INVESTIGAÇÃO DE Brucella abortus NO SÊMEN E ANTICORPOS ANTI- Brucella spp. NO SORO DE GARANHÕES

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1 INVESTIGAÇÃO DE Brucella abortus NO SÊMEN E ANTICORPOS ANTI- Brucella spp. NO SORO DE GARANHÕES INVESTIGATION OF Brucella abortus IN SEMEN AND ANTIBODIES ANTI- Brucella spp. IN SERUM OF STALLIONS Resumo Kamila Pinheiro Paim 1(1) Mayara Mafra Soares (2) Paula Caroline Pereira (3) Danilo Guedes Junqueira Júnior (4) Mariana Assunção de Sousa (5) Rafael Quirino Moreira (6) Anna Monteiro Correia Lima (7) Este estudo teve por objetivo investigar a presença da Brucella abortus no sêmen de oito garanhões criados em haras do Município de Uberlândia MG, e de anticorpos anti- Brucella spp. no soro sanguíneo dos mesmos animais. Foram empregadas as técnicas de Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) no soro sanguíneo, e a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) no sêmen. Das oito amostras testadas pela técnica de AAT nenhum animal foi reagente, e das oito amostras submetidas à PCR, em nenhuma amplificou-se os fragmentos de DNA de Brucella abortus. Pode-se concluir que os resultados encontrados reforçam a hipótese que a coabitação com bovinos seja o principal fator de risco para a ocorrência da brucelose em equinos, e infere-se a possibilidade da Brucella abortus não ter predileção pelo sistema reprodutivo de garanhões. Palavras-chave: Brucelose. Equino. PCR. AAT. Abstract The aim of this research was to investigate the presence of Brucella abortus in the semen of stallions from stables municipality of Uberlândia, and antibodies to Brucella spp. blood serum of the same animals. It was apllied the Techniques Buffered Acidified antigen (TAA) in blood serum, and the Polymerase Chain Reaction (PCR) were used in semen. Of the eight samples tested by AAT no animal was positive, and eight samples submitted to PCR, none were found Brucella abortus DNA fragments. It can be concluded that the results support the hypothesis that the cohabitation with cattle is the main risk factor for the occurrence of brucellosis in 1 1,2 Graduandas em Medicina Veterinária pela FAMEV/UFU. 3 Médica Veterinária autônoma formada pela FAMEV/UFU. 4,5,6 Doutorandos em Ciências Veterinárias em Ciências Veterinárias FAMEV/UFU. 7 Doutora em Engenharia Agrícola pela Universidade Estadual de Campinas, Professor Associado I na Universidade Federal de Uberlândia. de contato: beletim@yahoo.com.br Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 7, Número especial.

2 horses, and infers the possibility of Brucella abortus have no predilection for stallion s reproductive system. Keywords: Brucelosis. Equine. PCR. AAT. 1 Introdução Uma das espécies mais importantes na agropecuária brasileira são os equinos, animais são utilizados como meio de transporte, tração, lazer, esporte, equoterapia e até na alimentação humana (RIBEIRO et al., 2008). Essa espécie pode sofrer infecção pela Brucella abortus, bactéria causadora de doença com caráter zoonótico e distribuição cosmopolita. Existem poucas pesquisas com brucelose equina no Brasil, os dados epidemiológicos disponíveis são escassos, tornando limitado o conhecimento do papel do equino na epidemiologia da doença (ACHA e SZYFRES, 2003, ARAUJO et al., 2009). A inseminação artificial em equinos vem crescendo, pois com ela foi possível uma maior distribuição da genética de animais de alta qualidade, além de ser uma técnica de baixo custo. E buscando-se índices de fertilidade próximos à da monta natural, tem-se utilizado com frequência sêmen fresco ou resfriado (CARDOSO, 2010), o que aumenta o risco de transmissão de patógenos que tem o sêmen como via de eliminação. Este trabalho teve por objetivo identificar a soroprevalência de brucelose em garanhões criados em haras do Município de Uberlândia, e investigação da presença da Brucella abortus no sêmen desses animais pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). 2 Material e Métodos Colheu-se amostras de sêmen e soro sanguíneo de oito garanhões de haras do Município de Uberlândia, MG. As amostras de sangue foram coletadas por meio da venopunção da veia jugular em tubos sem anticoagulante, posteriormente centrifugados a 500 G para separação do soro, os quais foram armazenados a -20 C. O sêmen foi coletado com vagina artificial do tipo Missouri utilizando-se uma égua no cio para estimulação do garanhão. Após a coleta, 2 ml do sêmen de cada animal foi armazenado a -80 C. Como não existe um exame padrão a ser aplicado para diagnóstico de brucelose na espécie equina, optou-se por adotar o teste de triagem preconizado pelo Ministério da Agricultura brasileiro no Programa Nacional de Combate e Erradicação da Brucelose e Tuberculose, o exame do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) (BRASIL, 2006; ARAÚJO et al., 2009).

3 Nas amostras de sêmen foram aplicadas técnicas de Extração de DNA conforme relatado por Biase et al. (2002), seguido da amplificação do DNA de Brucella abortus, e finalmente a análise do produto amplificado. Buscando identificar o DNA desta bactéria, procurou-se amplificar um fragmento de 223 pb, a partir do par de primers B4 (5 - TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3 ) e B5 (5ʼ-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG -3 ) (BAILY et al., 1992). Para amplificação dos fragmentos foi utilizado o seguinte protocolo de PCR para cada amostra: Tampão 10x (20 mm Tris-HCl em ph 8.0, 40 Mm NaCl, 2 mm Fosfato de Sódio, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 50% glicerol (v/v)] 2µL; Taq DNA polimerase 5U/µL 0,2µL (Invitrogen ); 5,0 pmol de cada primer (Invitrogen ) 1µL; dntps 10mM 0,4 µl [dctp, datp, dgtp, dttp] (Anresco ); Água pura estéril 9,6 µl, 6 µl de DNA genômico estoque, 20 µl para cada reação. O processo de amplificação foi conduzido em um termociclador SelectCycler (Select BioProducts) programado para realizar uma desnaturação inicial a 94 C por 5 minutos e, ao final, uma extensão a 72ºC por 10 minutos. Foram empregados 40 ciclos, divididos em três fases: desnaturação a 94 C por 60 segundos, hibridização a 60 C por 60 segundos e extensão a 72 C por 60 segundos. Como controle positivo da Brucella abortus foi utilizado o DNA desta bactéria extraído da vacina B19. A análise do produto amplificado foi feita por meio do gel de agarose com a técnica de eletroforese em cuba horizontal com tampão de corrida adicionando o corante SYBR Safe. O gel foi analisado sob luz UV em fotodocumentor Alpha Digi Doc (Alpha Innotech) (SAMBROOK e FRITSCH, 1989). 3 Resultados e Discussão Nenhuma das amostras de soro dos oito animais foi reagente ao AAT, e em nenhuma amostra de sêmen testadas na PCR detectou-se Brucella abortus (figura 1). O mecanismo de transmissão da brucelose equina ainda não está bem esclarecido, por isso considera-se que a infecção seja resultante da coabitação dos equinos com outras espécies domésticas, principalmente bovinos, bubalinos e suínos (ACHA e SZYFRES, 2003). Hipótese essa reforçada pelos estudos de Aguiar et al. (2008) em Rondônia, e Araujo et al. (2009) na Zona da Mata Mineira, os quais encontraram, respectivamente, 7 e 39 equinos que coabitavam com bovinos positivos na prova de AAT.

4 Carraza et al. (2009) analisando 120 amostras de equinos de tração na área urbana de Uberlândia, portanto de animais com pouca probabilidade de convívio com bovinos, não encontrou nenhum animail sororreagente. Entretanto, na microrregião do Brejo Paraibano foram coletadas 257 amostras e nenhum animal foi reagente a prova do AAT. Destes 84,4% dos animais eram criados consorciamente com bovinos (OLIVEIRA FILHO, 2013). Figura 1 Gel de agarose para análise do produto amplificado, Uberlândia, *Na sequência foram colocados marcador (M), controle positivo extraido de vacina B19 (+); controle positivo de cepa de campo (+C); controle negativo (-); água miliq controle negativo (-A); e amostras 1,2,3,4,5,6,7,8. Furquim et al. (2012) coletaram 107 amostras de soro sanguíneo em um frigorífico do Município de Araguari e cinco animais foram reativos no teste confirmatório do 2- mercaptoetanol. Junqueira Júnior (2012) analisou amostras de equídeos de serviço de todas as mesorregiões do estado de Minas Gerais e encontrou uma prevalência de animais de 2,39% no estado, e para a região do Triângulo Mineiro e Alto Paranaiba 1,17%. Pode-se verificar que os dados da literatura não são conclusivos sobre os mecanismos de transmissão da brucelose em equinos. Todavia espera-se uma prevalência maior em equinos que convivam com bovinos, visto que estudos soroepidemiológicos também constataram a maior prevalência de brucelose em equinos criados juntamente com bovinos. Os animais utilizados para a coleta de amostras nesta pesquisa eram criados em haras, ou seja, não tinham contato com nenhuma das espécies que se considera transmissoras da brucelose, o que pode justificar a não reação de nenhum dos soros ao AAT, e a não amplificação de fragmentos de DNA de Brucella abortus em nehuma das amostras de sêmen. 4 Conclusão Nenhum animal apresentou reação positiva em qualquer uma das técnicas utilizadas. Os resultados encontrados reforçam a hipótese que a coabitação com bovinos seja o principal fator de risco para a ocorrência da brucelose em equinos, haja vista que os animais estudados

5 não o tinham. Pode-se ainda inferir que a bactéria não tenha predileção pelo sistema reprodutivo de garanhões. Referências ACHA, P.N.; SZYFRES, B. Zoonosis y enfermidades transmisibles comunes al hombre y a los animales. 3.ed. Washington: Organización Panamericana de la Salud, p AGUIAR, D.M.; CAVALCANTE, G.T.; LARA, M.C.C.S.H.; VILLALOBOS, E.M.C.; CUNHA, E.M.S.; OKUDA,L.H.; STÉFANO, E.; NASSAR, A.F.C.; SOUZA, G.O.; VASCONCELLOS, S.A.; LABRUNA, M.B.; CAMARGO,L.M.A.; GENNARI,S.M. Prevalência de anticorpos contra agentes virais e bacterianos em equídeos do município de Monte Negro, Rondônia, Amazônia Ocidental Brasileira. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science. São Paulo, v. 45, n. 4, p , ARAÚJO, R.R.; PENA, L.J.; PENA, D.A.; DIAS, F.M.; MORAES, M.P. Ocorrência de anticorpos anti-brucella spp. em equídeos da região da zona da mata do estado de Minas Gerais, Brasil. Arquivo do Instituto Biológico, São Paulo, v.7, p , out. /dez BAILY, G.G.; KRAHN, J.B.; DRASAR, B.S.; STOKER, N.G. Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification. Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 95: , BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Departamento de Defesa Animal. Manual Técnico do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose PNCEBT: legislação. Brasília, BIASE, F. H.; FRANCO, M. M.; GOULART, L. R.; ANTUNES, R. C. Protocol for extraction of genomic DNA from swine solid tissues. Genetics and Molecular Biology, v.25, n.3, p , CARDOSO, A.M. Inseminação Artificial em Éguas. Trabalho de Conclusão de Curso Faculdades Metropolitanas Unidas FMU, 2010 CARRAZA, L. G.; JUNQUEIRA, Y. F.; CARRAZA, T. G.; OLIVEIRA, P. R.; LIMA- RIBEIRO, A. M. C. Soroepidemiologia da brucelose em equinos de tração em áreas urbanas no município de Uberlândia- MG. Horizonte Científico, Uberlândia, v. 4, n. 2, FURQUIM, M.E.C.; SOUZA, M.A.; MAGALHÃES, L.F.; WILSON, T.M.; LIMA, A.M.C. Investigação da brucelose em equídeos abatidos em frigorífico exportador. Veterinária Notícias, Uberlândia, v.18. n. 2 (supl.), p , jul-dez In: IX Mostra da Pós- Graduação em Ciências Veterinárias e Apresentação de Trabalhos Científicos da FAMEV UFU. JUNQUEIRA JÚNIOR, D.G. Soroprevalência da brucelose em equídeos de serviço em Minas Gerais, f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2012.

6 OLIVEIRA FILHO, A.G.F; FREITAS, T.D; CLEMENTINO, J; ALVES, C.J.; SANTOS, F.A. Prevalência da infecção por Brucella spp. em equídeos na microrregião do Brejo Paraibano. Veterinária e Zootecnia. Salvador-Bahia, v.20, n.4, p , dez RIBEIRO, M.G.; MOTTA, R.G.; ALMEIDA, C.A.S. Brucelose equina: aspectos da doença no Brasil. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.32, p.83-92, SAMBROOK, J.; FRITSCH, T. Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Library Press, vol. 3, p , 1989.