-MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO - CINÉTICA DE MORTE MICROBIANA

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1 -MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO - CINÉTICA DE MORTE MICROBIANA

2 Definição de termos Esterilização: destruição ou eliminação total dos microorganismos. Sanitização: procedimento que envolve diferentes processos, visando obter o grau de higiene e limpeza adequados. Desinfecção: processo para eliminar os microorganismos patogênicos, sem necessariamente eliminar, todas as bactérias e esporos.

3 Definição de termos Anti-sepsia: desinfecção da pele, mucosas ou tecidos. Agentes biocidas: morte dos microrganismos. Agentes biostáticos: inibição do crescimento.

4 - Métodos de esterilização e desinfecção - Fatores que influenciam o crescimento microbiano Temperatura Tipo de microrganismo Fase de crescimento Ambiente

5 Maior resistência Menor resistência Resistência de microrganismos aos métodos de esterilização e desinfecção -Prions - endosporos de bactérias - mycobacterias - Gram negativos - Fungos - Vírus (sem envelope) - Gram positivos - Vírus com envelope lipídico

6 MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO - Significa a completa destruição de todos os organismos vivos e seus esporos ou sua completa remoção da preparação. - Processos físicos: métodos térmicos 1. Calor úmido (Vapor); 2. Calor seco; - Processos físicos: métodos não-térmicos 3. Filtração; 4. Radiação ionizante. - Processos químicos: 5. Esterilização por GASES.

7 - Métodos de esterilização e desinfecção Modos de ação Lesão dos ácidos nucleicos Desnaturação das proteínas Inibição do metabolismo Ruptura da membrana celular

8 CALOR ÚMIDO OU VAPOR (método físico) - Feita em autoclaves e emprega vapor sob pressão. - Método escolhido na maioria dos casos em que o produto é capaz de resistir a tal tratamento. - Mais rápido que calor seco (pois quando há presença de água, as bactérias são coaguladas e destruídas em Tº s mais baixas - desnaturação de proteína e quebra das pontes de H cinética morte microbiana) 10 libras de pressão (115ºC, por 30 ) (não inativa endosporos e alguns vírus) 15 libras de pressão (121ºC, por 20 ) 20 libras de pressão (125ºC, por 15 ) Quanto > pressão, mais elevada a Tº e < tempo de esterilização

9 VAPOR (método físico) Útil para esterilizar: soluções farmacêuticas em geral, frascos de vidro, compressas e instrumentos cirúrgicos. Não serve para esterilizar: preparações oleosas ou outras que não sejam penetradas por umidade e pós.

10 Monitoramento do ciclo Esterilização a vapor Mecânicos registros tempo, T C e pressão. Químicos fita teste e Teste Bowie-Dick. Biológicos Ampolas contendo esporos de Bacilos Stearothermophilus.

11 Indicadores Químicos Classe 1: Tiras impregnadas com tinta termo-química que muda de coloração quando exposto a temperatura. usados externamente em todos os pacotes evidenciam a passagem do material pelo processo

12 Classe 2: Teste de BOWIE & DICK - testa a eficácia do sistema de vácuo da autoclave pré-vácuo. verifica a eficiência da bomba de vácuo espera-se mudança uniforme da cor do papel, em toda sua extensão recomenda-se que seja feito no primeiro ciclo do dia ou pelo menos a cada 24 horas caso não haja homogeneidade na revelação, efetuar revisão imediata do equipamento Teste OK Falha no teste

13 VALIDAÇÃO DA ESTERILIZAÇÃO A VAPOR - Usa-se um indicador biológico (preparação constituída de microrganismos específicos e resistentes a determinado processo de esterilização). - Bacillus stearothermophilus (120ºC) - Bacillus subtilis (110ºC)

14 Indicadores Biológicos - São preparações padronizadas de microorganismos, numa concentração do inócuo em torno de 10 6, comprovadamente resistentes e específicos para um particular processo de esterilização para demonstrar a efetividade do processo. Primeira geração: tiras de papel com esporos microbianos, incubados em laboratório de microbiologia com leitura em 2-7 dias.

15 Segunda geração: auto-contidos com leitura em 24 a 48 horas. Terceira geração: auto-contidos com leitura em 1 a 3 horas.

16 CALOR SECO (método físico) - Utiliza-se estufa; -Tempos de exposição e temperatura: variam conforme o tipo de material a ser esterilizado; Temperatura 171o.C 160o.C 149o.C 141o.C 121o.C - Morte microorganismo, ocorre por desidratação celular (OXIDAÇÃO); - O maior problema relacionado é o fato de que a penetração do calor é difícil, lenta e distribui-se de forma heterogênea. Tempo 60 minutos 120 minutos 150 minutos 180 minutos 16horas

17 CALOR SECO (método físico) ÚTIL PARA ESTERILIZAR: ÓLEOS FIXOS, GLICERINA, DERIVADOS DE PETRÓLEO VASELINA E PARAFINA, DIVERSOS PÓS ESTAVEIS AO CALOR (ÓXIDO ZINCO), ARTIGOS DE VIDRO E INSTRUMENTOS CIRÚRGICOS.

18 FILTRAÇÃO (método físico) -Remoção física de microrganismos por adsorção sobre um meio filtrante; - Usa-se este método quando as soluções são termossensíveis; - Existem, comercialmente, vários tipos de filtros com especificações variadas quanto ao tamanho dos poros. (ex. Millipore 0,22 a 0,45µm); -As membranas filtrantes permitem a filtração de grandes volumes de produto, mantendo sua característica e obtenção de um produto estéril. - filtros HEPA filtração do ar (qualidade do ar de salas limpas).

19 - Vantagens: quando o aquecimento não pode ser aplicado e para pequenos volumes líquidos. -Desvantagem: membranas são frágeis (observar se houve rompimento) e tempo de filtração quando soluções viscosas. VALIDAÇÃO DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO: - Via teste destrutivo: retenção bacteriológica (concentração de 10 7 UFC de Brevundimonas diminuta ATCC19146 por centímetro quadrado de área filtrante). - Via teste não destrutivo: integridade da membrana (teste de Ponto de bolha e Fluxo Difusivo). -Teste de Integridade

20 - Basicamente os filtros são hidrofílico (líquido molhante=água), - e hidrofóbico(líquido molhante=álcool isopropílico 60% + água 40%) - São realizados testes iniciais e finais antes e depois de cada processo de filtração. -Teste de Ponto de bolha: O teste de Ponto de Bolha consiste em se molhar o filtro com líquido conveniente e aplicar uma pressão de gás (ar comprimido ou N2) suficiente para expulsar o líquido de dentro dos maiores poros da membrana. Ao atingir esta pressão, o gás que está pressurizando a membrana molhada consegue atravessá-la e pode ser visualizado na saída do filtrado.

21 Teste de Fluxo Difusivo: O teste de Difusão mede a vazão de gás que passa por difusão através do líquido que está dentro dos poros da membrana molhada, isto é, sem expulsar o líquido dos poros. O teste é realizado com pressão constante e temperatura controlada. A vazão de difusão deve ser menor que o valor definido pelo fabricante do filtro, que também deve comprovar a correlação do valor máximo de difusão com a retenção de microorganismos, para garantir um grau de retenção esterilizante para cada lote de fabricação. Obs. B. diminuta é escolhida devido à sua característica de crescimento mantendo células isoladas, de dimensão (0,3 a 0,6µm), fácil manutenção e crescimento rápido.

22 Millipore

23 filtros HEPA

24 RADIAÇÃO GAMA (método físico) A radiação gama proveniente do Co-60 é uma onda eletromagnética curta, de alta frequência e alta energia que, assim como as microondas e as ondas de rádio, faz parte do espectro natural de ondas eletromagnéticas, um dos mais amplos da natureza. Devido à sua energia, possui alto poder de penetração. A energia transferida pela radiação gama provoca a quebra da molécula de DNA dos microorganismos através da retirada de elétrons orbitais dessas moléculas. A quantidade de energia envolvida no processo é desprezível e não provoca elevação de temperatura, podendo ser classificado como um processo frio.

25 RADIAÇÃO Ionizante raios γ raios X Fármacos, soros, vacinas e material médico Não-ionizante UV (260nm) micro-ondas Ar em ambientes fechados Cinética de morte: radicais livres muito reativos lesão do DNA

26 GÁS (método químico) -Equipamento especializado, exposição ao óxido de etileno ou óxido de propileno (gases altamente inflamáveis, quando misturados com ar diluir com gás inerte (dióxido carbono); Tempo de 4 a 18 hrs de exposição óxido etileno, age interferindo as células bacterianas - liga-se a grupos funcionais (-SH;-COOH; -OH). - Gás de alto poder penetrante (útil em utensílios cirúrgicos: cateteres, agulhas e seringas descartáveis; certos antibióticos, preparações enzimáticas termolábeis, material têxtil).

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28 ALDEÍDOS líquido (método químico) Carcinogénico! Esterilização de filtros HEPA. - Utilizado para embalsamar. Formaldeído Glutaraldeído Atuam por alquilação mais eficaz e menos tóxico. ativo na presença de matéria orgânica. - Material hospitalar termo-sensível: -médico, -cirúrgico

29 Radiação gama

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31 Desinfecção : Reduzida, Elevada, Intermediária.

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33 Anti-sepsia Lavagem de feridas e pele pré-operatório. Lavagem de mãos e antebraços do cirurgião. Lavagem de mãos Desodorizantes

34 MÉTODO IDEAL: Rápido Eficaz contra todos microrganismos Não tóxico De fácil penetração Estável Aplicável a vários materiais e tecido humano Sem odor e cor Custo reduzido

35 PIROGÊNIO

36 PIROGÊNIO - Década de 1912, a eliminação de bactérias por esterilização térmica ou filtração, não eliminava a pirogenicidade (febre) destas preparações. Esterilidade não é sinônimo de apirogenicidade. Pirogênios são substâncias orgânicas originadas de microorganismos. Eles não estão vivos, mas há presença de restos celulares e toxinas (endotoxinas ou polissacarídeos da parede externa da célula bacteriana). São responsáveis por muitas das reações febris em pacientes após injeção intravenosa.

37 AÇÃO BIOLÓGICA: - Muitas atividades biológicas estão atribuídas à unidade lipídeo A da endotoxina, entre as quais: pirogenicidade, toxicidade letal, leucopenia seguida de leucocitose, necrose da medula óssea, reabsorção do osso embrionário, agregação plaquetária... Indução de febre: - Envolve a fagocitose do lipídeo A pirogênio endógeno Atravessa barreira hematoencefálica Altera o ponto de equilíbrio dos neurônios reguladores de temperatura do hipotálamo

38 TESTE IN VITRO: TESTE PARA PIROGÊNIO - KIT LAL (teste lisado de amebócitos de Limulus) para detecção de endotoxinas bacterianas. - Extrato obtido de células sanguíneas de um crustáceo (Limulus polyphemus) contém um sistema de proteínas e enzimas que coagula na presença de baixos índices de lipossacarídeos. Sensibilidade do ensaio 0,25 0,015UE/mL - Faz-se diluição do produto em mais de duas vezes o seu volume (inibe a interferência dos ativos da formulação no resultado do teste). - Resultado positivo: Gelificação do lisado do amebócito de Limulus

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42 TESTE IN VIVO: -Teste de pirogênio em coelhos: é um ensaio limite, com a chance de aprovar ou rejeitar uma amostra, mediante informações obtidas de um grupo de coelhos, e que devem atender a um nível de padrão de estado febril. - Cada grupo de animais recebe a injeção intravenosa da amostra e é observado durante um período de ± 3hrs. - Elevação térmica de pelo menos 0,5ºC é considerada decorrente da inoculação de dose pirogênica de material estranho. Considerações: - Quanto > nº de animais, mais segura decisão. - Praticidade e Custos do ensaio. - Reação fisiológica do animal.

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44 PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO Inativação ou remoção das endotoxinas. - INATIVAÇÃO: detoxificação da molécula (LPS), usando tratamentos químicos ou altas temperaturas. 1.Hidrólise ácido-base (reduz/elimina atividade biológica LPS desativação lípídeo A). 2.Oxidação: Peróxido de Hidrogênio (oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeo A) outros: hipoclorito, permanganato de potássio, ácido nítrico. 3.Alquilação (redução da atividade óxido de etileno): materiais termolábeis. 4.Processo térmico: calor seco (estufas 250ºC 30 min) 5.Radiação Ionizante - 60 Co.

45 - REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS 1. Destilação água recém destilada, coletada emantida em frascos despirogenizados estéreis é apirogênica. 2. Ultrafiltração: retidas no filtro. 3. Osmose reversa: filtração sob pressão. 4. Carvão ativo: baseado na adsorção de endotoxinas ao carvão.

46 Obtenção de produtos apirogênicos A partir dos métodos despirogenizantes, observa-se limitações quanto à aplicação no produto terminado, devido Incompatibilidade de distintas naturezas, riscos envolvidos, aspectos econômicos. Exceto para água apirogênica!! IMPORTÂNCIA em trabalhar todo processo produtivo em condições adequadas de: -Higiene (operadores e ambiente); -Matérias-primas com baixa carga microbiana; -Processos validados; -Pessoal Qualificado e Treinado; -Aplicação de todos os conceitos de BPF. Garantir que o produto seja obtido apirogênico no primeiro processamento, dispensando reprocessos ou tratamentos adicionais!!!