IMUNO HISTOQUÍMICA. A na M aria Anselmi Dorigan Ana Beatriz A. Agnesini Osmar Luís Silva

Transcrição

1 IMUNO HISTOQUÍMICA A na M aria Anselmi Dorigan Ana Beatriz A. Agnesini Osmar Luís Silva 2016

2

3 REALIZAÇÃO DE IMUNOHISTOQUÍMICA EXECUTANTE : Biomédicos e Técnicos de Laboratório. RESULTADO ESPERADO Lâminas de Imunohistoquímica bem coradas com marcação correta e sem background. PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO Imuno histoquímica ou IHQ é o processo de detecção da expressão de proteínas localizadas nas células dos tecidos utilizando o princípio antígeno/anticorpo. A Imuno histoquímica é largamente utilizada no diagnóstico e prognóstico do câncer. APLICAÇÕES DIAGNÓSTICAS Vários anticorpos são utilizados para o diagnóstico das mais específicas situações: Fatores Prognósticos de Câncer de Mama ( RE, RP, c erbb2/her2, p53, PCNA...) Perfil Hormonal em adenoma de hipófise Imunofenotipagem de linfomas e sarcomas Detecção de sítio primário de adenocarcinoma Caracterização de neoplasia indiferenciada Tumores de Células Germinativas Tumores de Pequenas Células Fatores prognóstico de câncer Detecção de agentes infecciosos GIST PREPARAÇÃO E MATERIAL NECESSÁRIO REAGENTES: Xilol Alcool absoluto Alcool 95% Alcool 80% H 2 Tampões de Recuperação Antigênica Tampões de Lavagem Peróxido de Hidrogênio 35% BSA 0,1 a 5% Anticorpo Primário Leite Molico desnatado Sistema de Detecção (Polímero e ABC) DAB

4 Hematoxilina Meio de Montagem MATERIAIS E EQUIPAMENTOS Navalha Micrótomo Estufa Lâmina Silanizada, Polilisina ou com Carga Banho Histológico Banho Maria Tubo tipo eppendorf 0,5ml e 1,5ml Bandejas de incubação Aspiramax Microondas ph metro Balança Analítica Placa Quente Centrífuga Taça de Coplin plástica Pipetas 0,5ul a 1000ul Caneta Pap Pen Timer PRINCIPAIS ATIVIDADES Desparafinização Recuperação Antigênica escolher o tampão adequado para o anticorpo Tampões de Recuperação Citrato ph 6,0 Tris EDTA ph 9,5 EDTA ph 8,5 DIVA Tampão Universal Biocare Tampão Dako

5 Método de Recuperação Banho Sorológico a 96 C por 40 minutos Steamer (panela de cozimento à vapor) por 40 minutos Microondas 10 minutos de fervura Panela de Pressão caseira após atingir a fervura com pressão contínua por 2 minutos Panela de Pressão elétrica digital Deckoaking Biocare Temperatura a 125 C pressão 21 pps 1 minuto e 30. Temperatura a 95 sem pressão 40 minutos Após a Recuperação Antigênica resfriar em temperatura ambiente 20 minutos Lavar em tampão PBS ph 7,6 em 3 banhos de 3 minutos cada Bloqueio da Peroxidase Endogena H 2 O 2 a 3% por 10 minutos (obs. Existem anticorpos em protocolo diferente prestar atenção). Lavar em PBS ph 7,6 2x Lavar em TBS ph 7,6 5 minutos Bloqueio da proteína Leite Molico a 3% por 10 minutos ou BSA a 2% por 5 minutos (dependendo do anticorpo pedido) Pode Omitir esta etapa. Incubar o anticorpo primário (o tempo depende da diluição utilizada: atualmente 1:30h a 2 horas) Lavar em TBST ph 7,6 3x Incubar no Kit Polímero EASYLINK One (Probe Mouse and Rabbit, p) 30 min. Lavar em TBST ph 7.6 3x Incubar com DAB por 6 minutos Lavar com H2 Contracorar com Hematoxilina de 20 segundos a 1 minuto Desidratar, Diafanizar e Montar

6 PREPARO DE REAGENTES E SOLUÇÕES TAMPÕES TAMPÕES DE RECUPERAÇÃO ANTIGÊNICA 1 SOLUÇÃO CONCENTRADA 10x TAMPÃO CITRATO ph 6,0 29,4 g Citrato de Sódio (PM 294,10) Ajustar o ph 6,0 com HCL 1M (pag. Reagentes item 1) ou PA. Acrescentar 500 ul de Tween 20 2 SOLUÇÃO CONCENTRADA 10x TAMPÃO TRIS EDTA ph 9,0 24,0 g TRIS (PM 121,1g) 2,0 g EDTA (PM 121,1 g) Ajustar o ph 9,0 com HCL 1M (pag. Reagentes item 1) ou P.A. Acrescentar 500ul de Tween 20 3 SOLUÇÃO USO TAMPÃO EDTA (Titriplex) ph 8,0 0,372 g EDTA (PM 372g) Ajustar o ph 8,0 com NaOH 1M (pag. Reagentes item 1). Acrescentar 50 ul de Tween 20 OBS.: Podem ser utilizados também tampões prontos para uso como: DIVA (BIOCARE) E S1699 (DAKO). TAMPÕES DE LAVAGEM 1 PBS 7,6 10x Concentrado Pronto para Uso 32,68 g 8,17 g NaCl 1,44 g 0,36 g Fosf. Sódio Mono 4,2 g 1,05 g Fosf. Sódio Dib. O Destilada O Destilada Obs.: Diluir 1 parte deste 10x Concentrado para 9 partes de H 2 O Ajustar o ph com NaOH 6N e está pronto para uso.

7 2 SOLUÇÃO CONCENTRADA 10X TAMPÃO TRIS SALINO (TBS) ph 7,6 80,0 g Cloreto de Sódio (NaCl) 6,05 Tris (Hydroxymethyl /Aminometano) (PM 121,1g) Ajustar o ph 7,6 com HCl 1M (pag. Reagentes item 1) ou P.A. Diluir para uso 1 ml 10x concentrado e 9 ml de H 2. 3 SOLUÇÃO CONCENTRADA 10X TAMPÃO TRIS SALINO TWEEN (TBST) ph 7,6 80,0 g Cloreto de Sódio (NaCl) 6,05 Tris (Hydroxymethyl /Aminometano) (PM 121,1g) 5 ml Tween 20 Ajustar o ph 7,6 com HCl 1M (pag. Reagentes item 1) ou P.A. Acrescentar 5 ml de Tween 20 marca Synth. Diluir para uso 1 ml 10x concentrado e 9 ml de H 2. 4 TRIS HCL ph 7,6 50 mm 6,06 g (PM 121,1g) Tris (Hydroxymethyl) / (PM 121,1g) Aminometano q.s.p. Ajustar o ph 7,6 com HCL 1M (pag. Reagentes item 1) ou P.A.

8 TAMPÕES DILUENTES 1 TAMPÃO DILUENTE TRIS HCl ph 7,6 6,06 g Tris (Hydroxymethyl /Aminometano) q.s.p 500 ul Tween 20 Ajustar o ph 7,6 com HCl 1M ou P.A. Após adicionar Tween TAMPÃO DILUENTE DE DAB Tris HCL ph 7,6 (item 3) Acrescentar 50ul de Tween 20 para cada 100ml de Tris HCL ph 7,6 3 BSA 1% Diluente Anticorpo Primario (0,05 em Tris HCL ph 7,6 com Tween 20) 100 ml Tris HCL ph 7,6 (item 3) 0,1g de BSA Sigma SOLUÇÕES DAB SOLUÇÃO ESTOQUE DAB (3,3 Diaminobenzidine) D 5637 Sigma 0,2 g DAB 20 ml Tampão Tris HCL ph 7,6 50 mm Procedimento : Agitar e centrifugar, separar o sobrenadante e congelar em alíquotas de 0,5 ml e 0,25 ml no freezer. SOLUÇÃO USO DAB Reagentes 6,0 ml de Tris HCl 7,6 250 ul de DAB (sol. Estoque) 2,0 ul de H2O2 Merck (puro) Acompanhar o progresso da reação. Ocorrerá no controle positivo o desenvolvimento de precipitado castanho dourado como produto final da reação.

9 CORANTES 1 HEMATOXILINA HARRIS 5 g Hematoxilina 50 ml Alcool Absoluto 100 g Sulfato de Alumínio e Potássio 1000 ml H2 2,5 g Óxido Vermelho de Hg Dissolver a hematoxilina no álcool absoluto. O alumínio de potássio na H2 quente. Deixar de um dia para outro. Ferver o Becker no microondas, colocar no erlemeyer para medir o volume correto e voltar para o Becker e esquentar novamente. Passar o volume do Becker para um balão de fundo chato com pérolas de vidro. Colocar para ferver no fogareiro. Repetir o processo várias vezes. Acrescentar a hematoxolina mais álcool absoluto, ferver novamente e repetir o processo várias vezes. Remover o balão do fogareiro e acrescentar o óxido de vermelho de mercúrio. Voltar o balão para o fogo e aquecer até a solução ficar de cor púrpura escura. Retirar imediatamente e esfriar rapidamente a solução colocando o balão dentro de um balde com água. 2 HEMATOXILINA MAYER 50 g Sulfato de Alumínio e Potássio 2 g Hematoxilina 0,2 g Iodato de Na 0,5 g Ácido Cítrico 50 g Cloral hidratado Dissolver o Sulfato de Alumínio e Potássio na água e depois acrescentar os outros sais.

10 REAGENTES 1 HCl 1 M 16,60 ml de HCl (1,19 densidade 37%) 183,4 ml H2 Cálculo: PM x Molaridade x Volume em litros 36,5 x 1 x 0,2 l = 7,3 g Fator de Correção para líquidos Densidade de HCl 1,19 37% 1,19 x 37 = 0,44 7,3 / 0,44 = 16,6 ml 2 NaOH 1 M 40gr de NaOh 1000mL de H 2 O Cálculo: PM x Molaridade x Volume em litros CUIDADOS DAB : Cuidado com descarte, deve se seguir corretamente o protocolo abaixo: TRATAMENTO DE RESÍDUOS DE DIAMINOBENZIDINA (DAB) 1 Prepare a seguinte solução estoque: Permanganato de Potássio 0,2M (31,6g/litro) Ácido Sulfúrico 2M (112mL ácido conc./litro) 2 Para cada 10mL de resíduo de DAB (0,9mg/mL) adicione: 5mL de solução de Permanganato de Potássio 0,2M 5mL de solução de Ácido Sulfúrico 2,0M 3 Deixe a solução em repouso por pelo menos 10h (ou overnight) 4 Adicione pequena quantidade de Ácido Ascórbico em pó (ou Bissulfito de Sódio ou outro agente redutor) até a descoloração da solução. 5 Neutralize a solução descolorida com Carbonato ou Bicarbonato de Sódio (ou alguma base) até ph ~ 7 6 Descarte na pia com bastante água.