Autoclavação. Calor úmido saturado sob pressão Método Overkill. Bacillus stearothermophilus. nível de segurança > Bacillus atrophaeus

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1 Introdução Esterilizar é destruir ou remover todas as formas de vida microbiana capazes de desenvolverem-se no ambiente considerado; através de processos físicos e/ou químicos. Esterilidade ou nível de segurança é a incapacidade de desenvolvimento das formas sobreviventes ao processo de esterilização, durante a conservação e utilização de um produto. A manutenção do nível de esterilidade conferido a um produto garante o prolongamento da vida útil de prateleira e depende das operações pré-esterilização, de esterilização e pós-esterilização. Os métodos de esterilização permitem assegurar níveis de esterilidade compatíveis às características exigidas em produtos farmacêuticos, médico-hospitalares e alimentícios. O método escolhido depende da natureza e da carga microbiana inicialmente presente no item considerado. O calor, a filtração, a radiação e o óxido de etileno podem ser citados como agentes esterilizantes.

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3 Autoclavação Calor úmido saturado sob pressão Método Overkill nível de segurança > 10-6 INDICADORES BIOLÓGICOS Portaria 500 e ISO 11134: 1994 (E) Bacillus atrophaeus Bacillus coagulans Clostridium sporogenes Bacillus stearothermophilus

4 Definiçã ção INDICADOR BIOLÓGICO consiste de uma unidade contendo um tipo específico de microrganismo,, de concentraçã ção conhecida, resistente a um determinado agente esterilizante, que obedece a uma taxa de morte previsível vel quando exposto a determinados parâmetros físicos f e/ou químicos.

5 Usos Indicadores Biológicos (IB) são s o utilizados para: assegurar o nível n de esterilidade atingido no processo; monitorar ciclos de autoclavaçã ção já estabelecidos; e a revalidaçã ção períodica dos mesmos processos. As unidades de IB devem ser posicionadas em locais ce menor acesso ao agente esterilizante (calor úmido).

6 Indicadores Biológicos (IB) A escolha do IB e a determinação dos parâmetros de autoclavação são funções da natureza química da embalagem que acondiciona SPGV. Esporos de Bacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus) e de Bacillus atrophaeus em suspensão ou veiculados em carreadores específicos (fitas) são considerados convenientes IB na autoclavação de SPGV. Esporos de B. atrophaeus ATCC 9372 são utilizados como IB de SPGV em frascos de polietileno, para as operações de autoclavação terminal, às temperaturas entre 94 C e 104 C; Esporos de B. stearothermophilus ATCC 7953 são utilizados como IB de SPGV em bolsas de polipropileno, para processos a 121 ºC.

7 Crescimento de esporos de B. subtilis Log UFC Total 25C Total 35C Tempo (h) Crescimento e esporulação Total a 25C Esporos a 25C Total a 33C Esporos a 33C Log UFC Tempo (h)

8 Esporulação Cada esporo se origina de um única célula. Os gêneros Bacillus e Clostridium são caracterizados, em parte, pela produção de esporos. Através de métodos de coloração, o esporo em formação, refringente ao microscópio, é observado no interior da célula de origem. Com o tempo, os restos celulares dispersam-se, sendo o esporo liberado. Esporos de Bacillus atrophaeus

9 Esporulação Esquema de Formação do Esporo Parede Celular Membrana Plasmática DNA Septo Duas Membranas Pré-esporo Córtex Capa do Esporo Esporo Livre

10 Ativação Ativação é um tratamento que resulta em um esporo que está pronto para a germinação, mas que ainda retém a maior parte das propriedades de esporo. Representa, portanto, um processo responsável pela quebra da dormência nos esporos.

11 Ativação

12 Germinação A estrutura do esporo contém informação genética mínima associada a elementos citoplasmáticos necessários à germinação (geração de uma célula vegetativa), crescimento e multiplicação, quando as condições do ambiente são favoráveis novamente. Quando os esporos são transferidos para um meio e um ambiente favoráveis ao crescimento, ocorre a germinação, rompendose a parede do esporo; à medida que o esporo desenvolve uma nova célula vegetativa, a parede desprende-se.

13 EXPOSIÇÃO AO CALOR ÚMIDO

14 VALOR D (Tempo de Redução Decimal)

15 Padrão de Morte Microbiana ou Tempo de Redução Decimal (Valor D) A palavra "morte", tal como é usada em Microbiologia, é definida como a perda irreversível da capacidade de reprodução. Os microrganismos viáveis são capazes de se multiplicar, enquanto os germes mortos não se reproduzem. A determinação da morte requer técnicas laboratoriais que revelarão se o crescimento ainda ocorre quando a amostra é inoculada em meios sólidos ou líquidos.

16 Log UFC log 10 6 = 6 log 10 5 = 5 log 10 4 = 4 log 10 3 = 3 log 10 2 = 2 Redução logarítmica do número de sobreviventes Temperatura constante log 10 1 = Tempo (min)

17 Tempo de Redução Decimal Log UFC Valor D 6 5 Temperatura constante D 121 oc = 2,0 min Tempo (min)

18 TEMPO NECESSÁRIO PARA REDUZIR UM ( n = 1) CICLO LOGARÍTIMICO NA POPULAÇÃO MICROBIANA INICIAL, à temperatura constante.

19 Log UFC/mL Curva de sobreviventes de esporos de B. subtilis em dextrose 5%. D = 0.65 min D= 1.21 min Tempo (min) D = 1.92 min. D = 1.30 min. T= 104 oc T = 106oC T = 108oC T= 110oC

20 Log UFC n = log N o logn f n = log 10 6 log 10 5 =6 5 =1 n = log 10 6 log 10 4 =6 4= 2 n = 6-3 = 3 n = 6-2 = 4 n = 6-1 = Tempo (min)

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22 Log UFC Log 10 6 (Log 10 0 ) 0 (Log 10-1 ) -1 (Log 10-2 ) -2 (Log 10-3 ) -3 (Log 10-4 ) -4 (Log 10-5 ) -5 (Log 10-6 ) -6 log 10 0 = log 1Mo 1 ml D log 10-1 = log 1Mo 10 ml D log 10-2 = log 1Mo 100 ml D log 10-3 = log 1Mo ml D log 10-4 = log 1Mo ml D D Tempo (min) log 10-5 = log 1Mo ml log 10-6 = log 1Mo ml

23 Número de ciclos logarítimicos reduzidos n = Log N o - Log N f NÚMERO FINAL DE SOBREVIVENTES ( N f ) TEMPO DO PROCESSO (F Tr = t = n * D Tr )

24 Nível de segurança. SAL = Sterility Assurance Level Tempo Inicial Valor D Volume Sobreviventes n Valor D Tempo total processo No min ml Nu:volume Nf Nf Log Nf log(no/nf) min t= nxd min UFC/mL UFC/mL UFC/mL : : E : E : E : E : E :1 1 1.E : : : : : : E+07 1: E+08 1: E+09 1: E+10 1: E+11 1: E+12 1: E+13 1: E+14 1:

25 Curva de sobreviventes a 121 o C. B.stearothermophilus Log UFC/mL Valor D = 2.00 min. Tempo (min)

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27 VALOR Z

28 Representação do Log D em relação à temperatura de referência, para destruir n=1 ciclo logarítmico de microrganismo. Representação gráfica do Log t (t=nxd) em relação à temperatura de referência para atingir o mesmo n= nível de destruição microbiana.

29 Valor z = intervalo de temperatura que causa variação de 1 ciclo no valor D. temperatura

30

31 Relação entre os valores D & temperaturas para B.subtilis ou B. atrophaeus e B. stearothermophilus B. subtilis, z= 13oC B.stearothermophilus, z= 11.8 oc Log D Temperatura ( o C)

32 Autoclavação MÉTODO OVERKILL (No ~ esporos/ ml) Processo Destruição n= 12 ciclos NÍVEL DE ESTERILIDADE = SAL > 10-6

33 Autoclavação Nível de esterilidade: SAL = ESPORO SOBREVIVENTE EM ml 1 esporo = 10 6 ml da solução. Equivale: 1000 bolsas ou ampolas de 1000 ml 2000 ampolas de 500 ml 8000 ampolas de 125 ml

34 Número de ciclos logarítimicos reduzidos n = Log N o - Log N f NÚMERO FINAL DE SOBREVIVENTES SAL = ( N f ) TEMPO DO PROCESSO (F Tr = taxa letal* Δt p = n * D Tr )

35 Valor F, à temperatura de processo, depende da variação da temperatura do produto com o tempo de processo T = f (t) = variável

36 C A L I B R A Ç Ã O D O S T E R M O P A R E S TERM ÔM ETRO BANHO DE Ó LEO A GITADOR REGISTRADOR 10 RABICHO S PT100 (P L A T IN A ) REGISTRADOR DIGITAL

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38 Tempo Temperatura (min) ( o C) Média 0 84, , , , , , , , , , , , , , , , , ,2

39 F Tr = (L 1 +L 2 + L n-1 ) x Δt Δt = constante 2 min

40 Tempo Temperatura (min) ( o C) Média 0 84, , , , , , , , , , , , , , , , , ,2 Taxa Letal L=10 (T-Tr)/z 0,000 0,002 2,339 1,432 1,374 1,361 1,358 1,358 1,349 1,349 1,365 1,361 1,365 1,374 0,224 0,048 0,022 0,021 17,703 F Tr (F Tr = L x t) (min) 0,000 0,003 4,678 2,864 2,748 2,723 2,717 2,717 2,698 2,698 2,729 2,723 2,729 2,748 0,449 0,097 0,043 0,042 35,405 35,406

41 Valor F z Tr = taxa letal x d t = n x D Tr Tempo equivalente que o produto permaneceria, à temperatura de referência, considerando aquecimento e resfriamento instantâneos. Taxa letal em função da temperatura e tempo de processo. Taxa letal Taxa Letal Área = Valor F Temperatura (oc) Tempo (min) Temperatura (oc)

42 Tempo de processo equivalente à temperatura de processo (referência), que o produto permaneceria se o aquecimento e se o resfriamento fossem instantâneos. Valor F z Tr = t = n x D Tr

43 Valor F ( z = 10 oc ) às temperaturas de referência Taxa Letal ( L ) Tempo (min) F (105 oc) = min F (115oC) = 41.9 min F (121oC) = min

44 PROTOCOLO DE VALIDAÇÃO PLANO ESCRITO, DIVIDIDO em ETAPAS (FDA, 1987) : Ratificação: RDC nº 134/2003 e nº 210/2004

45 Fluxo de Validação do Processo VALIDAÇÃO QUALIFICAÇÃO DE INSTALAÇÃO QUALIFICAÇÃO DE OPERAÇÃO QUALIFICAÇÃO DE DESEMPENHO QUALIFICAÇÃO FÍSICA QUALIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA

46 Qualificação de Instalação (QI)

47 Qualificação Operacional

48 Qualificação Operacional Calibração e observância de que: Os equipamentos e instrumentos estão operando segundo o projeto de instalação Treinamento nos procedimentos de operação, manutenção e segurança do sistema; Validação física: Distribuição de calor na câmara: Pontos frios e quentes.

49 Posição dos Termopares na Câmara da Autoclave Vazia e com Carga Fundo da Câmara Sensor de Temperatura Frente da Câmara

50 Qualificação Física Evidências da total distribuição de calor na Câmara Vazia. Termopares ou Sensores de temperatura

51 Posição dos termopares na câmara vazia

52 Distribuição de calor a 121oC. Valor F (min), n (ciclos) e SAL. Valor F n & SAL Valor F n ciclos Tempo (min) Valor F (min) n ciclos SAL Temperatura oc Temperatura (oc) n= 12 ciclos (SAL = -6.4) & F (121oC) = 21 min & t = 22 min.

53 Distribuição de calor a 102oC. Valor F (min), n (ciclos), e SAL. Valor F (min) n & SAL Valor F n ciclos Tempo (min) Valor F n (ciclos) SAL Temperatura (oc) Temperatura (oc) n= 12 ciclos (SAL = -6.59) & F (102oC)= 35 min. & t = 70 min.

54 Qualificação de Desempenho ou de Processo ou de Performance

55 Qualificação de Processo Sistema operacional é validado em relação ao produto: Validação física: Distribuição de calor entre as embalagens Penetração de calor dentro do produto Validação Biológica: Nível de ESTERILIDADE (SAL) Esporos do IB inoculados no produto, justaposto ao termopar. Reprodutibilidade dos parâmetros operacionais.

56 Depende da preparação, envase da esterilização e transporte.

57 Análise do Produto Pré-Esterilizado (Frascos de 1000 ml) UFC/1000 ml Emp re s a 1 Emp re s a 2 Emp re s a 3 Emp res a 5 Emp res a 7 Bactérias Maior Valor - Bactérias Meno r Valo r - Bactérias Fungos Maior Valor - Fungos Menor Valor - Fung os Tempo médio de 5 horas entre o envase e a autoclavação

58 Penetração de Calor

59 Penetração de calor em frascos (500 ml) a 102oC. Valor F (min), n (ciclos), e SAL. Valor F (min) n & SAL Tempo (min) Temperatura (oc) Valor F n ciclos SAL Temperatura (oc) n= 12 ciclos (SAL = -6.41) & F (102oC)= 35 min. & t = 97 min.

60 Posição dos sensores de temperatura. Vista superior 11 a a Frasco Bolsa Dreno Frente

61 Distribuição de calor com câmara vazia (121 o C) 60 Valores médios Fo (min) Termopares Autoclave 01 Autoclave 02

62 Carga máxima. 960 bolsas de 1000 ml. Penetração F (121C) TC 04 n cicclos (TC04) SAL (TC04) Tempo (min) Ponto frio da carga (Penetração de calor). F (121C) = min n = 13 ciclos SAL = (10-7 ) = 1 esporo sobrevivente em cada ml = bolsas Equivalentes 10 4 bolsas

63 Carga máxima: 960 bolsas de 1000 ml. Distribuição de calor. Valor F (121C) min n (ciclos) & SAL F (121C) TC 14 n ciclos (TC 14) SAL (TC 14) Tempo (min) Ponto frio da autoclave: Distribuição de calor F (121C) = 56,16 min n = 18 ciclos SAL = (10-11 ) = 1 esporo sobrevivente em ml = ml Equivalem bolsas = 10 7 bolsas.

64 Bolsas (500 ml) com glicose 5%. Valor F (121oC) & n (ciclos). Valor F Tempo (min) SAL F câmara (6) F carga mín. (6) F carga mín. (19) F carga máx (6) F carga máx. (19) n câmara (6) n carga mín. (6) n carga mín. (19) n carga máx. (6) n carga máx. (19) n=12 ciclos Câmara: Tp= 31 min.; Taq.= 15 min. Carga mínima: Tp= 36 min.; T aq.= 23 min. Carga máxima: Tp= 41 min.; T aq. = 24 min.

65 DESAFIO IB com maior resistência térmica Para validação do processo de esterilização terminal de soluções parenterais, esporos de Bacillus subtilis geneticamente modificados, expressando a proteína verde fluorescente, GFPuv, foram utilizados como indicadores biológicos. A validação foi realizada em autoclave com capacidade de 6000 litros.

66 Qualificação de Autoclaves Capacidade de 6000 L 6 carrinhos com 4 prateleiras Solução de cloreto de sódio 0,9% 30 termopares Câmara Vazia Carga Máxima (1000mL) Carga Heterogênea (10 a 1000mL)

67 Solução Parenteral Valor D (min) 102 C B. atrophaeus ATCC 9372 B. subtilis W (GFP) a Água para Injeção 0,66 1,74 RESULTADOS Glicose 25% 1,05 1,58 Glicose 50% 1,37 1,91 Cloreto de Sódio 0,9% 0,93 3,81 Esporos de Bacillus subtilis W

68 Carrinho Carga (Frascos) mL 2 500mL 3 250mL ml 4 125mL 5 500mL mL Termopar Valor F n (minutos) (ciclos) 3 27,1 7,1 8 18,6 4, ,5 5, ,9 6, ,1 5,5 4 28,5 7,5 6 27,9 7, ,9 7, , ,8 8, ,6 9, ,1 8, ,4 9, ,7 9, ,9 11, ,1 11, ,9 11, ,7 9,6 2 35,1 9,2 5 30,4 8,0 7 30,5 8, ,7 8, , ,1 7,4 9 27,7 7, ,6 5, ,8 6,2 O tempo equivalente de processo (Valor F) a temperatura de tratamento (T R =102 C) (F = n * D) variou de 18,6 a 47 minutos. Para B. atrophaeus, n = 46 ciclos considerando D= 0,93 min. Cepa padrão indicou nível de esterilidade esperado. Nível de segurança de 12 ciclos não foi alcançado para B. subtilis W (GFP), considerando valor D = 3,81 minutos.

69 Validação Garantia do nível de esterilidade estabelecido para o sistema e para o produto. Portanto, a Liberação Paramétrica é dependente dos Fatores muito bem definidos para o Produto e Sistema. ATENDIMENTO MERCADO INTERNO COMPETITIVIDADE EXTERNA

70 Agradecimentos Instituições Departamento de Tecnologia Bioquímico Farmacêutica - FCF Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP Associação Brasileira de Soluções Parenterais - ABRASP

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