Monitoria Sorológica em Matrizes de Corte e Postura Comercial

Transcrição

1 Monitoria Sorológica em Matrizes de Corte e Postura Comercial Obiratã Rodrigues Méd Vét. MSc MercoLab Garibaldi bira@mercolab.com.br Porto Alegre, 22 de novembro de 2016.

2 Conhecer para Diagnosticar Etiologia Distribuição Patogênese Epidemiologia Sinais clínicos Lesões Diagnóstico Controle Tratamento Prevenção

3 Diagnóstico - Introdução A expressão de qualquer doença depende: Virulência do organismo envolvido; Nível de exposição ao agente; Susceptibilidade do hospedeiro;

4 Diagnóstico - Introdução Tempo/Rapidez; Segurança/confiabilidade; Representabilidade e Reprodutibilidade

5 Diagnóstico - Introdução

6 Conhecer para Diagnosticar Início dos sinais: Buscar o agente: Isolamento PCR Duas semanas após: Buscar Anticorpos ELISA

7 Coleta de amostras: Conhecimento teórico das enfermidades Histórico do lote Achados de necropsia Conhecimento epidemiológico/região Monitorias Vacinações Disponibilidade de diagnóstico Capacidade de interpretação

8 Objetivo das provas sorológicas Detectar infecção no plantel Avaliar imunidade maternal Desenhar e comparar programas vacinais Comparar dif.vacinas no mesmo programa Avaliar imunocompetência da ave Avaliar biosseguridade, desinfecção (desafios) Satisfazer requisitos para venda/exportação Identificar formas subclínicas Estabelecer perfil sorológico

9 Exames sorológicos As amostras destinadas ao diagnóstico sorológico deverão estar resfriadas a 4 º C Não serão aceitas amostras de sangue total, com presença de coágulo ou evidências de contaminação As amostras deverão ser, obrigatoriamente, divididas em duas alíquotas e identificadas, uma como prova e outra como contra-prova. PORTARIA 126, DE 03 DE NOVEMBRO DE 1995, DOU 06/11/1995

10 Exames sorológicos amostras destinadas ao exame sorológico deverão ser mantidas a temperatura de 4 C por não mais que 48 horas, até serem processadas. a contra-prova do diagnóstico sorológico deverão ser mantidas em temperatura de 20º C, por um período de 30 (trinta) dias. PORTARIA 126, DE 03 DE NOVEMBRO DE 1995, DOU 06/11/1995

11 Provas Sorológicas Soros armazenagem: Refrigeração: até 3 dias Congelamento: maior que 4 dias ; Turbidez = gordura ou contaminação bacteriana

12 Determinação do número de amostras sorológicas a serem coletadas confiabilidade 95% Tamanho da população ou lote Níveis de prevalência da enfermidade na população/lote 50% 25% 15% 10% 5% 1% INDICAÇÃO MÍNIMO 15-20, IDEAL 23 Oficial 300/150

13 Colab. Dr. Luciano Doreto

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19 Diagnóstico Sorológico - Vigilância epidemiológica de doenças com importância sanitária estratégica (PNSA); - Monitoria de programas (Status) sanitários; - Certificação de propriedades ou áreas livres; - Comercialização de animais reprodutores; - Identificação e caracterização de surtos.

20 Principais Análises Sorológicas SAR IgM e altos níveis de IgG Reações inespecíficas ELISA Equipamento Kits importados HI Trabalhoso Antígeno-produção própria Análises complementares

21 INDIRETOS Anticorpos Inibição da hemaglutinação (HI) Soro Aglutinação Rápida Soro-neutralização (SN), ELISA

22 Sorologia: sensibilidade

23 SAR: soroaglutinação rápida em placas Detecta anticorpos no início da infecção SAR IgM e altos níveis de IgG Comum falsos positivos Inespecificidade (inativação) Teste rápido, simples e barato Teste de Triagem Pode ser utilizado no campo (pulorose)

24 Limitações Quantidade de anticorpos Qualidade do antígeno Dificuldade aquisição antígenos Reações inespecífica Inativação e diluição

25 SAR: MG, MS e Pulorose

26 SAR: resultados Soro bruto/diluições: 1:10 (1:4) MAPA Pulorose reação cruzada com SE Resultado qualitativo (+/-) Positivo/Negativo (5/20, 0/20)

27 HI: inibição da hemaglutinação Detecta IgG- não detecta baixos níveis de IgG Técnica trabalhosa Sangue de aves SPF Alta especificidade Custo relativamente barato Dificuldade na obtenção de antígeno Teste confirmatório

28 HI: inibição da hemaglutinação Vírus hemaglutinantes: DNC IA EDS Bactérias hemaglutinantes: MG MS MM Coriza

29 Positivo Negativo Fonte: Abase

30 Controle Negativo Controle Positivo (1:80) Amostra 1 (1:320) Amostra 2 (1:20) Amostra 3 (Neg) Amostra 4 (1:40) Controle Antígeno Controle Hemácias 2012

31 HI GMT Resultado MG/MS DNC EDS Negativo < 1:40 < 1:8 < 1:8 Suspeito 1:40 1:8 1:8 Positivo >1:80 > 1:16 > 1:16

32 ELISA ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY - Sorologia - Detecção de anticorpos : IgG - Infecção

33 Principais enfermidades aviarias monitoradas por - IBD/ IBDxr - IBV - NDV - Reo - AE - Mg - Ms - PM - ORT - AI - Rev - ALV-J - LLAb Elisa Indireto Elisa CAV Elisa Competitivo

34 Elisa Indireto ou Leitora ELISA Densidade Óptica ( OD ) Razão S/P = OD amostra - CNx CPx - CNx Título

35 Cut-off Nota de corte : Ponto a partir do qual se distingue o positivo do negativo

36 Grupos de títulos G Título G Título G Título >

37 Regras para obtenção de resultados consistentes Escolha do laboratório Escolha do método Boas práticas de laboratório Colheita de amostras

38 Colheita de amostras Idade 2-3 sem após vac.viva 4-6 sem após vac. inativada amostragem : amostras frango de corte amostras de reprodutoras manejo do sangue/soro

39 Amostragem randômica Sistemático Galpão : 30 aves Colher 15 aves por diagonal. x x Se a diagonal tiver 15 m, colher 1 ave a cada m. x x x x x x Bateria ou box: numere cada box e sorteie as baterias ou box que serão amostrados. X- Tome amostra aqui

40 Amostras e amostragem Qualidade da amostra: impacto no resultado Evitar amostras: muito hemolizadas muito lipêmicas contaminadas (turvo, mal cheiro) Recomendação: 1 - Colher o sangue e separar o soro dentro de 24 horas 2- Evitar que o soro fique por mais de 3 dias na geladeira 3- Congelar o soro a -20C 4- Evitar congelamento-descongelamento (máximo 3-5 ciclos) 5- Pintinhos saudáveis e com mais de g

41 Estabelecer Objetivo Análise Comparativa Interpretação Estratégia

42 No. de animais Coeficiente de variação considerando-se o mesmo GMT Título de Elisa Fonte: Dra. Beatriz Cardoso, Amevea 2000 Amarelo (alto CV%): pintinho proveniente de matriz jovem ou de vários lotes Azul (alto CV%): Pintinho proveniente de vários lotes. No abate, pode ser desafio ou má vacinação. Vermelho (baixo CV%): boa uniformidade para anticorpos maternais

43 Anticorpo materno: IBD, IBV, NDV, REO e AE GMT>2000; CV40% Idade Resultado Obs 1-3 dia T CV Matriz baixa resposta T CV Matriz joven Origem? Matriz problema T CV idem T CV Matriz excelente resposta

44 Baseline esperado no abate quando se utiliza somente vacina viva Doença Titulo (GMT) IBD NDV 500 IBV 500 Dados Dr. J. Witt, Instituto Deventer, Holanda

45 Análise do coeficiente de variação Resultado Obs T CV Nao desafiado T CV Infecção recente T CV Infecção precoce

46 Cuidado com interpretação de CV% em lotes com GMT baixo

47 Cuidado com interpretação de CV% em lotes com GMT baixo GMT baixo, CV% alto não indica infecção Count : 15 Mean : 640 Gmean: 408 %CV : 80%

48 Infecção recente (aguda) Count : 15 Mean : 2780 Gmean: 1255 CV : 115% Count : 15 Mean : 4625 Gmean: 2544 CV% : 95.5%

49 Infecção Crônica Count : 15 Mean : 5428 Gmean: 4575 CV : 41% Count : 15 Mean : 7137 Gmean: 6525 CV : 25%

50 Count ANEMIA-CAV Titer Groups Count: 10 Mean: 7096 GMean: 6769 SD: 1983 %CV: 27,9 Min: 3561 Max: 8661 Tech:DANI Date:3/11/09 Dil:1:100

51 Anemia - CAV100 Count Titer Groups Count: 20 Mean: 2965 GMean: 2010 SD: 2754 %CV: 92,9 Min: 999 Max: 8661 Tech:HUGO Date:12/11/09 Dil:1:100

52 Sorologia Matrizes

53 Programa de monitoria : Objetivo e frequência de colheita Anticorpos maternais: - Avaliação da imunidade passiva - Estimar de data de vacinação (Deventer) Monitoria de vacinação : - Avaliação da eficiência da equipe de vacinadores - Avaliação da manutenção imunidade ativa - Avaliação do programa de vacinação Detecção de desafio (análise comparativa / pareada)

54 Título de anticorpos Baseline em reprodutoras pesadas vacinadas com vacinas vivas e inativadas - Pontos críticos Idade em semanas

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57 O que é aumento de título? Considera-se que há um aumento significativo estatisticamente quando o título sobe em 2-3 Log = = = = = = = = = 2048

58 Recria - resposta de vacina viva desafio

59 25 semanas de idade- resposta da oleosa 21s 26s 28s

60 Controle em granjas com títulos acima de do esperado. Objetivo : 1. Diminuir a carga viral no galpão 2. Aumentar a imunidade das aves Estratégia 1. Higiene 2. Imunidade passiva: Anticorpos maternos 3. Imunidade ativa : Vacina adequada Número de doses adequadas Data de vacinação

61 Interpretação e estratégia de controle Lote Vacinado Título Alto Título Baixo Produção dentro do esperado Produção abaixo do esperado Produção dentro do esperado Infecção e Proteção Infecção, Desafio, Doença Lote saudável Biosseguranca! Isolar agente controle / biosseguranca

62 CONCLUSÕES Não existe um título padrão esperado universal. Cada empresa deve ter o seu baseline. Nem sempre é possível correlacionar título com proteção. Existem inúmeras variáveis envolvidas na resposta imune. A resposta humoral é uma delas.

63 O B R I G A D O! bira@mercolab.com.br