Potencialidades das nanopartículas contendo íons terras raras para aplicações como biomarcadores fotoluminescentes

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1 Universidade Federal de São João del-rei Coordenadoria do Curso de Química Potencialidades das nanopartículas contendo íons terras raras para aplicações como biomarcadores fotoluminescentes Daiane Helena Silva Reis São João del-rei 2015

2 Potencialidades das nanopartículas contendo íons terras raras para aplicações como biomarcadores fotoluminescentes Monografia de Trabalho de Conclusão de Curso, apresentada no 2 semestre do ano de 2015 ao Curso de Química, Grau Acadêmico Bacharelado, da Universidade Federal de São João del-rei, como requisito parcial para obtenção do título Bacharel em Química. Autor: Daiane Helena Silva Reis Docente Orientador: Profª. Drª. Luciana Guimarães Co-Orientador: Prof. Dr. Jefferson L. Ferrari Modalidade do Trabalho: Revisão Bibliográfica São João del-rei 2015

3 RESUMO: A nanotecnologia é um dos seguimentos em pesquisade mais rápido crescimento nas últimas décadas e tornou-se uma área essencial para muitas aplicações biológicas. Diante disso, as pesquisas tem se direcionado para o desenvolvimento de nanopartículas biocompátiveis e com baixa toxidade para o uso de biomarcadores. Os biomarcadores são indicadores que sinalizam alguma eventualidade em sistemas biológicos, sendo explorados para marcar o alvo com estruturas químicas específicas e, assim, gerar sinais de fluorescência durante a bioimagem. Os materiais fluorescentes para aplicações biológicas devem, idealmente, satisfazerem algumas condições, como luz de excitação contínua, compatibilidade com água, resistência a fotodegradação, alta intensidade de fluorescência e tempo de vida de estado excitado longo (da ordem de ms). Portanto, as nanopartículas inorgânicas fluorescentes contendo terras raras têm surgido como uma alternativa para biomarcadores, devido às suas propriedades ópticas que superam as limitações dos biomarcadores convencionais contendo corantes orgânicos, pontos quânticos e proteínas fluorescentes. Em particular, as nanopartículas com conversão ascendente (UCNPs), contendo íons terras raras (TR 3+ ), foram consideradas candidatas promissoras para aplicações biológicas, devido às suas excelentes características químicas e ópticas, e excitação em uma faixa do espectroeletromagnético que possibilita uma profundidade de penetração da luz nos tecidos biológicos. Nesta revisão, o desenvolvimento de biomarcadores, bem como a avaliação e validação para sua utilização são descritos. Os tipos de biomarcadores existentes, em especial os biomarcadores contendo os íons terras raras, são abordados, destacando-se as propriedades destes íons para aplicação como biomarcadores.

4 SUMÁRIO 1.0 INTRODUÇÃO pág BIOMARCADORES pág Definição pág Uso dos Biomarcadores pág Avaliação e Validação dos Biomarcadores pág Tipos de Biomarcadores pág NANOESTRUTURAS ORGÂNICAS FLUORESCENTES pág Nanopartículas Poliméricas dopadas com Corante pág NANOESTRUTURAS INORGÂNICAS FLUORESCENTES pág Terras Raras e suas propriedades gerais e espectroscópicas pág Processo de Luminescência pág Nanopartículas de conversão ascendente de energia (Up-conversion) pág Composição característica de nanopartículas luminescentes (UCNPs) Aplicações das nanopartículas contendo íons terras raras pág. 19 pág CONSIDERAÇÕES FINAIS pág REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS pág. 23

5 1. INTRODUÇÃO Nas últimas décadas devido ao surgimento e o rápido crescimento da nanociência e da nanotecnologia, tem havido um grande interesse no desenvolvimento de nanopartículas biocompatíveis para aplicações biológicas 1,2. Desta forma, o uso de nanopartículas como biomarcadores,, tem sido um grande avanço no desenvolvimento de técnicas mais sensíveis na detecção de agentes químicos e biológicos 3. Os biomarcadores são definidos como indicadores que sinalizam alguma eventualidade em sistemas biológicos. Estes são componentes celulares, estruturais e bioquímicos, que podem definir alterações celulares e moleculares tanto em células normais quanto aquelas tumorais. Os biomarcadores podem ser medidos quantitativamente e avaliados por meio de métodos bioquímicos, imunológicos e moleculares nos fluidos ou nos tecidos corporais 4,5. Na prática, eles incluem ferramentas e tecnologias que podem auxiliar na compreensão da predição, causa, diagnóstico, progressão, regressão, ou no resultado do tratamento de uma doença 6. O sistema de detecção pelo uso de biomarcadores se baseia no sucesso de duas etapas fundamentais, sendo elas: (i) a funcionalização do biomarcador de modo a torná-lo específico; (ii) a forma como ele irá marcar o alvo ativo e transmitir o sinal dessa marcação 7. Atualmente, os biomarcadores fluorescentes têm sido bastante estudados, devido suas vantagens como sensibilidade, estabilidade, alta seletividade, melhorando assim a qualidade de resolução das imagens geradas durante a análise biológica (bioimagem). Além disso, esses biomarcadores são explorados para marcar o alvo com estruturas químicas específicas e, assim, gerar sinais de fluorescência durante a aplicação da bioimagem. A bioimagem é uma técnica importante usada na pesquisa biológica, porque oferece uma abordagem única para visualizar os detalhes morfológicos das células 8,9. Dentre os biomarcadores fluorescentes, incluem as proteínas fluorescentes, corantes orgânicos, complexos metálicos, semicondutores, nanocristais que apresentam o fenômeno de conversão ascendente e nanofósforos 8,10. Apesar dos recentes avanços tecnológicos, ainda existe um número relativamente baixo de biomarcadores de rotina no uso clínico 4. O grande número de biomoléculas que são inicialmente consideradas como potenciais candidatas para aplicação como biomarcadores são avaliadas por critérios de validação sobre a sua especificidade e sensibilidade. Além disso, devem passar pela a aprovação da FDA (Food and Drug Administration), que é o órgão governamental dos Estados Unidos da América responsável por proteger a saúde pública, garatindo a segurança, eficácia e controle dos medicamentos humanos e veterinários, produtos biológicos, dispositivos médicos, alimentos para consumo humano e animal, suplementos alimentares e cosméticos. Em 2011, dos

6 7.720 artigos publicados sobre o uso de biomarcadores, apenas 407 deles foram patenteados, sendo que estes 407 não foram aprovados pelo FDA. 11 Os materiais com propriedades fluorescentes devem satisfazer alguns requisitos para serem utilizados em aplicações biológicas, como: luz de excitação ampla e contínua, boa compatiblidade com água, alta resistência à fotodegradação, alta intensidade da fluorescência com tempo de vida longo, elevado rendimento quântico de fluorescência molar 9. Além disso, para garantir a eficácia destes biomarcadores, eles devem apresentaralta estabilidade coloidal, biocompatibilidade, baixa toxicidade, possuir grupos funcionais desejáveis para a conjugação com biomoléculas específicas 1,12,13, bandas de excitação e emissão na região espectral no infravermelho próximo (NIR), especialmente na região da janela biológica 3, Diante destas características desejáveis para biomarcadores, pesquisadores têm se direcionado no desenvolvimento de nanopartículas não tóxicas ou biodegradáveis, com alta estabilidade química e fotoestabilidade, e emissão na região do visível, e boa biocompatibilidade 20. Durante décadas a detecção de imagens celulares in vitro foi obtida utilizando a marcação fluorescente por moléculas de corante 21. No entanto, as propriedades físicoquímicas destes marcadores a base de corantes, possuem perfis de emissão com bandas largas e pequeno deslocamento de Stokes. O deslocamento de Stokes é a diferença do comprimento de onda entre as posições do máximo dos espectros de excitação e emissão,. Pelo fato dos espectros de emissão dos corantes apresentarem uma banda larga, ocorre a sobreposição de espectros, limitando a utilização de vários corantes para marcar diferentes biomoléculas ou secções de células A fotoestabilidade destes materiais luminescentes, conhecidos como fósforos, não prevê a monitorização de imagem a longo prazo 21, fotoluminescência com vida curta 25, fotodegradação 26, autofluorescência, fototoxicidade. Além disso, a profundidade de penetração da radiação de excitação e emissão para dentro do tecido biológico é limitada, devido os espectros de absorção e emissão dos corantes convencionais, terem comprimentos de onda fora da região da janela biológica 27. As limitações dos corantes orgânicos implicam a necessidade de desenvolvimento de materiais fotoluminescentes alternativos que possam ser utilizados na nova geração de biomarcadores. Deste modo, vem sendo desenvolvidos biomarcadores fluorescentes, cujas emissões são ativadas por dopagem com íons de terras raras (TR 3+ ) 25. A aplicação de nanopartículas contendo TR 3+, como biomarcadores fluorescentes, tem sido amplamente utilizados em ambientes biológicos, devido suas propriedades e características excelentes e desejáveis para aplicação como biomarcadores, em comparação com os corantes orgânicos 9,28,29. Essas nanopartículas contendo TR 3+ podem ser resumidas em três tipos de acordo com as suas estruturas como: (i) nanopartículas poliméricas de coordenação; (ii) complexo conjugado de nanopartículas, e (iii) 2

7 nanopartículas com conversão ascendente (UCNPs) dopadas com TR Dentre estas, as nanopartículas com conversão ascendente (UCNPs) dopadas com TR 3+ têm um grande potencial para se tornar uma nova geração de marcadores fotoluminescentes biológicos, devido às suas excelentes características químicas e ópticas, como baixa toxicidade 20,31, emissões monocromáticas e estreitas, luminescência com tempo de vida de estado excitado longo (ms) 32-34, alta estabilidade química 26,35, resistência à fotodegradação 27,36, região de excitação exatamente na janela biológica, permitindo assim uma maior profundidade da radiação no sistema, melhorando a intensidade da fotoluminescência gerada, 37-39, grande deslocamento Stokes e / ou anti-stokes 12,28,30,40,41. Em particular, o fenômeno da conversão ascendente (up-conversion) de energia (UCL) em nanopartículas dopadas com TR 3+ é um processo pelo qual, uma radiação contínua (CW) de baixa energia na região do infravermelho próximo (NIR) (tipicamente 980 nm) promove a excitação de elétrons do sistema, havendo absorção de fótons múltiplos ou transferência de energia entre os TR 3+ envolvidos 30,42. Tal mecanismo de luminescência exclui os marcadores fluorescentes convencionais e substâncias fluorescentes endógenos. Assim a imagem UCL torna uma ferramenta única de visualização sem autofluorescência de amostras biológicas 26,43. Dentro deste contexto, esta revisão descreve o recente desenvolvimento de sondas fotouminescentes contendo TR 3+ para aplicação como biomarcadores. 2. BIOMARCADORES 2.1 Definição Um biomarcador é uma substância que é introduzida no organismo com o intuído de analisar a função de um órgão ou outros aspectos de saúde. Estes biomarcadores muitas vezes são capazes de detectar anticorpos em uma meio biológico, que indique um estado de uma doença em particular, e até mesmo uma infecção. Ele pode ser utilizado como um indicador de um determinado estado de uma doença ou algum outro estado fisiológico de um organismo. Os biomarcadores exibem um aumento na precisão do diagnóstico para a caracterização mais exata de uma doença em um nível de diagnóstico ou prognóstico. Os biomarcadores podem definir alterações celulares e moleculares tanto em células normais quanto àquelas associadas a uma transformação maligna e podem ser usados para vários propósitos, dependendo da finalidade do estudo de seu uso, podendo ser fotoluminescentes ou não 6,26. 3

8 Em 1990, biomarcadores foram definidos por Hulka como uma substância que permite detectar as alterações bioquímicas celulares ou moleculares que são mensuráveis em meios biológicos, tais como nos tecidos humanos, células, ou fluidos. Na prática, os biomarcadores incluem ferramentas e tecnologias que podem auxiliar na compreensão da predição, causa, diagnóstico, progressão, regressão, ou no resultado do tratamento de doenças. 44, Uso dos biomarcadores A utilização de biomarcadores tem uma grande importância, devido seu poder de qualificar e quantificar uma exposição química a agentes nocivos à saúde, seus efeitos e a suscetibilidade desses efeitos em um indivíduo exposto. Porém, quando se pretende utilizar um biomarcador, alguns requisitos devem ser levados em consideração, como por exemplo, devem ser fáceis de serem detectados por técnicas de análise, como exemplo a bioimagem, apresentar alta precisão no diagnóstico e sua utilização deve ser minimamente invasiva no meio biológico 45. A detecção de biomoléculas é essencial para muitas aplicações em biomedicina, biologia celular e molecular, in vitro ou em células e organismos vivos. Porém, essas aplicações muitas vezes são limitadas, quando os biomarcadores não fluorescentes são utilizados, visto que suas propriedades ópticas são restritas nas aplicações em bioimagem. A imagem biológica (bioimagem) é uma ferramenta poderosa, devido sua abordagem única para visualizar os detalhes morfológicos das células. Logo, o desenvolvimento de biomarcadores para melhorar a eficiência de detecção tornou-se assim essencial. Nesse sentido, a fim de melhorar a sensibilidade dos dispositivos analíticos, pesquisas são desenvolvidas com o intuito de auxiliar no desenvolvimento de biomarcadores fluorescentes, para aplicação em bioimagem, devido esta técnica possuir superioridades inerentes, como alta sensibilidade, alta seletividade, caráter não-destrutivo, entre outras 8, Avaliação e validação dos biomarcadores Ao longo dos últimos vinte anos, os biomarcadores mostraram promessa significativa no mecanismo de como tornar mais acessível e viável o tratamento de um paciente. Porém, há relativamente uma pequena quantidade de biomarcadores que estão em uso clínico. Diante disso, foi desenvolvido pelo Instituto Nacional do Câncer, um diagrama para a avaliação e validação de biomarcadores, definido como "Rede de Pesquisa de Detecção Precoce (EDRN)", apresentado na Figura 1. Este diagrama mostra as cinco fases para o desenvolvimento e para a utilização de biomarcadores. As biomoléculas que são 4

9 consideradas potenciais para tal uso, após ser avaliadas nas cinco fases, passam pela aprovação da FDA (Food and Drug Administration) 4,11. Figura 1: Fases do desenvolvimento de biomarcadores para a detecção de câncer desenvolvido pelo Instituto Nacional do Câncer. Figura adaptada na referência 11. De acordo com o diagrama apresentado na Figura 1, a fase 1 é a classificação e a seleção dos biomarcadores a partir de suas características, sendo esta uma fase importante para designar a aplicação do biomarcador. Já na fase 2, é estabelecido o uso clínico pretendido do biomarcador. Nesta fase o biomarcador é analisado, verificando a validade, portabilidade e reprodutibilidade em várias amostras de vários laboratórios e clínicas. A sensibilidade e a especificidade determinada durante esta fase avalia a qualidade do biomarcador, designado para uso clínico. Na fase 3, é avaliada a sensibilidade e a especificidade do biomarcador em várias outras doenças, para verificar seu potencial de prevenir a ocorrência da doença. Após passar por essas três fases o biomarcador já é considerado como um potencial para uso clínico, sendo assim avaliado na fase 4. Nesta fase, a sensibilidade e especificidade são determinadas, avaliando a extensão e as características da doença no momento da detecção. Este processo avalia os recursos de diagnóstico do biomarcador, por exemplo, a definição, o estágio, o grau e o tipo de tumor. Na fase 5, os benefícios globais e os riscos de realizar o novo teste de diagnóstico do biomarcador em uma população rastreada e controlada são analisados 11. Em 2011, havia publicações sobre o uso de biomarcadores, mas apenas 407 deles foram realmente patenteados 7. A partir desses 407 biomarcadores patenteados, nenhum deles foram aprovados pela FDA. Este fato reflete como muitos estudos relatam a descoberta de diferentes biomarcadores potenciais, mas a maioria deles não cumprem os critérios de alta sensibilidade e especificidade, necessárias para entrar no ambiente clínico. Além disso, há uma escassez de amostras para os estudos de validação, sendo este um 5

10 obstáculo que impede a aprovação de biomarcadores. Em conclusão, a padronização de quantificação para a qualidade e a validação de um candidato a ser aplicado como biomarcador precisa ser urgentemente melhorado para diminuir os recursos econômicos excessivos para a aprovação de novos biomarcadores 11. De fato, é necessário que exista uma severa avaliação destesbiomarcadores, pois após sua aprovação, serão aplicados em meio biológico, e inseridos in vivo. O fato dos biomarcadores serem reprovados devido a ausência de amostras para os estudos de validação e os altos custos para a aprovação destes marcadores, novos testes necessitam ser realizados de modo a avaliar as potencialidades de novos materiais para essas aplicações. 2.4 Tipos de biomarcadores Diante da necessidade de novos biomarcadores com maior eficiência para aplicação em bioimagem, marcadores fluorescentes são os mais explorados, devido suas vantagens como sensibilidade, estabilidade e capacidade de multiplexação de sinal. As nanoestruturas fluorescentes (NFs) que são mais exploradas para aplicação em bioimagem incluem as proteínas fluorescentes, corantes orgânicos, complexos de metais, semicondutores, nanocristais de conversão ascendente e nanofósforos 47. De acordo com a composição e estrutura da nanopartícula, as NFs são classificadas, conforme a Figura 2. Com base na classificação de NFs os mecanismos de fluorescência e propriedades ópticas são dependentes do tamanho da nanopartícula, e dos métodos de preparação 8. Figura 2: Classificação das nanostruturas fluorescentes (NFs) com base em suas composições químicas e estruturais diferentes. Figura adaptada da referência 8. 6

11 Materiais fluorescentes para aplicações clínicas devem, idealmente, satisfazerem os seguintes requisitos: (I) uma luz de excitação contínua e ampla; (II) compatibilidade em água; (III) alta resistência à fotodegradação; (IV) alta intensidade da fluorescência e à estabilidade; (V) tempo de vida de estado excitado longo (ms); e (VI) elevado rendimento quântico de fluorescência molar; (VII) região de excitação na janela biológica permitindo alta profuncidade de penetração da excitação 4,9. Este último requisito é muito importante, uma vez que a janela biológica, conhecida também como janela óptica, foi definida a partir do espectro de absorção das moléculas presentes nos tecidos, como hemoglobina, mioglobina, melanina e citocromos, conforme a Figura 3. O perfil de absorção dessas moléculas é limitado a região do vermelho visível ao infravermelho próximo, aproximadamente em 600 nm < λ < 1000 nm. No tecido humano, os comprimentos de onda menores da região visível do espectroeletromagnéticosão quase totalmente absorvidos pela melanina da pele. Já no infravermelho, a radiação eletromagnéticas atravessam a pele e são significativamente absorvidas pela água (~ 1200 nm), por estas razões, existe a chamada janela óptica. Portanto, nesta região, há baixa absorção de luz no tecido, desta forma a luz consegue penetrar de alguns milímetros a alguns centímetros no tecido, o que permite aos estudos de espectroscopia óptica no infravermelho próximo inferir diversos dados sobre a região do tecido estudado Figura 3: Espectro de absorção de algumas moléculas presentes nos tecidos biológico 48. 7

12 3. NANOESTRUTURAS ORGÂNICAS FLUORESCENTES 3.1 Nanopartículas poliméricas dopadas com corante A primeira classe de nanoestruturas fluorescentes utilizadas como biomarcadores são constituídas por moléculas orgânicas, como exemplo a isotiocianato de fluoresceína (FITC), as rodaminas, dentre outras. As principais limitações, desta primeira classe de nanoestruturas fluorescentes utilizadas como biomarcadores estão associadas à sua baixa fotoestabilidade. Por outro lado, apenas um número restrito de moléculas orgânicas luminescentes podem ser ligadas às biomoléculas sem interferir em seu funcionamento no sistema biológico. Para aumentar o número de centros fotouminescentes ligados a essas moléculas orgânicas, tem-se procurado associá-las a partículas de polímeros ou de sílica, como observado na Figura 4. Os corantes são ligados à superfície da nanopartícula ou incorporados em seu interior 49, para atingir a fluorescência e serem mais estáveis. Assim, nanopartículas poliméricas (NPs) dopadas com corante são esferas poliméricas reticuladas em que os corantes fluorescentes são ligados covalentemente ou fisicamente aprisionadas. Estas nanoestruturas fluorescentes são sintetizadas a partir da copolimerização de monómeros fluorescentes com outros monómeros funcionais ou o encapsulamento de corante orgânico fluorescente no interior da molécula ou sobre a matriz 54,55. Figura 4: Duas estratégias em relação à nanopartículas poliméricas fluorescentes: (a) polimerização de monómeros fluorescentes; (b) encapsulamento de fosfóros (material fluorescente) dentro ou anexando (ligação) fósforos sobre as nanopartículas poliméricas. Figura adaptada da referência 8. No entanto, são necessários grupos funcionais especiais para a integração entre a NP e centro fotoluminescente (corante). Essa interação é muito importante, pois sem a ligação covalente entre o centro fotoluminescentee a matriz polimérica, as moléculas de corante podem ser dissociadas das partículas ao longo do tempo, o que diminui o brilho da 8

13 emissão. Comopode ser observado, a Figura 5 (a) e (b), faz a comparação da fluorescência e da estabilidade entre as nanopartículas dopadas com corante e apenas a molécula de corante dissociada 8. Certamente, estas NFs podem expor os materiais fluorescentes em ambiente externo, provocando a oxidação destes centros fotoluminescentes ou fotodegradação, assim, a sua fotoestabilidade não poderia ser melhorada 8. Além disso, outras desvantagens como fotobranqueamento, banda de emissão larga, pequeno deslocamento Stokes decorrente da sobreposição dos espectros de excitação e de emissão 22,56, tempo de vida de luminescência curto 4, alta fotodegradação e fototoxicidade 26, podem ocorrer. Outro ponto que deve ser considerado é que a profundidade de penetração da radiação de excitação e a emissão visível para dentro do tecido biológico são limitadas, devido os comprimentos de onda de absorção e emissão destes materiais não atingirem a janela biológica. Essa é outra desvantagem no que diz respeito a sua aplicação in vivo para aplicação em bioimagem 27. Figura 5: O processo de marcação específica e a comparação da intensidade de fluorescência (a) entre uma única molécula de corante e nanopartículas poliméricas dopadas com corante, e (b) estimativa da estabilidades in vivo. Figura adaptada da referência 8. 9

14 4. NANOESTRUTURAS INORGÂNICAS FLUORESCENTES A busca por novos biomarcadores com alta sensibilidade óptica, seletividade, não tóxicos e biocompatíveis, e que supera as limitações dos marcadores convencionais, levou o desenvolvimento de marcadores luminescentes inorgânicos contendo TR 3+, nos últimos 10 anos, como alternativa para tal aplicação, devido às suas propriedades ópticas promissoras para aplicações biológicas. 1,26,46,57-61 As propriedades atrativas de nanopartículas contendotr 3+ incluem, bandas de emissão extremamente estreitas 30,33, grande deslocamento Stokes e/ou anti-stokes, o que evita a auto-absorção do ligante e redução dos sinais espontâneos, boa intensidade de fotoluminescência com longo tempo de vida de estado excitado (ms). O tempo de vida de estado excitado longo é extremamente vantajoso. Em sistemas convencionais de biomarcadores à base de moléculas orgânicas, o espaço de tempo de excitação até a emissão de fotoluminescência, ocorrem os efeitos de espalhamento de luz e de fluorescência de fundo, que muitas vezes acabam sobrepondo a emissão do biomarcador, diminuindo assim a resolução da bioimagem O fato do biomarcador apresentar um tempo de vida de estado excitado longo, possibilita que após a excitação, todas as moléculas do meio biológico emitem, e na sequência o biomarcador de tempo de vida longo, promove a fotoluminescência monocromática, melhorando a qualidade da bioimagem. Além disso, sistemas como esse, promovealta fotoestabilidade 30,46,65, biocompatibilidade 30, baixa fotodegradação, baixa toxicidade, e alta estabilidade química 36. Várias nanopartículas à base de TR 3+ têm sido relatadas como marcadores luminescentes para moléculas biológicas, que podem ser resumidas em três tipos de acordo com as suas estruturas: (i) nanopartículas poliméricas coordenadas aos TR 3+ 66, (ii) nanopartículas conjugado com complexo de TR e (iii) nanopartículas de conversão ascendente dopado com TR Diferentes mecanismos dependentes de estruturas dos marcadores são utilizados para a síntese destes três tipos de biomarcadores fotoluminescentes à base de nanopartículas de TR Terras raras e suas propriedades gerais e espectroscópicas Os terras raras, para os quais se utiliza o símbolo TR, correspondem aos elementos do lantânio (La, Z = 57) ao lutécio (Lu, Z = 71), entre os quais se incluem o ítrio (Y, Z = 39) e o escândio (Sc, Z = 21). Mas, segundo recomendações da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), usam-se os termos lantanídeos para designar os elementos 10

15 do La ao Lu e terras raras quando aos lantanídeos são incluídos o Sc e o Y, como pode-se observar na Figura Figura 6: Tabela periódica destacando a localização dos terras raras 69. Os terras raras, apesar de sua denominação sugestiva, não são terras e nem raros, pois estão distribuídos em toda a crosta terrestre, como por exemplo, o túlio e lutécio, os quais são os terras raras menos abundantes, são mais encontrados na crosta terrestre que a prata e o bismuto 68. Devido ao número grande de reservas, existe grandes interesses no valor potencial nos depósitos das terras raras e no desenvolvimento de projetos para sua utilização no fornecimento de tecnologia. De acordo com dados da TMR (Pesquisa de metais de tecnologia), existem 58 recursos minerais de terras raras, associados com 53 projetos avançados em 49 empresas, localizadas em 35 regiões de 16 países 70. Os TR receberam esta denominação porque foram inicialmente encontrados na forma de óxidos, que se assemelham aos materiais conhecidos como terras. Os elementos terras raras ocorrem como constituintes de mais de cem diferentes minerais. Por constituírem uma família que apresenta propriedades físicas e químicas semelhantes, têm-se dificuldade em separá-los e obtê-los como espécies relativamente puras, devidos as suas similaridades químicas e físicas. O primeiro elemento TR, o Cério, foi descoberto em 1751 pelo mineralogista suíço A. F. Cronstedt. Este grupo de elementos foi pouco explorado durante muitos anos, pelo fato do mineral encontrado ter sido confundido com cálcio, por apresentar características avermelhadas e ser denso. Somente em 1907 o último TR (o Lutécio) foi isolado e assim os terras raras naturais foram conhecidos 71. As características espectroscópicas e magnéticas peculiares dos elementos terras raras os tornam eficientes em várias aplicações 72. As propriedades químicas e físicas dos terras raras são muito semelhantes pelo fato dos elétrons destes elementos serem distribuídos nos orbitais f. Todos os átomos neutros possuem configuração eletrônica em 11

16 comum 6s 2 e número de elétrons variáveis nos orbitais f. Como o raio médio dos orbitais 4f são menores que dos orbitais 5d e 6s, a designação de transição interna f-f é usada para esses elementos. Já para os TR 3+ observa-se um aumento crescente na configuração 4f n (n = 1-14) 1. Dentre esses elementos, apenas o escândio e o ítrio não derivam da configuração do gás nobre Xenônio (Xe). Os demais elementos possuem a configuração base do Xe seguida do preenchimento sequencial da camada 4f, resumida por [Xe] 4f n 5s 2 5p 6 5d 0-1 6s 2. Por meio desta configuração, observa-se que os orbitais 4f são protegidos do ambiente químico, uma vez que estão localizados mais internamente, protegidos pelos elétrons dos orbitais 5s e 5p e ainda 5d, 6s, provocando blindagem aos orbitais f. Assim, os orbitais que participam das ligações químicas do elemento, são os orbitais externos 5d e 6s, e os elétrons nos orbitais 4f n, tem uma fraca interação com os ligantes e efetivamente não sofrem influência do ambiente químico ao seu redor 68. O efeito de blindagem observado nesses elementos faz com que as bandas de emissão e de absorção sejam extremamente finas e bem definidas, tornando-se uma das maiores vantagens da utilização de terras raras em materiais que necessitam de emissão monocromática 1. Os TR 3+ apresentam a contração lantanídica. A medida que a carga do núcleo aumenta, os elétrons de valência são atraídos para mais próximo do núcleo. Como pode ser visto na Figura 7, os átomos tendem a ficar menores, devido a diminuição progressiva dos raios atômicos e iônicos 73. Figura 7: Distribuição Radial dos elétrons 4f, 5s, 5p e 6s. Densidade de probabilidade (eixo y) em função da distância (eixo x) 74. Nos compostos contendo TR 3+ a fotoluminescência em geral é devida às transições f-f. Essas transições intraconfiguracionais f-f são proibidas pela regra de Laporte. Esta regra de seleção afirma que uma transição eletrônica só ocorre via mudança de paridade, ou seja, quando L= 1. Logo, para explicar as transições intraconfiguracionais dos TR 3+, em 1962, 12

17 B Judd 73 e G. Ofelt 75, mostraram que as transições são resultantes de uma mistura dos níveis 4f n, com os estados de configurações opostas, como os níveis 4f n-1 5d, tornando-se possíveis quando o campo cristalino não apresenta centros de inversão 36. As transições 4f- 4f dos TR 3+, dependendo da natureza de cada íon, ocorrem na região ultravioleta passando pelo visível indo até o infravermelho. Essas transições, são definidas e facilmente reconhecíveis, como podem ser observadas na Figura 8, pelo fato de serem finas. Além disso, como estas transições são formalmente e igualmente proibidas, os tempos de vida dos estados excitados são longos (da ordem de ms), os quais permitem o uso em diversos sistemas que necessitam de uma resposta com tempo mais longo, como por exemplo biomarcadores fotoluminescentes 13. Figura 8: Espectros de luminescência de complexos de alguns TR 3+, sob excitação no UV-visível Processo de Luminescência A luminescência é o fenômeno de emissão de radiação eletromagnética a partir de algumas espécies tradicionalmente conhecidas como fósforos, sob excitação de diferentes formas. A luminescência pode ocorrer de várias maneiras: (i) a fotoluminescência, que é obtida a partir de absorção de fótons, sendo a mais utilizada frequentemente a luz ultravioleta (UV); (ii) a catodoluminescência, obtida a partir da excitação com raios X na superfície de alguns materiais; (iii) a eletroluminescência, a partir da passagem de corrente elétrica através do material; (iv) e a quimioluminescência, que durante uma reação química, o composto libera a energia absorvida em forma de luz, dentre outras 76. Materiais fotoluminescentes podem ser considerados eficientes quando apresentam uma absorção de luz em uma região do espectroeletromagnético desejada, geralmente na região do UV, do raio x, do infravermelho como exemplo na Figura 9. Após a absorção de luz, o material possui uma estabilidade química e uma alta eficiência de conversão, para 13

18 converter a luz absorvida para o estado excitado luminescente, geralmente na região do visível, com um longo tempo de vida de luminescência 77. FIGURA 9: Diagrama ilustrando a energia absorvida por um material luminescente (esquerda), que então é transformada em luz emitida de menor energia (direita) 78. Para entender o mecanismo de luminescência em um material fotoluminescente pode ser usado o diagrama de coordenadas configuracionais, Figura 10. O mecanismo envolve o ativador que é excitado a partir do seu estado fundamental (A) para um nível de mais alta energia (B). Parte dessa energia é perdida via mecanismos não radiativos, e o íon ativador relaxa para um estado excitado de mais baixa energia (C) Em seguida ele retorna ao estado fundamental (A), emitindo energia na forma de luz 14,78. No entanto, para muitos materiais luminescentes a situação é mais complicada que a descrita neste mecanismo. Os TR 3+ possuem baixa absortividade molar em função das transições proibidas. Portanto, o TR 3+ por si só não apresenta eficiência por excitação direta deste íon, o que leva a fotoluminescência por excitação direta do TR 3+ ser pouco eficiente 41,14. Sendo assim, uma das saídas é a utilização de um ligante que absorve eficientemente a radiação ultravioleta e transfere a energia absorvida do estado excitado para o estado excitado do TR 3+, ocorrendo a fotoluminescência na região do visível 79. A transferência de energia intramolecular do ligante para o TR 3+, é um processo de conversão de energia, chamado efeito antena. O ligante é utilizado como sensibilizador de fotoluminescência, e deve apresentar alto coeficiente de absortividade molar, e estados excitados de menor energia em ressonância com os níveis emissores dos TR 3+ na posição favorável para a transferência de energia eficiente do ligante para o TR

19 Figura 10: Diagrama de coordenadas configuracionais. Excitação do estado fundamental (A) para o estado excitado (B), relaxação para um estado de excitação menor energia (C) e retorno ao estado fundamental com emissão de luz 78. A Figura 11, apresenta o mecanismo de luminescência, que envolve a transferência de energia do ligante para o TR 3+. Durante o processo de absorção na região do ultravioleta, na primeira etapa, a energia de excitação é absorvida fortemente pelo ligante. Esta absorção de luz corresponde a uma transição do estado fundamental (S 0 ), para estados excitados do ligante, o estado singleto (S 1 ) de alta energia, o qual decai não radiativamente para o estado tripleto (T 1 ), que pode decair de forma radiativa ou não radiativa para o estado fundamental (S 0 ) ou transferir a energia intramolecular do estado excitado do ligante, de forma não radiativa, para os níveis energeticamente excitados do íon lantanídeo que emite na região do visível. A eficácia desta transferência depende da posição entre o nível excitado do ligante e os níveis energeticamente excitados do íon, resultado de interações fortes entre o metal e os grupos cromóforos do ligante. A emissão de radiação pelo íon metálico corresponde à desativação do seu nível excitado. As transições radiativas que ocorrem sem mudança de multiplicidade, S 1 S 0, referem-se à fluorescência de tempo de vida curto, enquanto que aquelas com mudança de multiplicidade, T 1 S 0, estão relacionadas à fosforescência com tempo de vida longo 79,80. Pode-se observar que a diferença dos dois mecanismos, fluorescência e fosforescência é a perda de energia por emissão espontânea de radiação quando um cromóforo (ligante) volta do estado excitado, para o estado fundamental, de mesma multiplicidade de spin (ΔS = 0), ocorrendo na fluorescência. Já no caso da fosforescência, ocorre o mesmo processo, no entanto com espécies com multiplicidades diferentes de spin (ΔS 0). De forma mais clara, a fosforescência possui o estado excitado com maior tempo de vida em relação à fluorescência

20 FIGURA 11: Mecanismo de transferência de energia do ligante para o TR 3+ (III) 79. As transições características dos TR 3+ são permitidas por mecanismos de dipolo elétrico forçado entre os níveis multipletos, os quais são resultantes das transições intraconfiguracionais 4f n. Tais transições podem ser observadas nas linhas de emissão e absorção destes íons. No entanto, para que haja transferência eficiente de energia dos ligantes para o TR 3+ central, os níveis de energia do estado tripleto do ligante ou algum de seus níveis populados devem estar ressoantes com o nível emissor do TR 3+ ou localizado logo acima do nível emissor deste TR Desta forma, com os dados espectrais dos compostos dos TR 3+ é possível quantificar as energias dos níveis fundamentais e excitados destes íons, conforme Figura 12. Figura 12: Diagrama parcial dos níveis de energia de alguns íons terras raras

21 4.3 Nanopartículas de conversão ascendente de energia (Up-conversion) Nanopartículas fotoluminescentes que apresentam conversão ascendente (UCNPs, do inglês Upconverting Nanoparticles) dopado com TR 3+ são materiais fluorescentes que têm sido propostos como uma alternativa de uma geração de biomarcadores fotoluminescentes. Devido às suas características químicas e ópticas atraentes, como baixa toxicidade 28, espectros de absorção e de emissão com linhas finas, tempo de vida de estado excitado longo, estabilidade química, alta fotoestabilidade e permite uma penetração mais profunda nos tecidos, devido a excitação estar na região do infravermelho próximo que está na região da janela biológica, sendo esta a região onde os tecidos são transparentes. 13,84,85. Comparado com corantes orgânicos, as UCNs dopado TR 3+, possuem propriedades que superam as limitações mencionadas dos biomarcadores fotoluminescentes convencionais. As UCNs tem sido sintetizadas 86-91, com morfologia e tamanho diferente, controlando a fase da superfície do material obtido de maneira que frequentemente é modificado para ser aplicado no ambiente hidrofílico, que é uma característica importante para aplicações biológicas. Basicamente, a modificação da superfície é frequentemente realizada usando qualquer superfície de revestimento inorgânico, ou ligantes orgânicos ou revestimento com polímero, como exemplo a nanopartícula NaYF 4 :Yb 3+ /Er 3+ revestida com o polímero orgânico polivinilpirrolidona (PVP) 36. Diante da Figura 13 (a), pode-se observar o mecanismo de conversão descendente de energia (do inglês downconversion), obtido por materiais fluorescentes quando o TR 3+ absorve um fóton na região de maior energia (ultravioleta), e em seguida estes íons emitem fótons na região de menor energia, geralmente no visível ou infravermelho. Diferentemente do downconversion, o mecanismo de conversão ascendente de energia (do inglês upconversion), foi definido como um processo óptico não linear no qual a absorção sequencial de dois ou mais fótons de menor energia na região do infravermelho próximo é convertida em um comprimento de onda curto, correspondente na região do visível, sendo esta uma região de maior energia. Uma característica importante deste processo é a radiação de absorção na região do infravermelho próximo ser menos danosa aostecidos, comparada à radiação utilizada para excitar a maioria dos outros materiais luminescentes 28,92,93. Portanto, desde a descoberta do processo de upconversion em , UCNPs demonstraram grandes vantagens para serem aplicadas em imagem biológica Dentre os cinco mecanismos básicos de conversão ascendente, os dois mecanismos mais prováveis são identificados na Figura 13 (b): (i) Absorção Sequencial de dois fótons (ESA) e (ii) Conversão Ascendente por Transferência de Energia (ETU) 20,36,107,

22 Figura 13: Representações esquemáticas de diferentes mecanismos de luminescência (a) ilustrando a fluorescência de nanopartículas convencionais, com baixa conversão de energia; (b) processo Upconversion de materiais dopados com lantanídeos, ETU: conversão ascendente de transferência de energia, e ESA: a absorção estado animado. Figura adaptada da referência 20. No processo de conversão ascendente por transferência de energia (ETU) há o envolvimento de dois íons distintos, sendo que cada íon absorve separadamente um fóton de excitação, a fim de preencher o mais elevado estado metaestável. Inicialmente os elétrons do estado fundamental, GSA, são promovidos para o primeiro estado excitado metaestável, E 1, e volta para o estado fundamental GSA. O íon (referido como ativador) pode então ser ainda promovido para um estado excitado metaestável superior, E 2, mediante da transferência de energia não radiante de um íon vizinho (referido como um sensibilizador), que relaxa de volta ao estado fundamental GSA. O processo não-radioativo de transferência de energia ocorre de duas formas. Se a diferença de energia entre o estado do sensibilizador GSA e E 1 é ressonante com o estado E 1 para E 2, sendo a transição do ativador, em seguida, a transferência de energia pode ocorrer antes do sensibilizador voltar radiativamente ao estado GSA 36,98,109. A absorção sequencial ressonante de dois fótons (ESA), ou também denominado absorção de estado excitado (ESA) é o processo caracterizado pela absorção sucessiva de pelo menos dois fótons por um único íon, durante a aplicação do pulso do laser, sendo que o primeiro fóton popula um estado intermediário e o segundo promove a excitação para um nível emissor de maior energia 98. Os elétrons do íon estão inicialmente no estado fundamental GSA, e são promovidos para o primeiro estado excitado metaestável, E 1. A longa duração deste estado excitado metaestável permite a absorção de um segundo fóton que através da absorção de energia, 18

23 promove ainda mais o elétron excitado para o estado excitado superior, E 2. O processo de ralaxação radioativa desse elétron excitado volta para o estado GSA, através da emissão do fóton que é de energia mais elevada (comprimento de onda mais curto) do que qualquer um dos fótons que foram absorvidos. 36,57,108,110,111. Experimentalmente, observa-se que alguns sistemas apresentam simultaneamente os dois processos de conversão ascendente mais prováveis (ESA e ETU), entretanto, uma característica importante deixa clara a diferença entre eles. No processo de absorção de estado excitado (ESA) o tempo de excitação é instantâneo e coincide com o tempo de bombeamento que é da ordem de nanossegundos para um laser pulsado. Já no processo de conversão ascendente por transferência de energia (ETU), o tempo de excitação ocorre em escalas mais longas, da ordem de microssegundos, já que envolve uma transferência de energia entre dois íons excitados. Pode-se ressaltar que, nos sistemas que apresentam esses dois processos, o tempo de excitação é composto pelas duas componentes temporais (ns e μs) Composição característica de nanopartículas luminescentes de conversão ascendente de energia (UCNPs) Com base na função dos TR 3+ dopados nas UCNPs, esses íons são chamados sensibilizadores e ativadores, sendo os sensibilizadores que absorvem a luz de excitação e os ativadores emitem a luz absorvida 20. UCNPs luminescentes são constituídas por uma rede hospedeira cristalina inorgânica. Geralmente, os TR 3+ são incorporados em baixas concentrações no material hospedeiro opticamente transparente na gama de interesse, ou seja, para aplicação como biomarcadores, deve ser transparente na região da janela biológica. Essa matriz serve principalmente para posicionar adequadamente os íons luminescentes no espaço tridimensional 57. Além disso, a estrutura da nanopartícula é obrigada a ter baixas energias de fônons, caso contrário, as perdas de energia nãoradiativos irá aumentar, levando a uma baixa eficácia de conversão ascendente 57,112. Neste ponto, fluoretos, tais como NaYF 4 e LaF 3 tem a estabilidade química necessária para aplicações aquosas (biológicos), bem como as energias de fônons bastante baixas (~350 cm -1 ) para garantir uma elevada eficiência de fotoluminescência 20,58,111. Energias de fônon de materiais hospedeiros utilizados, e os TR 3+ utilizados como dopantes, encontram-se resumidos na Tabela Hoje em dia, novos materiais utilizados como hospedeiros para os TR 3+ estão sendo descobertos e avaliados, e oferecem mais possibilidade de desenvolver novos tipos de UCNPs. 19

24 Tabela 1: Energias de fônon de materiais utilizados como rede hospedeira para UCNPs, e alguns TR 3+ utilizados como sensibilizadores e ativados 36. Material Dopante Energia de fônon Referência Vidro de Silica Eu 3+, Tb [113] LaPO 4 Ce 3+ / Tb [113] Y 3Al 5O 12 Er [113,114,115] Gd 2O 3 Eu [113,116] YVO 4 Eu [113,117] Y 2O 3 Yb 3+ e Er [113, 114, 115] LiYF 4 Yb 3+ / Er [118] Ho 3+, Tm 3+ e Er 3+ b-nagdf 4 Yb 3+, Er [113, 119,120] NaYF 4 Yb / Tm Tm 3+, Er 3+, e Ho [8,121,122,123,124,125] LaF 3 Ce 3+, Tb [126] 4.5 Aplicações das nanopartículas contendo íons terras raras Os TR 3+, devido às suas propriedades fotoluminescentes, são utilizados em várias aplicações, dentre elas, dispositivos geradores de imagens, conversores de radiação, sondas espectroscópicas, marcadores químicos e biológicos. Devido o interesse crescente da utilização dos TR 3+ como sistemas fotoluminescentes em biomarcadores, houve a possibilidade das nanopartículas fluorescentes à base de terras raras serem aplicadas em diferentes áreas biológicas, abrangendo a biologia molecular e celular, in vitro e ensaios in vivo. Estas nanopartículas contendo TR 3+, portanto, são uma alternativa interessante comparadas aos marcadores convencionais existentes 46. A utilização dos corantes orgânicos em biomarcadores está bem estabelecida em uso clínico, uma vez que é convencional sua utilização como biomarcadores. Porém suas desvantagens levaram ao interesse e utilização das nanopartículas fotoluminescentes que apresentam conversão ascendente (UCNPs) como biomarcadores. Devido sua baixa toxicidade, tempo de vida do estado excitado longo e a radiação do infravermelho próximo 20

25 ser usada para excitar as UCNPs, sendo esta radiação, menos destrutiva nos tecidos biológicos, em comparação com a radiação UV que é muitas vezes usada para excitar outros sistemas fotoluminescentes 103. Suas potencialidades como biomarcadores foram estabelecidos, levando suas aplicações como exemplo na Tabela 2. Tabela 2: Aplicação de alguns biomarcadoresbiomarcadores compostos de nanopartículas fluorescentes contendo TR 3+. Alvo do marcador biológico Biomarcador contendo TR Referência Detecção da hibridação do DNA NaYF 4: Tm 3+, Er 3+ e Ho 3+ [103] Detecção simultânea de aflatoxina B 1 e ocratoxina A NaYF 4: Tm 3+, Er 3+, e Ho 3+ [103] Detecção de uma proteína do HIV NaGdF 4: Er3+ [103] Detecção e monitoramento do metilmercúrio in vivo NaYF 4: Yb 3+, Er 3+, Tm 3+ [12] Detecção de avidina-biotina NaYF 4: Yb 3+, Er 3+ - biotina [37] LiLuF 4: Yb 3+, Er 3+ Iidentificação das sequências e estruturas de oligonucleotídeos curtos (DNA / RNA) NaYF 4:Yb 3+,Er 3+ [37] Detecção seletiva da glutationa (GSH) NaYF 4: Yb 3+, TM 3+ [37] Detecção de Cu 2+, Fe 3+ NaYF 4: Yb 3+ -Er 3+ LaF 3: Ce 3+, Tb 3+ [37] Detecção antigénios específicos da próstata em células e secções de tecidos Y 2O 2S: Yb 3+ / Er 3+ [01] NaScF 4 : Yb 3+ / Er 3+ Detecção do sistema digestivo do verme Caenorhabditis elegans Y 2O 3: Yb 3+, Er 3+ [46] 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS Os biomarcadores são uma alternativa de diagnóstico ou prognóstico promissora para uma caracterização mais precisa de uma eventualidade em sistemas biológicos. A utilização destes biomarcadores pode auxiliar na compreensão da predição, causa, diagnóstico, progressão, regressão, ou na detecção precoce de doenças, e assim, aumentar a expectativa de vida tanto em humanos, quanto em animais. Apesar da grande importância dos biomarcadores no meio de detecção de agentes químicos e biológicos, a sua utilização é ainda limitada em uso clínico, devido as etapas de aprovação para sua utilização. Como exemplo dessa limitação, em 2011 um grande número de artigos sobre biomarcadores foram publicados. Logo após, estes biomarcadores desenvolvidos nesses artigos, serem analisados e avaliados, foram inicialmente considerados potenciais para a tal aplicação de acordo com as etapas e processos de 21

26 avaliação. Porém, estes biomarcadores após passar por estas avaliações, devem passar pelo processo de análise do órgão governamental dos Estados Unidos da América responsável por proteger a saúde pública (FDA), para uso clínico. Diante dessa última etapa de avaliação estes biomarcadores inicialmente considerados potenciais para utilização desenvolvidos em 2011, não foram aprovados pelo FDA. O rigoroso método de aprovação deste órgão resulta em um número relativamente baixo de biomarcadores aprovados para uso clínico. A primeira classe de nanoestruturas fluorescentes utilizadas como biomarcadores é constituída por moléculas orgânicas. As principais limitações, de modo geral, desta primeira classe de nanoestruturas fluorescentes provêm de sua baixa fotoestabilidade, fotobranqueamento, banda de emissão larga, pequeno deslocamento Stokes decorrente da sobreposição dos espectros de excitação e de emissão, tempo de vida de fotoluminescência curto, alta fotodegradação e fototoxicidade. Outro ponto que deve ser considerado é que a profundidade de penetração da radiação de excitação e a emissão visível para dentro do tecido biológico são limitadas, devido os comprimentos de onda de absorção e emissão destes materiais não atingirem a janela biológica. Essa é uma outra desvantagem no que diz respeito a sua aplicação in vivo para aplicação em bioimagem. Por outro lado, a possibilidade de utilização de nanopartículas inorgânicas fluorescentes contendo TR 3+ tem sido demonstrada para aplicações como biomarcadores. Estes biomarcadores são uma alternativa interessante, pelo fato de apresentarem propriedades vantajosas, que superam as limitações dos marcadores convencionais serem utilizados, como exemplo, os biomarcadores contendo corantes orgânicos e pontos quânticos. Dentre estas propriedades, incluem bandas de emissão extremamente finas, grande deslocamento Stokes, boa intensidade de fotoluminescência com longo tempo de vida (até milissegundos). O tempo de vida longo é extremamente vantajoso, pois no espaço de tempo excitação até a emissão de fotoluminescência, ocorrem os efeitos de espalhamento de luz e de fluorescência de fundo, que acabam dissipando sem maiores interferências na detecção. Além de alta fotoestabilidade, biocompatibilidade, resistência a fotodegradação, baixa toxicidade que o esperado, e alta estabilidade química. Em especial, as nanopartículas inorgânicas fluorescentes com conversão ascendente de energia (UCNPs), além de apresentarem todas as propriedades mencionadas acima, exibem uma característica importante para atuarem como biomarcadores. A utilização das UCNPs permite uma penetração mais profunda nos tecidos, devido o comprimento de excitação estar na região do infravermelho próximo, especificamente na região da janela biológica. Nesta região os tecidos são transparentes, pois o perfil de absorção destes tecidos, como exemplo a melanina, hemoglobina, é limitado na região do vermelho visível ao infravermelho próximo, aproximadamente em 600 nm < λ < 22