ELISA INDIRETO PARA BRUCELOSE BOVINA UTILIZANDO VACINA B19 E EPS COMO ANTÍGENOS

Transcrição

1 ELISA INDIRETO PARA BRUCELOSE BOVINA UTILIZANDO VACINA B19 E EPS COMO ANTÍGENOS INDIRECT ELISA FOR BOVINE BRUCELLOSIS VACCINE USING B19 and EPS AS ANTIGENS Resumo Pollyanna Mafra Soares (1) João Helder Frederico de Faria Naves (2) Mariana Assunção de Souza (1) Dayane Olímpia Gomes (3) Laís Miguel Rezende (3) Anna Monteiro Correia Lima (4) Objetivou-se avaliar a resposta imune humoral de bovinos naturalmente infectados e recémvacinados com a vacina B19 frente aos antígenos EPS e vacina B19 no teste de ELISA indireto (ielisa). Foram utilizadas 96 amostras de soro sanguíneo, sororreagentes aos testes de AAT e 2-ME e de bovinos não reagentes a estes testes. Para padronização do ELISA indireto foram sensibilizadas com três concentrações diferentes de EPS, sendo 5 µg/ml, 10 µg/ml e 15 µg/ml, e as outras duas foram sensibilizadas com três diluições diferentes da vacina B19, sendo 1:100, 1:500 e 1:1000. O ielisa com antígeno vacina B19 não conseguiu detectar animais recém-vacinados e naturalmente infectados, apresentando uma baixa concordância, já com o antígeno EPS apresentou excelente concordância com ao teste padrão.além disso, o ielisa com o antígeno EPS, foi capaz de diferenciar os animais recém-vacinados de naturalmente infectados, tornando o EPS potencial antígeno. Palavra chaves: Brucella sp. Extrato proteico solúvel. Ensaio imunoenzimático. Abstract The objective was to evaluate the humoral immune response of naturally infected cattle and newly vaccinated with the vaccine front of the B19 and B19 vaccine antigens EPS in indirect ELISA (ielisa). 96 serum samples, tests seropositive for AAT and 2-ME and bovine nonreactive these tests were used. To standardize the indirect ELISA were coated with three different concentrations of EPS, with 5 / ml, 10 ug / ml and 15 ug / ml, and the other two were coated with three different dilutions of B19 vaccine, and 1: 100, 1 : 500 and 1: The ielisa with B19 antigen vaccine failed to detect newly vaccinated and naturally infected animals, with a low agreement, as with the EPS antigen showed excellent agreement with the test padrão. Além addition, ielisa with the EPS antigen, was able to differentiate freshly vaccinated from naturally infected animals, making the potential EPS antigen. ¹ Doutoranda em Ciências Veterinárias da FAMEV/UFU²Doutor em Ciências animal da UFMG ³ Mestranda em Ciências Veterinárias da FAMEV/UFU 4 Coordenadora do Laboratório de doenças infecto- contagiosas da UFU contato: dayanevet@yahoo.com.br

2 Keys-word: Brucella sp.. Soluble protein extract. Immunoassays. 1 Introdução A brucelose é uma doença infecto-contagiosa provocada por bactérias do gênero Brucella. Produz infecção característica nos animais, podendo infectar o homem. Sendo uma zoonose de distribuição mundial, acarreta problemas sanitários importantes e prejuízos econômicos vultuosos (BRASIL, 2006). O programa brasileiro de controle erradicação de brucelose e tuberculose prevê o uso sequencial dos testes Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) como teste de triagem, sendo os soros com resultado positivo submetidos a confirmação, que pode ser realizada pela combinação da prova de soroaglutinação lenta com a prova do 2-mercaptoetanol ou então pela reação de fixação de complemento (MATHIAS; MEIRELLES, BUCHALA, 2007) Nenhum desses testes consegue diferenciar animais vacinados entre 3 e 8 meses de idade e com menos de 24 meses de animal naturalmente infectado, pois, por ser uma amostra lisa de Brucella abortus, a vacina B19 induz a formação de alto título de anticorpos específicos contra o polissacarídeo O do LPS, que interfere no teste sorológico diagnóstico da doença (LETESSON et al., 1997; BRASIL, 2006). O ELISA indireto (ielisa) é um dos testes recomendados para comércio internacional pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 2009), embora não seja encontrado facilmente no comércio brasileiro. Objetivou-se neste estudo padronizar 2 testes de ELISA indireto, utilizando-se como antígenos a vacina B19 e o Extrato Proteico Solúvel (EPS), para diferenciar bovinos naturalmente infectados e recém-vacinados com a vacina B19. 2 Material e Métodos Foram utilizadas 96 amostras de soro sanguíneo de bovinos, cedidas pelo Laboratório de Doenças Infectocontagiosas da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia (LADOC-UFU), Laboratório Nacional Agropecuário de Minas Gerais (LANAGRO-MG/MAPA) e Instituto de Pesquisas Veterinárias Desidério Finamor (IPVDF- RS). Estas foram previamente testadas em testes diagnósticos de triagem Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e confirmatório 2-Mercaptoetanol (2-ME), conforme Brasil (2006).

3 Dessas amostras, 32 eram provenientes de bovinos não reagentes a brucelose, 32 eram de bovinos naturalmente infectados sororreagentes aos testes de AAT e 2-ME, e 32 de bezerras recém-vacinadas e sororreagentes nos testes de AAT e 2-ME. Os antígenos utilizados para os testes de ELISA indireto foram vacina Brucelina B19 (Amostra lisa da cepa B19 de Brucella abortus) e Extrato Proteico Solúvel (EPS) extraído a partir da vacina. Realizou-se a padronização e validação do ELISA indireto. Para padronização do ELISA indireto foram utilizadas quatro placas de microtitulação de poliestireno (MaxiSorp, Nunc), duas delas foram sensibilizadas com três concentrações diferentes de EPS, sendo 5 µg/ml, 10 µg/ml e 15 µg/ml, e as outras duas foram sensibilizadas com três diluições diferentes da vacina B19, sendo 1:100, 1:500 e 1:1000. O teste de ELISA indireto foi padronizado de acordo com Wright et al. (1993) e Madruga; Araújo; Soares (2001). As concentrações e diluições ideais obtidas padronização foram as que apresentaram a maior diferença em densidade óptica (DO) entre amostras de soro positivas e negativas, e vacinais e negativas, e estas foram utilizadas no teste de validação. O protocolo seguido para a padronização e validação dos testes de ELISA indireto foi de acordo com o utilizados por Soares (2013). O ponto de corte (cut-off) dos testes de validação foi calculado pela média da densidade óptica dos controles negativos previamente testados em duplicata somadas a três vezes o desvio padrão desses valores (MADRUGA; ARAÚJO; SOARES, 2001); e os resultados foram expressos em índice ELISA (IE), calculado como: IE = DOamostra / DOcut off, onde as amostras que apresentaram valores de IE > 1,2 foram consideradas positivas.para determinar a concordância entre os testes realizados e o teste padrão, calculou-se também o índice Kappa, segundo interpretação de Rosner (2006), utilizando o programa Bioestat 5.0 (AYRES et al., 2007). 3 Resultados e Discussão No teste de padronização do ELISA indireto as diluições e concentrações de antígenos, anticorpos primários e secundários que melhor conseguiram diferenciar resposta entre as amostras positivas e negativas, vacinais e negativas, foram a diluição 1:100.Do antígeno vacina B19 e concentração 10 µg/ml do antígeno EPS, e diluições de anticorpos primários e secundários de 1:100 e 1:5000, respectivamente, estes protocolos para diferentes antígenos foram aplicados na validação.

4 Na validação, o cut off obtido para a placa sensibilizada com EPS foi de 0,322, já o obtido para a placa sensibilizada com vacina B19 foi de 0,300. As amostras consideradas positivas foram as que obtiveram índice ELISA (IE) >1,2. A partir dos índice ELISA, analisando a sensibilidade e a especificidade dos ELISAs indiretos para diferentes antígenos, bem como a concordância desses testes comparando com o teste padrão 2-ME, pode-se observar que o teste de ELISA indireto com o antígeno vacina B19 para amostras de animais recém-vacinados apresentou uma concordância fraca com o teste padrão de 54,69% e índice de kappa de 0,0938, e sensibilidade e especificidade de 9,38% e 100,00%, respectivamente. Para animais naturalmente infectados, a concordância observada também foi fraca, sendo de 56,25%, com o índice de kappa de 0,125, e sensibilidade e especificidade de 12,50% e 100,00%. O teste ELISA indireto com antígeno vacina B19 não foi capaz de diferenciar fêmeas bovinas recém-vacinadas contra brucelose (vacina B19) de bovinos naturalmente infectados, isso ocorreu, porque esse teste não conseguiu detectar animais naturalmente infectados, por esse motivo, apresentou uma baixa sensibilidade e concordância em relação ao teste 2-ME, que detecta como positivos animais recém-vacinados e naturalmente infectados, não conseguindo fazer a diferenciação entre eles. Ao analisar o teste ELISA indireto com o antígeno EPS, pode-se observar que ele foi capaz de diferenciar animais naturalmente infectados de recém-vacinados. Tal fato pode ser visto de acordo com os valores de sensibilidade, especificidade e concordância. O ELISA indireto com antígeno EPS para bovinos naturalmente infectados apresentou concordância excelente (93,75%) com o teste padrão (2-ME), com alta sensibilidade (87,50%) e alta especificidade (100%), já que foi capaz de detectar grande parte dos animais positivos detectados no teste 2-ME. Já para animais recém-vacinados, este teste, quando comparado ao teste padrão, apresentou fraca concordância (53,13%), bem como baixa sensibilidade (6,25),apresentando desta forma uma baixa concordância com o teste de ELISA com antígeno EPS para animais recém-vacinados. Para ser um bom teste diagnóstico, ele deve ter alta sensibilidade e especificidade, ou seja, capaz de detectar verdadeiros positivos e verdadeiros negativos, segundo Thrusfield (2004). Neste estudo, o teste de ELISA indireto com antígeno vacina B19 quando comparado com o padrão (2-ME), não apresentou requisitos para ser um bom teste, pois não conseguiu detectar animais naturalmente infectados e recém-vacinados, apresentando uma baixa concordância com o teste 2-ME, além de baixa sensibilidade. Em contrapartida o ELISA

5 indireto com o antígeno EPS mostrou ser uma excelente ferramenta para um futuro diagnóstico, uma vez que este apresentou altos valores de sensibilidade e especificidade e uma excelente concordância com o teste padrão (2-ME). 4 Conclusão O ELISA indireto com o antígeno EPS, quando comparado ao testes ELISA indireto com o antígeno vacina B19 e 2-ME, foi capaz de diferenciar os animais recém-vacinados dos animais naturalmente infectados, demonstrando o potencial do EPS como antígeno para diagnóstico da brucelose bovina. Referências AYRES, M.; et al. BIOESTAT Aplicações estatísticas nas áreas das ciências biomédicas. ONG Mamiraua. Belém, PA, BRASIL, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Departamento de Defesa Animal. Manual Técnico do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose PNCEBT: legislação. Brasília, DF:188p., LETESSON, J. J.; et al. Humoral immune responses of Brucella-infected cattle, sheep, and goats to eight purified recombinant Brucella proteins in an indirect enzyme-linked immunosorbent assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Namur, v. 4, n. 5, p , MADRUGA, C. R.; ARAÚJO, F. R., SOARES, C. O.. Imunodiagnóstico em medicina veterinária. Campo Grande: Editora Embrapa Gado de Corte, 2001, 360p. MATHIAS L. A.; MEIRELLES R. B.; BUCHALA F.. Estabilidade do antígeno de célula total de Brucella abortus para uso no diagnóstico sorológico da brucelose bovina pela reação de fixação de complemento. Pesquisa Veterinária Brasileira, Jaboticabal, v. 27, n.1, p , SOARES, P. M. Produção e Utilização de Anticorpos IgY para Diagnóstico de Brucelose. Uberlândia, 2013, p Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias. ROSNER, B.. Fundamentals of Biostatistics. 6 ed. Boston: Duxbury Press, THRUSFIELD, M.. Testes de diagnósticos. Em: Epidemiologia veterinária. 2.ed. p Editora Roca. São Paulo, São Paulo, WHO. World organization for animal health. Bovine Brucelosis. Em: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees), v. 2 (Chapter 2.4.3), p. 15, 2009.