC, MACINTOSH, etc) associados a programas específicos (por exemplo, GCG Fragment Assembly System, Omiga TM 2.0, etc) que acessam diferentes bancos de dados e permitem a manipulação e análise a nível de nucleotídeo e de aminoácidos das inúmeras seqüências. Tais dados têm auxiliado na confecção de oligonucleotídeos e sondas moleculares específicas aos diferentes vírus que infectam o feijão-caupi. Em 1992, foi diagnosticado pela primeira vez no Brasil, através de uma modalidade da técnica de PCR, um vírus da família (Brioso, 2000). Desde então, essa é uma das técnicas moleculares mais adotadas na Virologia e, em especial, para o diagnóstico molecular de vírus em feijão-caupi. No Brasil, os principais vírus que infectam o feijão-caupi são: o Cucumber mosaic virus (CMV) (família ), o Cowpea severe mosaic virus (CPSMV) (família ), o Cowpea golden mosaic virus (CpGMV) (família Geminiviridae), o Bean common mosaic virus (BCMV) (família Potyviridae), o Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) (família Potyviridae), o Cowpea green vein banding virus (CGVBV) (família Potyviridae), o Cowpea rugose mosaic virus (CPRMV) (família Potyviridae), o Cowpea severe mottle virus (CPSMoV) (família Potyviridae) (Kitajima, 1986; Kitajima, 1995; Lima et al., 1998). Em relação a tais vírus na cultura do feijão-caupi, os primeiros trabalhos utilizando técnicas moleculares foram os conduzidos por Brioso et al. (1996), Passos (1999), Figueiredo et al. (2000) e Passos et al. (2000) envolvendo o CPSMV e o CABMV, de forma a diagnosticar precocemente a espécie viral na cultura, na seleção inicial de plantas de caupi resistentes ao vírus ou na detecção de vetores virulíferos (no caso do besouro Cerotoma arcuata Oliv. - Coleoptera: Chrysomelidae - infectado com o CPSMV). A partir de um par de oligonucleotídeos degenerados correspondentes às seqüências de aminoácidos conservados, AWSTQV e GPN*GFE (* = N ou R), nas subunidades do capsídeo das espécies do gênero Comovirus foi possível obter fragmento de 593 pb através do teste de Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) para os sorotipos I e II do CPSMV oriundo de preparação de RNA foliar de caupi Seridó infectado. Assim como foi possível obter padrão de amplificação distinto entre as três espécies do gênero que foram testadas, permitindo a identificação das mesmas (Brioso et al., 1996). Sondas moleculares para o CPSMV, produzidas por PCR (a partir de produto amplificado com um par de oligonucleotídeos degenerados do teste de RT-PCR), permitiram a diagnose deste vírus após o teste de Northern Blot (Brioso et al., 1996). Passos (1999) utilizando a técnica de RT-PCR, a partir de um par de oligonucleotídeos degenerados correspondentes às seqüências de aminoácidos conservados, procedeu a seleção inicial de plantas de feijão-caupi resistentes aos sorotipos do CPSMV. Figueiredo et al. (2000) utilizando-se da técnica de RT-PCR, a partir de um par de oligonucleotídeos específicos ao CABMV obteve fragmento específico de 759 pb a partir de extratos foliares de feijãocaupi infectado. Nogueira et al. (2003), utilizando a técnica de RT-PCR, conseguiu identificar e separar os sorotipos I e II do CPSMV. Nogueira (2003) e Nogueira et al. (2005), após seqüênciamento de produto amplificado e confecção de sonda molecular específica ao CPSMV e ao CABMV conseguiram identificar e selecionar plantas imunes a estes vírus, permitindo desta forma auxiliar o melhoramento genético na obtenção de linhagens de feijão-caupi adaptadas para o Estado do Rio de Janeiro. Graças a esse trabalho, em 2006, deverá ser lançada a primeira cultivar de feijão-caupi produtiva, imune a estes dois vírus e adaptada ao Estado do Rio de Janeiro. Nogueira, M.S.R. & Brioso, P.S.T., em 2006, (dados não publicados) tem desenvolvido teste molecular para a detecção simultânea do CPSMV e do CABMV em amostras foliares de feijão-caupi, agilizando ainda mais o processo de detecção molecular destes vírus.

4 A presença de vetores ou organismo de transmissão é, por vezes, condição essencial para alguns fitopatógenos acarretarem doença. Desse modo, a detecção do patógeno nesses organismos pode representar importante auxílio na predição de epidemias, na identificação de possíveis vetores ou transmissores do patógeno, no exame dos mecanismos de transmissão em nível de interações entre o patógeno e o vetor. O mais comum é o estudo dos organismos vetores de vírus, onde vários métodos (microscopia eletrônica, ELISA, etc) têm sido usados para detectar os vírus nos seus vetores e para estudar o mecanismo de transmissão em nível de interação vetor-patógeno. Porém, tais métodos têm demonstrado uso limitado, especialmente nos casos de transmissão não persistente, devido aos curtos períodos de aquisição e à pequena quantidade de patógeno adquirida (López-Moya et al., 1992). Com a maior sensibilidade oferecida pelos métodos moleculares, onde é possível detectar o patógeno a partir da análise de um único organismo vetor, registros de detecção do patógeno no vetor têm sido demonstrados. Como o caso da detecção do CPSMV, por Dot Blot, no besouro C. arcuata virulífero através de sondas moleculares produzidas por PCR (a partir de produto amplificado com um par de oligonucleotídeos degenerados no teste de RT-PCR) (Brioso et al., 1996). Desta forma, observa-se que as técnicas que exploram o ácido nucléico têm representado um verdadeiro elo entre os fitopatologistas, pois devido a sua ampla versatilidade, eficiência, precisão e sensibilidade podem ser aplicadas nas mais diferentes linhas de trabalho, independentemente do patógeno, do vetor e da cultura enfocada, tornando-se uma linguagem comum entre tais profissionais. Atualmente, a utilização das técnicas de biologia molecular passou a ser uma ferramenta ímpar para os fitopatologistas, sendo adotadas em grande parte dos laboratórios de universidades e de empresas, públicas ou privadas na diagnose molecular de vírus de feijão-caupi (Brioso et al., 2001). Referências AGRIOS, G. N. Plant Pathology. San Diego: Academic Press, BARROS, E.G.; MOREIRA, M.A. Biotecnologia: um breve histórico. Informe Agropecuário, v. 21, p. 3-13, BRIOSO, P. S. T. Emprego de PCR na identificação de Fitopatógenos. Fitopatologia Brasileira, Fortaleza, v. 25, n.suplemento, p , BRIOSO, P. S. T.; POZZER, L.; MONTANO, H. G.; PIMENTEL, J. P. Uso atual e futuro da Biologia Molecular na Fitopatologia. Parte I - Aplicações em fitopatógenos e vetores. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 9, p , BRIOSO, P. S.T.; SANTIAGO, L. J. M.; ANJOS, J. R. N.; OLIVEIRA, D. E. Identificação de espécies do gênero comovirus através de Polymerase Chain Reaction. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 21, n. 2, p , FIGUEIREDO, A. R.; FREIRE FILHO, F.R.; BRIOSO, P.S.T. Avaliação de linhagens e cultivares de caupi à infecção pelo Cowpea aphid borne mosaic virus e detecção do vírus por RT-PCR. In: JORNADA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA UFRRJ, 10, Seropédica, Resumos Expandidos... p KITAJIMA, E. W. Lista de publicações sobre viroses e enfermidades correlatas de plantas no Brasil ( ). Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. suplemento, KITAJIMA, E. W. Lista de publicações sobre viroses e enfermidades correlatas de plantas no Brasil ( ). Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. suplemento, p. 1-92, LAMBAIS, M.R. Biologia molecular e engenharia genética na Fitopatologia. In: BERGAMIN FILHO, A.; KIMATI, H.; AMORIM, L. (Ed). Manual de Fitopatologia. São Paulo: Ceres, p

5 A, J. A. A.; LIMA, R. C. A.; GONÇALVES, M. F. B.; SITTOLIN, I. M. Biological and serological characteristics of a genetically different cowpea severe mosaic virus strain. Virus Reviews & Research, São Paulo, v. 3, n. 1/2, p.57-65, LÓPEZ-MOYA, CUBERO, J.; LÓPEZ-ABELLA, D.; DIAZ-RUÍZ, J. R. Detection of cauliflower mosaic virus (CaMV) in single aphids by the polymerase chain reaction (PCR). Journal of Virological Methods, v. 37, p , MATTHEWS, R.E.F. Plant Virology. San Diego: Academic Press, NOGUEIRA, M.S.R. Desenvolvimento de sondas moleculares, identificação de fontes de resistência e estudo da herança em caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp.) ao Cowpea severe mosaic virus e Cowpea aphid-borne mosaic vírus f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia Vegetal) - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. NOGUEIRA, M.S.R.; FREIRE FILHO, F. R.; BRIOSO, P.S.T.. Diferenciação molecular entre os sorotipos I e II do Cowpea severe mosaic virus (CPSMV), através de RT-PCR. Summa Phytopathologica, Araras, v. 29, p.73-73, NOGUEIRA, M. S. R.; FREIRE FILHO, F.R.; BRIOSO, P.S.T. Avaliação de linhagens de caupi ao Cowpea severe mosaic virus para a produção de grãos secos no Estado do Rio de Janeiro. In: CONGRESSO NACIONAL DE MELHORAMENTO DE PLANTAS, 3., Anais...Gramado: SBMP, CD-ROM. PASSOS, M.M. Fonte de Resistência, Diferenciação Biológica e Identificação Molecular de Sorotipos virais, e competição de genótipos de caupi no Estado do Rio de Janeiro. Seropédica: UFRRJ, p. Dissertação de Mestrado. SANTOS, F.M.L.; LIMA, J.A.A., SANTOS, A.A. & BARRETO, P.D. Infecções simples e múltiplas de vírus em caupi no Ceará. Fitopatologia Brasileira, Fortaleza, v.24, n.4, p , 1999.