Catalizadores biológicos - Aceleram reações químicas específicas sem a formação de produtos colaterais

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2 O que são enzimas? Catalizadores biológicos - Aceleram reações químicas específicas sem a formação de produtos colaterais SUBSTRATO PRODUTO SITIO ATIVO COMPLEXO ENZIMA SUBSTRATO

3 Segmento Industrial Enzima Aplicação Detergentes Alimentos Uso tecnológico das enzimas proteases, amilases, celulase proteases, amilases,lactases, trasnsglutaminase, lipoxigenase Remoção de manchas, lavagem e clarificação de cores Coagulação do leite (fórmulas infantis), queijo, remoção da lactose, branqueamento e amolecimento do pão, etc. Bebidas Textil Higiene pessoal e beleza Amilase, ß-glucanase, Acetolactato descarboxilase, lacase Celulase, Amilase, Catalase Amiloglicosidase, Glicose oxidase, Peroxidase Tratamento de sucos, maturação de cervejas, Amolecimento do algodão e outras fibras, remoção de corantes em excesso Atividade antimicrobiana

4 Uso de enzimas na área agronômica Identificação de cultivares soja, feijão, milho (isoenzimas) Uso de inibidores enzimáticos para controle de pragas (Inibidores de enzimas digestivas dos insetos com plantas transgênicas) Biologia molecular e engenharia genética (produção de organismos modificados ou transgênicos) Extração de óleo de soja, amendoim, algodão, etc. (rompimento da parede celular e vacúolos com óleo sem solventes orgânicos ou prensas mecânicas) Compostagem (degradação de resíduos e produção de adubos) Utilização da biomassa para produção de etanol (Amilase, Amidoglucosidase, Glucose isomerase, Celulase)

5 Características das enzimas 1 - Grande maioria das enzimas são proteínas com peso molecular grande (varia de à 1 milhão daltons ) 2 - Funcionam em soluções aquosas diluídas, em condições muito suaves de temperatura e ph (mm, ph neutro, 25 a 37 o C) Pepsina estômago ph 2 Enzimas de organismos hipertermófilos (crescem em ambientes quentes) atuam a 95 o C

6 3 - Apresentam alto grau de especificidade por seus reagentes (substratos) Molécula que se liga ao sítio ativo e que vai sofrer a ação da enzima = substrato Região da enzima onde ocorre a reação = sítio ativo

7 4 - A atividade catalítica das Enzimas depende da integridade de sua conformação protéica nativa local de atividade catalítica (sitio ativo) glicose catalase Tetrâmero 60KDa ~ 500aa hexoquinase Da 920aa Sítio ativo e toda a molécula proporciona um ambiente adequado para ocorrer a reação química desejada sobre o substrato

8 A atividade de algumas enzimas podem depender de outros componentes não proteicos COFATORES - Elemento com ação complementar ao sítio ativo as enzimas que auxiliam na formação de um ambiente ideal para ocorrer a reação química ou participam diretamente dela (transferência de grupos)

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10 Nomenclatura das enzimas Nome Usual : Consagrados pelo uso (Tripsina, Pepsina, Ptialina, Lisozima) Nome Recomendado: Mais curto e utilizado no dia a dia de quem trabalha com enzimas, normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada: Amilase hidrolisa o amido Urease quebra a ureia Amido sintetase síntese do amido DNA-polimerase polimeriza DNA Nome Sistemático: Mais complexo, nos dá informações precisas sobre a função metabólica da enzima e lhe confere um código internacional Classe. Grupo. Subgrupo. Enzima = EC x.x.x.x Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular

11 Classificação das enzimas 6 Classes de acordo com o tipo de reação/função classe grupo Reação catalisada EC 1 Oxidorredutase Transferência de elétrons (íons hidreto ou átomos de H) EC 2 Transferase Transferência de grupos EC 3 Hidrolase Hidrólise (transferência de grupos funcionais envolvendo água) EC 4 Liase Adição de grupos funcionais a dupla ligação ou formação de dupla ligação pela remoção de grupos EC 5 Isomerase Transferência de grupos dentro da mesma molécula formando isômeros EC 6 Ligase Formação de ligações C-C, C-S, C- O e C-N por meio de ligações de condensação e quebra de ATP

12 EC 2.1 EC EC EC EC EC 2.2 EC EC 2.3 EC EC EC EC 2.4 EC EC EC EC 2.5 EC EC 2.6 EC EC EC Transferring one-carbon groups Methyltransferases Hydroxymethyl-, Formyl- and Related Transferases Carboxy- and Carbamoyltransferases Amidinotransferases Transferring aldehyde or ketonic groups Transketolases and Transaldolases Acyltransferases Transferring groups other than aminoacyl groups Aminoacyltransferases Acyl groups converted into alkyl on transfer Glycosyltransferases Hexosyltransferases Pentosyltransferases Transferring other glycosyl groups Transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups Transferring Alkyl or Aryl Groups, Other than Methyl Groups Transferring nitrogenous groups Transaminases Amidinotransferases Oximinotransferases EC aspartate transaminase EC alanine transaminase EC cysteine transaminase EC glycine transaminase EC tyrosine transaminase EC leucine transaminase EC kynurenine oxoglutarate transaminase EC ,5-diaminovalerate transaminase EC histidinol-phosphate transaminase EC deleted, included in EC EC acetylornithine transaminase EC alanine oxo-acid transaminase EC ornithine aminotransferase EC asparagine oxo-acid transaminase EC glutamine pyruvate transaminase EC...

13 Como as enzimas agem? Enzimas fornecem um ambiente específico para tornar uma reação biológica termodinamicamente mais favorável.

14 Várias ligações e interações entre os resíduos de aa do centro ativo e o substrato proporcionam a ocorrência da reação química necessária aumentando a velocidade da reação química

15 Como ocorre uma reação enzimática? S + E ES EP P + E Enzimas não alteram o equilíbrio da reação apenas aumentam a velocidade dela

16 Free energy Free energy O equilíbrio reflete a diferença de energia livre entre o estado fundamental do [S] e [P] (espontânea ou não) Determina o caminho da reação (produto ou reagente) Reactants Energy Products Amount of Energy released ( G < 0) Reação espontânea energia livre do produto é menor que do reagente Progress of the reaction Products Reação não espontânea energia livre do produto é maior que do reagente Reactants Energy Amount of energy required ( G > 0) Progress of the reaction

17 As enzimas aumentam a velocidade das reações químicas A velocidade da reação está relacionada à energia de ativação O que é a energia de ativação?

18 Velocidade Equilíbrio Energia de ativação é dada pela diferença energética entre o estado fundamental e o de transição

19 As enzimas aumentam a velocidade das reações diminuindo a energia de ativação das reações

20 Como as enzimas diminuem a energia de ativação? Direcionam o substrato para a posição adequada dos grupos reativos Proporciona a associação e a aquisição de cargas elétricas importantes para a reação Uma vez estando o substrato posicionado no sítio ativo da enzima grupos catalíticos funcionais auxiliam a quebra e a formação de ligações por meio de uma variedade e mecanismos

21 Quais são os grupos catalíticos e como a catálise ocorre? Três tipos de mecanismos catalíticos: Catálise ácido-base geral (transferência de prótons de um substrato ou de um intermediário) Catálise covalente (formação de ligação covalente transitória entre o substrato e a enzima) Catálise por íons metálicos (íons metálicos ligados às enzimas auxiliam a reação)

22 Catálise ácido-base geral Reagentes (substrato) Forma intermediário carregado e instável reação se desloca para o lado dos reagentes

23 Água ou outros grupos podem doar prótons (ou receber) e estabilizar o intermediário proporcionando a formação de moléculas que se quebram nos produtos mais rapidamente Grupamentos das cadeias laterais de aminoácidos nos centros ativos das enzimas

24 Aminoácidos que recebem ou doam prótons nos centro ativos das enzimas Esse tipo de catálise ocorre na maioria das enzimas

25 Catálise covalente Nesse tipo de catálise ocorre a formação de uma ligação covalente entre a enzima e o substrato (ex: hidrólise) A B H 2 O A + B Na presença de uma enzima com um grupo nucleofílico essa reação acontece em dois passos A B + X: H 2 O A X + B A + B + X: Aminoácidos mostrados anteriormente e alguns grupos funcionais de coenzimas agem como nucleófilos

26 Catálise por íons metálicos Nesse tipo de catálise o íon (zinco, magnésio ou cálcio) estão ligados a aminoácidos do centro ativo e participam da catálise como nas catálises ácidobase orientando o substrato ou estabilizando o complexo ES eletricamente.

27 15 minutos intervalo

28 Estudo da velocidade da reação enzimática e como ela se altera em função de diferentes parâmetros

29 Importante abordagem para o entendimento do mecanismo de ação de uma enzima. Parâmetros cinéticos são usados para comparar a atividade e o tipo de reação das enzimas mais importante é a concentração do substrato

30 A concentração do substrato afeta a velocidade das reações catalisadas por enzimas Concentrações baixas de substrato ocorre aumento linear entre Velocidade(V 0 ) e o Substrato [S] [S] V 0 aumenta cada vez menos até atingir um patamar (V max )

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32 Curva que relaciona [S] e V 0 é uma hipérbole

33 Curva relacionando [S] e V 0 pode ser expressa algebricamente

34 Equação de Michaelis-Menten Constante de Michaelis

35 O que é K m? É a concentração do substrato onde se obtém metade da velocidade máxima da reação

36 Para V 0 = V max / 2 V max 2 = V max [S] K m + [S] 1 2 = [S] K m + [S] K m + [S] = 2[S] K m = [S]

37 K m e a V max varia de enzima para enzima caracterizandoas e pode variar também com o substrato K m não é uma medida de afinidade da enzima pelo substrato mas sim a concentração do substrato onde se obtém a metade da velocidade máxima da reação

38 Equação de Michaelis-Menten Transformações da equação de Michaelis-Menten Equação de Lineweaver-Burk ou duplo-recíproco Inversão dos dois lados da equação de Michaelis-Menten Separação dos componentes do lado direito.

39 Equação de Lineweaver-Burk ou duplo-recíproco inverter Separar componentes e resolver y = a x + b K 1 m

40 y Com essa transformação matemática passa-se a trabalhar com uma reta e não com uma hipérbole, mais fácil. Várias informações podem ser obtidas com esse gráfico x

41 a = coeficiente angular y=0 b = coeficiente linear x = 0

42 A atividade de todas as enzimas pode ser inibida por determinadas moléculas Inibidores enzimáticos São moléculas que interferem com a catálise diminuindo ou interrompendo a reação enzimática

43 Para que os inibidores enzimáticos são usados? São importantes para o estudo dos mecanismos enzimáticos de catálise São usados para avaliar o mecanismo de ação das reações quanto ao substrato Ajudam a definir vias metabólicas (seqüências de reações enzimáticas) São usados farmacologicamente drogas (aspirina, glifosato)

44 Como são classificados os inibidores de acordo com seu mecanismo de ação? Reversíveis Irreversíveis Inibição competitiva Inibição incompetitiva Inibição mista ou não competitiva Como eles atuam?

45 Reversíveis - Inibição competitiva Inibidor compete com o substrato pelo sitio ativa da enzima Inibidor tem estrutura molecular semelhante à do substrato [S] deslocar inibidor do sítio ativo e manter V max

46 2 ensaios experimentais [E] constante [S] constante [I] variando [E] constante [S] variando [I] constante Conjunto de retas com inclinação diferente mas intersecto no eixo 1/V 0 V max é constante na presença do inibidor devido à grande quantidade de substrato

47 Reversíveis - Inibição incompetitiva Inibidor se liga em um sítio diferente do centro ativo, impede a reação do complexo ES.

48 2 ensaios experimentais [E] constante [S] constante [I] variando [E] constante [S] variando [I] constante Conjunto de retas com intersecto diferentes no eixo 1/V 0 e -1/Km Independente da concentração do substrato o Km e a Vmax estão alterados

49 Reversíveis - Inibição mista ou não competitiva Inibidor se liga tanto ao complexo ES como à enzima, em um sítio diferente do centro ativo

50 Independente da concentração do substrato o Km e a Vmax estão alterados

51 Tipo de inibição Km Vmax Km/Vmax Competitiva Maior Constante Aumenta Não competitiva Constante Menor Aumenta Incompetitiva Menor Menor Constante

52 Inibição irreversível Inibidor se liga de maneira estável ou covalente com um grupo funcional importante para a atividade enzimática Utilizados experimentalmente para definir os aminoácidos essenciais do centro ativo das enzimas Exemplo: aspirina cicloxigenase prostaglandina glifosato 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS)

53 No metabolismo celular grupos de enzimas trabalham em conjunto onde o produto de uma é o substrato da outra Via metabólica Nessas vias existe sempre uma enzima que determina a velocidade com que o grupo vai trabalhar enzimas reguladoras

54 Regulam a velocidade das reações metabólicas São reguladas por determinados sinais Tipos: Enzimas alostéricas Enzimas reguladas por modificações covalentes reversíveis Enzimas reguladas por proteólise

55 Enzimas alostéricas Possui sítios reguladores para a ligação do modulador especifico Maiores e mais complexas que as não alostéricas (mais que uma cadeia polipeptídica) Sofrem modificações conformacionais em resposta à ligação do modulador (positivo ou negativo)

56 Enzimas reguladas por modificações covalentes reversíveis Diferentes grupos podem se ligar á molécula enzimática e regular sua atividade Grupos ligados covalentemente e removidos pela ação de outras enzimas

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58 Fosforilação/defosforilação Glicogênio fosforilase (fígado e músculos) Glicogênio + Pi Glicogênio (n-1) + glicose-1-p Mais ou menos ativa dependendo dos níveis de glicose do sangue Glicose- 1-P pode ser convertida em glicose e usada como fonte de energia

59 Enzimas reguladas por proteólise Enzimas proteolíticas mecanismo de proteção dos tecidos Cascata de regulação coagulação sangue