Emanuelle Dayana Vieira Dantas

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: SAÚDE COLETIVA Emanuelle Dayana Vieira Dantas EFEITO IN VITRO DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA. Dissertação de Mestrado Natal, 2011

2 2 Emanuelle Dayana Vieira Dantas EFEITO IN VITRO DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA. Dissertação de Mestrado Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Saúde Coletiva. Orientador: Prof Dr Kenio Costa Lima. Natal, 2011

3 3 Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia Dantas, Biblioteca Emanuelle Setorial Dayana de Odontologia Vieira. Profº Alberto Moreira Campos. Efeito in vitro da terapia fotodinâmica sobre bactérias orais em suspensão e na formação de biofilme: ensaio com azul de metileno e toluidina ativados por luz halógena.\ Emanuelle Dayana Vieira Dantas. Natal, RN, f. : il. Orientador: Prof. Dr. Kenio Costa Lima. Dissertação (Mestrado em Odontologia) Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. 1. Fotoquimioterapia Dissertação. 2. Halogenação Dissertação. 3. Azul de metileno Dissertação. 4. Cloreto de tolônio Dissertação. 5. Biofilmes - Dissertação Dissertação. 6. Cárie dentária. I. Lima, Kenio Costa. II. Título. RN/UF/BSO Black D17

4 4 Emanuelle Dayana Vieira Dantas EFEITO IN VITRO DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Saúde Coletiva. Aprovada em: / / BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Kenio Costa de Lima Orientador Profa. Dra Isauremi Vieira de Assunção Pinheiro Examinador Interno UFRN Prof. Dr. Marcos Antônio Japiassú Resende Montes Examinador Externo UPE

5 5 DEDICATÓRIA Aos meus pais, Jacinto Moreira Dantas e Sônia Maria Vieira Dantas, pelo amor incondicional e pelo esforço em tornar possível cada um dos meus sonhos. Obrigada por sempre acreditarem em mim! Todas as minhas conquistas sempre serão dedicadas a vocês... Amo muito!!! Aos meus irmãos, Emanuell e Ellyommany, pela amizade e pela certeza de saber que sempre poderei contar com vocês. Ao meu sobrinho, Emanuell Júnior, por me fazer conhecer uma nova forma de amor e por encher nossa família de alegria com a sua chegada. A Igor, meu amor e melhor amigo, pelo apoio, paciência, generosidade, e por tantas outras razões que não caberiam aqui em palavras, mas que foram essenciais ao longo desta jornada. Amo você!

6 6 AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao meu orientador, o Prof. Dr. Kenio Costa de Lima, pela amizade, ensinamentos e paciência ao longo deste trabalho. Agradeço a oportunidade de estar ao seu lado e poder aprender com você. Admiro sua competência, seu caráter e sua inquietude em busca de conhecimento. Sem dúvida, uma fonte de inspiração... Muito obrigada por tudo! À Prof a Dr a Elizabethe Cristina Fagundes de Souza, minha orientadora durante a iniciação científica e em parte deste curso de mestrado, pela contribuição em minha formação acadêmica, pelo desprendimento e por ter me permitido seguir em busca de novos anseios. Sempre lhe serei grata. Aos alunos de iniciação científica, Annie Karoline e Hugo Lopes, pela dedicação e empenho na etapa final deste trabalho. Meus sinceros agradecimentos!

7 7 AGRADECIMENTOS À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, na pessoa de sua Magnífica Reitora Prof a. Dr a. Ângela Maria Paiva Cruz; à Faculdade de Odontologia, na pessoa de seu chefe de departamento Prof. Dr. Antonio Ricardo Calazans e do coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Prof. Dr. Kenio Costa de Lima, pela participação desta conceituada instituição no meu crescimento profissional e pessoal. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa de mestrado. A todos os professores que integram o corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Odontologia da UFRN, pela contribuição acadêmica ao longo deste curso de mestrado. Às professoras Dra. Maria Celeste Nunes de Melo e Dra. Isauremi Vieira de Assunção Pinheiro, membros da banca de qualificação, pelas sugestões dadas para finalização deste trabalho. Aos secretários Sandra Abrantes de Souza e Lucas Soares de Araújo, pelo incentivo e inestimável ajuda. Às queridas Amanda, Ana e Isabel, pela colaboração constante durante os experimentos realizados no Laboratório de Microbiologia. Às bibliotecárias Mônica Reis e Cecília dos Santos, pelo auxílio dispensado para a organização deste trabalho. Aos colegas de turma, em especial a Ângela Medeiros, Camila Resende, Jônia Cybele e Neusa Sales, que trilharam comigo esse caminho, compartilhando angústias e alegrias. Às melhores amigas que alguém poderia ter, Adélia Danielli, Mércia Cunha, Saziane de Sá, Silvana Nobre, Sofia Mariz e Virgínia Helena, pelo apoio e incentivo constantes. Ao Sr. Ronaldo Martins e Sr a. Francilene Martins, meus sogros, por terem me acolhido como uma filha. E enfim, a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para concretização desta pesquisa. Meus sinceros agradecimentos.

8 8 O homem é do tamanho do seu sonho. - Fernando Pessoa

9 9 RESUMO A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido proposta como um método alternativo para o tratamento de doenças orais biofilme-dependentes, como a cárie dentária. Tal terapia consiste na ação simultânea de uma fonte luminosa (FL) e de um agente fotossensibilizante (FS), na presença de oxigênio tecidual, levando à produção de radicais livres que ao interagirem com componentes celulares bacterianos, promovem a morte celular. Este estudo tem como objetivo avaliar a ação antimicrobiana da TFD sobre bactérias orais em suspensão, bem como na formação de biofilmes mono e multiespécies, in vitro, a partir de uma cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e de amostras de saliva, respectivamente. Os corantes azul de metileno (CM) e azul de toluidina (CT) foram administrados na concentração de 100 mg/l e ativados por luz halógena (600 a 750 nm) proveniente de um aparelho fotopolimerizador modificado (Ultralux, Dabi Atlante, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil.). Suspensões monoespécies e mistas foram preparadas e submetidas a diferentes condições experimentais: 1. TFD na presença de CT; 2. TFD na presença de CM; 3. irradiação sem administração de qualquer corante; 4. sensibilização com CT e ausência de luz; 5. sensibilização com CM e ausência de luz; 6. ausência de irradiação e sem qualquer corante (controle negativo) e 7. administração de solução de digluconato de clorexidina a 0,12% (controle positivo) (Periogard, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA). A ação imediata e mediata da TFD sobre as suspensões bacterianas, bem como seu efeito sobre a formação de biofilme foram verificados, a partir do número de unidade formadoras de colônias por ml (UFC/mL) e de medidas de densidade ótica (DO). Os dados obtidos foram analisados estatisticamente através dos Testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, para o nível de significância de 5%. De acordo com os resultados, a TFD não apresentou ação antibacteriana sobre as suspensões de S. mutans, independente do corante utilizado. A TFD com CM ativado por luz halógena foi capaz de reduzir em 86,6% o número de UFC/mL diante de suspensões multiespécies, entretanto, tal redução não foi significativa (p > 0,05). A TFD apresentou efeito antibacteriano, mediato, sobre suspensões mistas, quer na presença de CT (p < 0,001) ou CM (p < 0,001), ativados por luz halógena. A TFD preveniu a formação de biofilme multiespécie, através da ativação de CT por luz halógena (p = 0,01). Conclui-se que a ativação dos corantes azul de toluidina e azul de metileno, pela luz halógena (TFD) apresentou ação antimicrobiana, frente a suspensões multiespécies preparadas a partir de amostras de saliva, ressaltando a possibilidade da utilização da terapia fotodinâmica como um método coadjuvante no tratamento de lesões de cárie dentária. Palavras-Chave: Terapia fotodinâmica. Luz halógena. Azul de metileno. Azul de toluidina. Bactérias orais. S. mutans. Cárie dentária.

10 10 ABSTRACT Photodynamic therapy (PDT) has been proposed as an alternative method for the treatment of biofilm-dependent oral diseases like dental caries. This therapy consists of simultaneous action of a visible light (L) and a photosensitizer (FS) in the presence of oxygen, which leads to production of different reactive oxygen species that can interact with the bacterial cell components, and promote cell death. This study aims to evaluate the antimicrobial action of PDT on oral bacteria in suspension, as well as the formation of mono and multi-species biofilms, in vitro, from a standard strain of Streptococcus mutans (ATCC 25175) and saliva samples, respectively. The dye methylene blue (MB) and toluidine blue (TB) were used at a concentration of 100 mg/ L and activated by halogen light (600 to 750 nm) from a modified hand held photopolymerizer (Ultralux, Dabi Atlante, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.). Planktonic cultures were prepared and submitted to different experimental conditions: 1. PDT using TB 2. PDT using MB, 3. L+ FS-, 4. TB + L - ; 5. MB+ L-; 6. L- FS- (negative control) and 7. administration of 0.12% chlorhexidine digluconate (positive control) (Periogard, Colgate-Palmolive Company, New York, USA). The immediate and mediated action of PDT on bacterial suspensions, as well as its effect on biofilm formation were observed from the number of colony-forming units per milliliter (CFU/mL) and measures optical density (OD). The data were statistically analyzed using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test for the significance level of 5%. According to the results, the PDT showed no antibacterial action on suspensions of S. mutans, regardless of the dye used. PDT with MB activated by halogen light was able to reduce 86.6% CFU/mL multi-species planktonic cultures, however, this reduction was not significant (p > 0.05). PDT showed antibacterial effect, mediate on multi-species planktonic cultures with TB (p < 0.001) and MB (p < 0.001), activated by halogen light. PDT was able to prevent the formation of multispecies biofilm, through the activation of TB by halogen light (p = 0.01). We conclude that activation of the dye toluidine blue and methylene blue, by halogen light (PDT) showed antimicrobial activity, compared to multispecies planktonic cultures prepared from saliva samples. Keywords: Photodynamic therapy. Halogen light. Methylene blue. Toluidine blue. Oral bacteria. S. mutans. Dental caries.

11 11 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo I Figura 2: Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo II Figura 3: Fórmula molecular do corante azul de metileno Figura 4: Fórmula molecular do corante azul de toluidina Figura 5: Esquema ilustrativo da obtenção de cultura a partir de uma cepa padrão de S. mutans Figura 6: Esquema ilustrativo da obtenção de culturas multiespécies, a partir de amostras de saliva Figura 7: Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado Figura 8: Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado, após remoção do filtro de onda Figura 9: Esquema ilustrativo da preparação das condições experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies Figura 10: Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito imediato da TFD Figura 11: Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD Figura 12: Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD na formação de biofilmes mono e multiespécies Figura 13: Fotografia demonstrando grande crescimento bacteriano Figura 14: Fotografia demonstrando ausência de crescimento bacteriano... 44

12 12 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica e significância estatística para cada condição testada. Natal, Tabela 2. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, Tabela 3. Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, Tabela 4. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de metileno. Natal, Tabela 5. Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans. Natal, Tabela 6. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de toluidina. Natal, Tabela 7. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, Tabela 8. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de metileno. Natal, Tabela 9. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de metileno. Natal, Tabela 10. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies, e significância estatística, com o corante azul de toluidina. Natal, Tabela 11. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies, e significância estatística, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, Tabela 12. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies e significância estatística, com o corante azul de metileno. Natal,

13 Tabela 13. Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies e significância estatística, utilizando o corante azul de metileno. Natal,

14 14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS FA - : ausência de fotoativação FS - : ausência de fotossensibilizante % : por cento FA + : sem fotoativação C: graus Celsius AlPcS2: fitalacionia dissulfonado de alumínio ATCC: American Type Culture Collection / Coleção de Culturas Americanas BHI : brain heart infusion / infusão cérebro coração CLX: clorexidina CM: corante azul de metileno CT: corante azul de orto-toluidina DNA: deoxyribonucleic acid / ácido desoxirribonucleico DO: densidade ótica ERO: espécies reativas de oxigênio FA: fotoativação FL: fonte luminosa FS: fotossensibilizante h: hora LED: light emmiting diode /diodo emissor de luz M: meio puro mg/l: miligrama por litro ml: mililitro mw/cm2: miliwatt por centímetro quadrado nm: nanometro PPgO: Programa de Pós-graduação em Odontologia Q : quartis 25 e 75 RPM: rotações por minuto

15 15 S. mutans: Streptococcus mutans SPSS: Statistical Package for Social Sciences / Programa Estatístico para Ciências Socias TFD: terapia fotodinâmica UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte Zn: zinco µl: microlitro

16 16 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Formação de biofilmes dentários e sua relação com a cárie Cárie dentária e sua abordagem terapêutica menos invasiva Terapia Fotodinâmica Substâncias fotossensíveis Corantes fenotiazínicos Fontes de luz Perspectivas de aplicação da TFD na Odontologia OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Tipo do estudo Ensaios in vitro Linhagem bacteriana padrão Preparo das suspensões de S. mutans Obtenção de amostras de saliva estimulada Substâncias fotossensibilizantes e fonte luminosa Preparação das placas Terapia Fotodinâmica Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica Avaliação do efeito mediato da terapia fotodinâmica Avaliação do efeito da TFD na formação de biofilmes mono e multiespécie Análise estatística RESULTADOS Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de toluidina Suspensões multiespécies Suspensões de S. mutans Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de metileno Suspensões multiespécies Suspensões de S. mutans Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de toluidina Análise a partir da contagem do número de UFC/mL Análise a partir da densidade ótica Influência dos produtos testados sobre a densidade ótica do meio de cultura puro Suspensões multiespécies Suspensões de S. mutans Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de metileno Análise a partir da densidade ótica... 48

17 Suspensões multiespécies Suspensões de S. mutans Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de biofilme com utilização do corante azul de toluidina Análise a partir da contagem do número de UFC/mL Análise a partir da densidade ótica Suspensões multiespécies Suspensões de S. mutans Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de biofilme, com utilização do corante azul de metileno Análise a partir da densidade ótica Suspensões multiespécies Suspensões de S. mutans DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS

18 18 1. INTRODUÇÃO A terapia fotodinâmica consiste em um processo fotoquímico, no qual uma substância fotossensibilizante (FS) é ativada pela exposição a uma luz, de comprimento de onda específico, na presença do oxigênio 26. Após ativação, componentes moleculares da FS transferem energia para o oxigênio tecidual, ocasionando a produção de formas iônicas altamente reativas, capazes de promover oxidação de componentes essenciais à célula bacteriana, levando à morte celular 50;57. A terapia fotodinâmica tem sido estudada há mais de 100 anos, desde que a morte de um microrganismo unicelular foi observada por Oscar Raab 41, em consequência da aplicação de um corante associado a uma fonte luminosa. A partir da década de 70, seu uso clínico passou a ser difundido na área médica devido aos bons resultados terapêuticos frente a diferentes tipos de câncer, além de desordens oftalmológicas e dermatológicas 24. Desde a década de 90, o interesse pelo efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica tem crescido e sua aplicação no tratamento de infecções localizadas tem sido proposta 7. Nesse contexto, pesquisas envolvendo o desenvolvimento de terapias antimicrobianas alternativas, como a fitoterapia e a TFD, têm sido conduzidas. Uma das razões para justificar o desenvolvimento de tais terapias tem sido o gradativo aumento da resistência de inúmeras espécies bacterianas frente às terapias convencionais, pautadas basicamente no uso de antibióticos 25. A terapia fotodinâmica apresenta algumas vantagens frente à utilização dos antimicrobianos químicos usuais: sua ação está confinada ao local de aplicação, restrita à área de interesse; apresenta baixo risco de ocorrência de resistência bacteriana, devido ao curto período de tempo necessário para causar dano ou morte à célula bacteriana; é seletiva às células-alvo, diminuindo o risco de lesar células do hospedeiro; e ainda não há relatos de ocorrência de reações sistêmicas, mesmo após repetições de sua aplicação 29. No campo de pesquisas da Odontologia, a terapia fotodinâmica é relativamente recente e tem sido investigada no tratamento das infecções orais mais prevalentes: a cárie dentária, as doenças periodontais e infecções do canal radicular 53;55.Os resultados obtidos em alguns trabalhos mostram seu efeito antibacteriano, in vitro, frente a S. mutans 1 ; S. sobrinus 59 e lactobacilos 19. P.

19 19 gingivalis 28 e F. nucleatum 43, além de E. faecalis 48, patógenos frequentemente envolvidos no desenvolvimento de infecções orais. Diante disso, a terapia fotodinâmica poderia ser empregada como um método coadjuvante ao tratamento conservador de lesões de cárie dentária, devido à sua ação antibacteriana. Trata-se de um método não-invasivo, o que contribuiria sobremaneira para a diminuição da quantidade de tecido dentinário a ser removido, e conseqüentemente, preveniria o comprometimento do órgão pulpar 55. O aprimoramento do protocolo de aplicação da terapia fotodinâmica deve visar além de segurança e efetividade, fatores como praticidade e custo, para que sua adoção clínica seja viável. Logo, a utilização de aparelhos fotopolimerizadores, como fontes de irradiação de luz, tem sido experimentada e incentivada pelo fato destes equipamentos estarem usualmente presentes na prática odontológica clínica e em nível de saúde pública 38;21;6. Diante da grande variabilidade de metodologias descritas na literatura, ainda se faz necessária a realização de estudos in vitro que busquem avaliar o efeito TFD sobre bactérias orais, envolvidas com o desenvolvimento da cárie dentária, quer em suspensões, quer organizadas em biofilme. Tais estudos irão contribuir para a consolidação da terapia fotodinâmica como método coadjuvante ao tratamento da cárie dentária, e conseqüentemente, para preservação de um maior número de elementos dentários.

20 20 2. REVISÃO DE LITERATURA Com o intuito de tornar a revisão de literatura mais elucidativa, essa foi dividida, didaticamente, em três tópicos. O primeiro versará a respeito do biofilme dentário e seu papel na rede de causalidade da cárie; o segundo discorre sobre a cárie e a nova abordagem terapêutica em curso, menos invasiva Odontologia Minimamente Invasiva; e por fim, o terceiro, acerca da terapia fotodinâmica e sua aplicação na Odontologia, como um método coadjuvante no tratamento da cárie dentária, devido ao seu potencial antibacteriano. 2.1 Formação de biofilmes dentários e sua relação com a cárie A cavidade oral dos seres humanos é colonizada por uma grande diversidade de microrganismos: fungos, protozoários, vírus e em maior número, por bactérias 31. A manutenção desses microrganismos na cavidade é dependente da capacidade de se manterem aderidos a estruturas orais, diante do desafio imposto por fatores locais como a função salivar de limpeza; as ações de mastigação e de deglutição, além da descamação das superfícies mucosas 14. Nesse sentido, certas bactérias orais apresentam vantagens competitivas, principalmente, devido à sua capacidade de aderir seletivamente às superfícies dentárias, estruturas duras, que não sofrem descamação, favoráveis à formação e maturação do biofilme dentário 48. O termo biofilme é usado para descrever uma comunidade de microrganismos aderidos a uma superfície, encerrados em uma matriz extracelular e organizados em estrutura tridimensional 33. A formação do biofilme dentário se dá minutos após a limpeza das superfícies dos dentes, quando se inicia a deposição de uma camada acelular sobre o esmalte, denominada película adquirida 36. Componentes salivares e do fluido gengival (proteínas, glicoproteínas e lípidios), além de remanescentes celulares bacterianos são os principais constituintes da película, desempenhando papel determinante na colonização dos microrganismos pioneiros 8. Os estreptococos são os colonizadores iniciais, principalmente o S. mitis, S. sanguinis e S. oralis, os quais juntos, correspondem a cerca de 95% da

21 21 microbiota total inicial, a qual ainda se somam o Actinomyces spp., Haemophilus spp. e Neisseria spp. 14. A especificidade da colonização bacteriana nos estágios iniciais é mediada por interações físico-químicas entre moléculas presentes na superfície bacteriana e proteínas salivares adsorvidas no esmalte, as quais atuam como receptores no mecanismo de adesão bacteriana 15. O crescimento das bactérias pioneiras aderidas leva à formação de microcolônias distintas, que através de relações interbacterianas como coagregação, interações nutricionais e liberação de bacteriocinas, mediam a sucessão microbiana, contribuindo para o aumento da diversidade de espécies, até que uma comunidade clímax seja atingida 33. A formação, crescimento e maturação dos biofilmes dentários ocorrem de forma natural, logo após as superfícies dentárias serem limpas. Devido a relações metabólicas e competitivas, as bactérias constituintes do biofilme dentário conferem proteção frente à colonização do ambiente oral por microrganismos potencialmente patogênicos. A manutenção de níveis de saúde está intimamente relacionada à capacidade do indivíduo de controlar o acúmulo do biofilme sobre as superfícies dentárias 57. O surgimento de doenças, dentre elas a cárie dentária, ocorre quando um desequilíbrio é formado, predispondo à seleção de microrganismos patogênicos específicos. A cárie dentária é uma doença socialmente determinada, que se configura como o mais prevalente agravo à saúde bucal, acometendo indivíduos em todas as faixas etárias 35;38. Trata-se de uma doença crônica, progressiva e localizada, causada pela dissolução ácida dos tecidos duros do elemento dentário 39. Dentre os fatores que compõem a rede de causalidade da cárie, o biofilme dentário pode ser apontado como o fator etiológico primário 32. A produção de ácidos por microrganismos presentes no biofilme, a partir da degradação de carboidratos fermentáveis oriundos da dieta, é essencial para o processo de desmineralização da estrutura dentária 48. As frequentes quedas de ph levam à seleção de espécies bacterianas acidúricas e acidogências, dentre elas S. mutans e Lactobacillus casei, responsáveis, respectivamente, pela iniciação e propagação das lesões cariosas 13. Atualmente, novas abordagens terapêuticas vêm sendo propostas como métodos auxiliares no tratamento de doenças biofilme-dependentes, como a

22 22 cárie dentária, convencionalmente pautado na remoção mecânica e no controle químico do acúmulo de biofilme dentário. 2.2 Cárie dentária e sua abordagem terapêutica menos invasiva A cárie dentária é uma doença infecciosa causada por bactérias orais aderidas à superfície dos elementos dentários, que se não tratada, pode culminar na perda dentária 60. É sem dúvida a afecção oral mais pesquisada, tendo seu processo histopatológico bem fundamentado na literatura, sendo considerada como a mais prevalente dentre as doenças que acometem o meio ambiente oral 10. Embora dados apontem para a redução na prevalência de cárie dentária ao redor do mundo, essa ainda pode ser tida como um sério problema de saúde pública em populações menos favorecidas economicamente 35. Devido à complexa rede de causalidade que envolve a doença, o que se preconiza é que o controle da cárie dentária englobe desde ações de promoção à saúde e de prevenção dos agravos, como ações de recuperação, reabilitação e manutenção da saúde 3. O que nos parece ser bastante óbvio, na verdade, contrasta com a prática odontológica adotada tradicionalmente, pautada quase que exclusivamente no tratamento cirúrgico restaurador das lesões cariosas, e não da doença em si. Com o avanço das pesquisas que aprimoraram as técnicas restauradoras adesivas e, principalmente, no aprofundamento do conhecimento da doença e sua rede de causalidade, tendo como novo enfoque o processo saúde-doença que acomete o indivíduo, procedimentos restauradores menos invasivos vêm sendo adotados 5. Neste contexto, o conceito de Odontologia minimamente invasiva ou de mínima intervenção, baseia-se nos novos conhecimentos acerca do processo carioso, bem como no uso de materiais de proteção capazes de estimular a recuperação dos tecidos dentários e/ou de materiais restauradores adesivos, a fim de realizar uma abordagem preventiva e conservadora, na medida em que busca a paralisação da lesão, pautada na preservação da estrutura dentária sadia e do órgão pulpar 42;5. A paralisação da lesão cariosa seria possível, a partir da remoção do biofilme presente, dependendo da capacidade do complexo dentino-pulpar de recuperar-se, ativando o processo de deposição de dentina reparadora e

23 23 esclerótica 27. De acordo com Fejerskov e Kidd 14, a lesão pode ser paralisada pelo controle do biofilme presente. Logo, a remoção da dentina cariada, ao diminuir o número de microrganismos presentes no tecido dentinário, auxiliaria na interrupção da progressão da lesão. Quanto à sua estrutura química e morfológica, a lesão de cárie pode ser dividida em duas camadas distintas. A camada superficial, denominada camada infectada, é bastante desmineralizada, amolecida e com grande quantidade de bactérias. Localizada abaixo dessa, a camada afetada, apresenta-se mais endurecida, apenas parcialmente desmineralizada, com menor carga bacteriana. É constituída de fibras colágenas e ainda passível de sofrer o processo de remineralização 47. Daí, em situações clínicas que houvesse risco de exposição do tecido pulpar, a remoção apenas da camada superficial, infectada, com preservação da dentina afetada, proporcionaria uma maior proteção do órgão pulpar 16;22. Desde o início dos anos 90, muitos estudos vêm sendo realizados com o objetivo de propor técnicas capazes de eliminar ou reduzir ao máximo a carga microbiana na porção de dentina afetada remanescente, em lesões profundas de cárie, onde a remoção total do tecido cariado poderia levar á exposição pulpar 52. Nesse contexto, a realização de um maior número de estudos envolvendo a aplicação da terapia fotodinâmica ainda é necessária, a fim de consolidar sua abordagem preventiva na formação de biofilmes orais cariogênicos, bem como sua ação terapêutica na paralisação de lesões de cárie ativas, quer em estágios iniciais, como na lesão branca de esmalte, quer em estágios avançados, nos quais a remoção total do tecido cariado pode levar ao comprometimento do órgão pulpar Terapia fotodinâmica A terapia fotodinâmica, também denominada fotoquimioterapia ou fototerapia, representa uma promissora alternativa para o tratamento de algumas doenças. Os primeiros trabalhos publicados envolvendo o estudo da terapia fotodinâmica datam do início do século XX, quando Oscar Raab e Von

24 24 Tappeiner, através de seus experimentos, perceberam o efeito letal da associação do corante vermelho acridina e a luz solar sobre o protozoário causador da malária 41. Desde então, a TFD tem sido proposta como um método alternativo para algumas áreas da Medicina, como no diagnóstico e tratamento de determinados tipos de câncer 11 e de infecções virais, bacterianas e fúngicas, devido à sua ação antimicrobiana 26;4. No campo de pesquisas da Odontologia, a terapia fotodinâmica é relativamente recente e tem sido investigada como uma alternativa para o tratamento das infecções orais mais prevalentes: a cárie dentária, as doenças periodontais e infecções do canal radicular 53;55. De maneira geral, o mecanismo de ação da TFD é o mesmo, independentemente do tipo de células-alvo, quer sejam células tumorais, quer sejam microrganismos patogênicos. É decorrente da ação simultânea de um agente sensibilizante, também chamado de corante fotossensível, e de uma fonte de luz, na presença do oxigênio dos tecidos 21. Após irradiação, a molécula da FS absorve fótons de energia, passando a um primeiro estágio excitado singleto, altamente instável, podendo retornar ao estado fundamental, pela liberação de energia na forma de luz visível (fluorescência), ou por conversão interna de mesma multiplicidade, sendo convertida ao estado excitado tripleto, através de cruzamento intersistema. O estado tripleto, apesar de ser menos energético do que o estado singleto, possui tempo de vida longo, o bastante para permitir a interação da substância fotossensível com as moléculas vizinhas 23. A ação da terapia fotodinâmica, sobre as células-alvo, pode ocorrer a partir de dois mecanismos distintos, denominados: reação de Tipo I ou reação de Tipo II 24. Na primeira, o corante interage com o substrato, desencadeando a produção de radicais livres, os quais, posteriormente, irão reagir com o oxigênio molecular, produzindo espécies altamente reativas (Figura 1). Na segunda, o agente fotossensibilizante interage diretamente com a molécula de oxigênio, dando origem ao oxigênio singleto (Figura 2) 9. As espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas - superóxido, hidroxila, peróxido e oxigênio singleto são altamente instáveis e reativas, sendo responsáveis por causar danos às células-alvo, seja devido ao efeito lesivo sobre estruturas essenciais, como membrana plasmática e DNA, ou por

25 25 provocar alterações irreversíveis em atividades metabólicas, levando à morte celular 7. FIGURA 1 - Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo I. Fonte: Elaboração própria. FIGURA 2 - Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo II. Fonte: Elaboração própria.

26 26 Para que a reação fotoquímica ocorra, é necessário que o agente fotossensibilizante seja capaz de absorver a energia irradiada pela fonte de luminosa 57. Embora alguns componentes bacterianos apresentem tal capacidade, a grande maioria das bactérias orais não possui esses componentes, sendo indispensável o uso de fotossensibilizadores exógenos, para o sucesso da TFD Substâncias fotossensíveis Uma substância fotossensibilizante deve ser inócua aos tecidos; seus componentes em estado excitado devem apresentar tempo de vida suficiente para interagir com células vizinhas e com oxigênio molecular eficientemente; e ainda, deve apresentar alta absortividade, com picos de absorção próximos ao comprimento de onda da luz utilizada 26;21. Características inerentes a uma substância fotossensibilizante podem ser vistas no Quadro 1. QUADRO 1 - Resumo das propriedades requeridas para uma substância fotossensibilizante ideal PROPRIEDADES DE UM FOTOSSENSIBILIZANTE IDEAL Ser quimicamente puro e ter composição constante e conhecida Ter mínima toxicidade no escuro Seletividade às células-alvo Ser rapidamente eliminado do organismo Ser solúvel em água Facilidade de obtenção em escala industrial Características fotofísicas favoráveis Fonte: Bonnett 2.

27 27 O termo características fotofísicas favoráveis refere-se basicamente a duas características ideais para os agentes fotossensibilizantes, sendo a primeira, a capacidade de absorver luz na região de nm, faixa espectral conhecida como janela terapêutica, na qual devido aos maiores comprimentos de onda, há uma maior penetração do FS nos tecidos e, consequentemente, um maior efeito terapêutico 12. Comprimentos de onda abaixo dessa faixa sofrem maior espalhamento e podem ser absorvidas por cromóferos endógenos, diminuindo a penetração de luz, ao passo que comprimentos acima de 800 nm, além de serem absorvidas pela água, não possuem energia suficiente para produção de oxigênio singleto 49. A segunda característica fotofísica favorável seria uma alta reatividade foquímica, para que um alto rendimento do estado excitado tripleto seja alcançado, o qual deve possuir um tempo de vida longo para produzir outras espécies reativas de oxigênio, como o estado singleto 2. Em muitos estudos, uma grande variedade de agentes fotossensibilizantes tem sido empregada diante de microrganismos orais. O corante rosa-bengala 38 ; os derivados de fitalacionina, como fitalacionina dissulfonado alumínio (AlPcS 2 ) e fitalacionina catiônica com Zn (II) 54 ; porfirinas 23 ; verde de malaquita 40 ; além do azul de metileno e azul de orto-toluidina 61. Estes dois últimos são as substâncias fotossensíveis mais testadas, representantes do grupo dos corantes fenotiazínicos Corantes fenotiazínicos Os corantes fenotiazínicos são compostos catiônicos com estrutura fundamental composta por um anel aromático tricíclico planar, constituindo um sistema altamente conjugado, o qual funciona como o componente cromóforo destes corantes 44. Os compostos fenotiazínicos possuem propriedades adequadas para utilização na terapia fotodinâmica devido à sua intensa absorção de luz na região de nm, região espectral inserida na faixa que compreende a janela 18. Os corantes azul de metileno e azul de toluidina são representantes dos compostos fenotiazínicos e vêm sendo largamente empregados nas pesquisas envolvendo a TFD 37. Trata-se de compostos similares no tocante às suas

28 28 estruturas químicas (Figuras 3 e 4) e propriedades físico-químicas 44. O pico de absorção de energia para cada um desses compostos pode ser observado no Quadro 2. FIGURA 3 - Fórmula molecular do corante azul de metileno Fonte: Soukos 44. FIGURA 4 - Fórmula molecular do corante azul de toluidina Fonte: Soukos 44. QUADRO 2 - Compostos fenotiazínicos mais utilizados, com seus respectivos picos de absorção de luz em nm. COMPOSTOS FENOTIZÍNICOS Fonte: Gonçalves 21. PICO DE ABSORÇÃO DE LUZ (nm) Azul de metileno 660 Azul de toluidina 625

29 29 Grande parte da capacidade de uma substância atuar como agente sensibilizante é dependente de sua capacidade de absorver a luz no comprimento de onda complementar àquele emitido pela fonte de luz Fontes de luz Embora os lasers de baixa potência sejam, convencionalmente, utilizados como fonte de irradiação na TFD, o uso dos diodos emissores de luz (LED) tem se intensificado 19. Em parte, devido a certas propriedades dos LED que resultam em bandas de emissão mais largas, favorecendo a complementaridade com a substância fotossensível, e conseqüentemente, a absorção de energia luminosa por parte dessa 30;62. A maioria dos trabalhos ainda apresenta a associação da terapia fotodinâmica com lasers ou LED, entretanto, outras fontes luminosas têm sido testadas, como as lâmpadas de tungstênio 57 ou halogênio 38, o que reduz o custo da terapia, já que os equipamentos, tradicionalmente utilizados, apresentam alto valor de mercado. A terapia fotodinâmica, decorrente da associação entre o corante rosabengala e luz halógena, proveniente de um aparelho fotopolimerizador, apresentou atividade antimicrobiana, in vitro, frente a suspensões de S. mutans 38. Resultados semelhantes foram apresentados por Gonçalves 21, que observou uma redução percentual na viabilidade bacteriana de 99,5%, quando da associação do corante azul de metileno e luz halógena proveniente de um aparelho fotopolimerizador, frente a suspensões de S. mutans, in vitro. Além dos bons resultados obtidos, mediante o uso do aparelho fotopolimerizador, como fonte luminosa, sua utilização reduz os custos da terapia, na medida em que tal equipamento já se faz presente no conjunto de tecnologias duras da prática odontológica 38;21. Nesse sentido, a aquisição de um novo aparelho para realização da TFD não seria necessária, o que tornaria a técnica mais acessível, principalmente, em nível de setor público. De maneira geral, o efeito antimicrobiano da TFD sobre microrganismos orais envolvidos no processo carioso tem sido descrito na literatura, seja sobre culturas planctônicas 38;51;45, seja sobre bactérias organizadas em biofilmes 58;37;17;57;34.

30 Perspectivas de aplicação da TFD na Odontologia Pesquisas vêm sendo realizadas, visando à aplicação da Terapia Fotodinâmica em diferentes áreas da Odontologia como: Periodontia, Endodontia, Implantondontia e Cariologia 28;40;44;19. A consolidação da TFD na Odontologia, como método auxiliar no tratamento da cárie dentária, poderia contribuir na paralisação de inúmeras lesões, em razão de sua ação antimicrobiana sobre bactérias envolvidas no processo carioso, como o S. mutans 61. A interrupção da atividade de cárie, principalmente, no que diz respeito à progressão de lesões profundas, contribuiria para adoção de procedimentos menos invasivos, com consequente conservação de tecido dentário, adiando, ou mesmo, evitando a realização de métodos mais invasivos e onerosos, como o tratamento endodôntico e, mais importante, evitaria a perda dentária, nos casos em que a única medida terapêutica possível seria a exodontia, meramente, devido a limitações financeiras.

31 31 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral A presente pesquisa tem como objetivo avaliar o efeito in vitro da terapia fotodinâmica, com ativação por luz halógena, sobre bactérias orais em culturas planctônicas e na formação, de biofilmes mono e multiespécies, a partir de uma cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e de amostras de saliva, respectivamente. 3.2 Objetivos Específicos Avaliar a ação, in vitro, dos corantes azul de metileno e azul de ortotoluidina, na concentração de 100mg/L, sobre microrganismos orais em culturas planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies. Avaliar a ação, in vitro, da luz halógena, proveniente de um aparelho fotopolimerizador com espectros de emissão entre 600 e 750 nm, como fonte luminosa, sobre microrganismos orais em culturas planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies. Avaliar o efeito da TFD, in vitro, sobre microrganismos orais em culturas planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies, através da fotoativação do corante azul de metileno por luz halógena com espectro de emissão entre 600 e 750nm. Avaliar o efeito da TFD, in vitro, sobre microrganismos orais em culturas planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies, através da fotoativação do corante azul de toluidina por luz halógena com espectro de emissão entre 600 e 750nm.

32 32 4. MATERIAIS E MÉTODOS A avaliação da eficácia antimicrobiana da TFD foi realizada a partir de ensaios in vitro, nos quais foram utilizados os agentes fotossensibilizantes azul de metileno e azul de orto-toluidina, na concentração de 100mg/L. O aparelho fotopolimerizador Ultralux (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, Brasil) foi usado na reação de fotoativação. 4.1 Tipo do estudo Trata-se de um estudo experimental, in vitro, realizado no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, referente à Linha de Pesquisa Prevenção dos agravos à saúde bucal em sua expressão individual e coletiva, Área de concentração em Saúde Coletiva, Grupo de Estudos em Saúde Bucal, do Programa de Pós-Graduação em Odontologia/UFRN. 4.2 Ensaios in vitro A fase experimental foi dividida em duas etapas. A primeira foi realizada a fim de avaliar o efeito da terapia fotodinâmica sobre bactérias orais em culturas planctônicas, obtidas a partir de uma linhagem bacteriana de referência e de amostras de saliva. A segunda etapa teve como objetivo avaliar o efeito preventivo da terapia fotodinâmica, frente à formação de biofilmes mono e multiespécies, in vitro. Os ensaios foram realizados com a utilização de microplacas estéreis de poliestireno inerte de fundo chato, contendo 96 poços (Nunclon ; InterMed, Roskilde, Dinamarca), adaptado de Stepanovic Linhagem bacteriana padrão Na presente pesquisa foi utilizada uma amostra de referência para Streptococcus mutans (ATCC 25175), obtida mediante solicitação à Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro/RJ), a partir da qual culturas de células planctônicas e biofilmes monoespécies foram preparados.

33 Preparo das suspensões de S. mutans A partir do estoque, uma alíquota da cepa padrão foi semeada por esgotamento em placa de Petri contendo ágar Brain Heart Infusion (BHI), (DIFCO, Michigan, Estados Unidos) e incubada por 24 horas a 37º C, em microaerofilia. Passado o tempo de incubação, três colônias foram retiradas da placa e então repicadas para um tubo de ensaio contendo 2 ml de caldo BHI, suplementado com sacarose 10%. Após homogeneização, o tubo contendo o inóculo foi armazenado em estufa a 37 ºC, por 24 horas em microaerofilia (Figura 5). FIGURA 5 - Esquema ilustrativo da obtenção da cultura planctônica a partir de uma cepa padrão de S. mutans. Fonte: Elaboração própria Obtenção de amostras de saliva estimulada Nesta etapa experimental, três pesquisadores envolvidos no estudo tiveram sua saliva coletada. A estimulação foi feita através da mastigação de um tablete de parafina (Parafilm M Laboratory Film American National Can Chicago, IL.) por um minuto. Passado esse tempo, o pesquisador deglutiu toda a saliva e, em seguida, passou a expelir a saliva produzida em um Becker estéril,

34 34 durante 5 min. As amostras de saliva coletadas foram armazenadas no gelo durante o experimento (Figura 6). FIGURA 6 - Esquema ilustrativo da obtenção da culturas planctônicas mistas, a partir de amostras de saliva. Fonte: Elaboração própria Substâncias fotossensibilizantes e fonte luminosa As soluções contendo azul de metileno e azul de orto-toluidina foram obtidas a partir de diluições dos corantes em água destilada e mantidas no escuro até sua utilização. A concentração de 100mg/L foi testada para ambas substâncias fotossensibilizantes 1; 62. Com o propósito de tornar a técnica acessível clinicamente, em caso de sucesso in vitro, foi utilizada nesta metodologia a fotoativação por luz halógena, o aparelho fotopolimerizador de luz halógena Ultralux (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil), com potência entre 350 e 500 mw/cm² e filtro de luz capaz de produzir luz de comprimento de onda na faixa entre 400 e 500 nm. Para realização dos experimentos, o filtro de onda foi removido (Figuras 6 e 7), a fim de obter-se luz visível com comprimento de onda na faixa de 600 e 750nm, compatível com os corantes utilizados, mantendo-se, entretanto, o filtro para radiações infravermelho 21.

35 35 Figura 7 Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado. Fonte: Elaboração própria Figura 8 Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado, após remoção do filtro de onda. Fonte: Elaboração própria Preparação das placas Para cada suspensão bacteriana obtida foram preparados 05 grupos de comparação e 02 grupos experimentais relativos à terapia fotodinâmica propriamente dita: Controle positivo: 90 µl de solução de digluconato de clorexidina a 0,12% foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura em teste (S. mutans ou amostra de saliva, previamente preparadas). Controle negativo: suspensão contendo 990 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.

36 36 Controle (CT + FA - ): 90 µl de solução do corante azul de toluidina (100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura. Controle (CM + FA - ): 90 µl de solução do corante azul de metileno (100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura. Controle (FS - FA + ) : uma suspensão, contendo 990 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e 10 µl do inóculo. Terapia fotodinâmica (CT + FA + ): 90 µl de solução do corante azul de toluidina (100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura. Terapia fotodinâmica (CM + FA + ): 90 µl de solução do corante azul de metileno (100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura. Cada uma das sete condições experimentais preparadas, a partir de suspensões de células mono (S. mutans) e multiespécies (amostras de saliva), foram dispensadas em tubos de ensaio estéreis, perfazendo um volume total de 01 ml para cada tubo. Os tubos de ensaio foram agitados, para homogeneização das suspensões. Em seguida, 200 µl foram retirados de cada tubo e repicados para os poços da placa de microtitulação, em triplicata. A Figura 9 apresenta de maneira esquemática a preparação dos grupos experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies.

37 37 FIGURA 9 - Esquema ilustrativo da preparação das condições experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies. Fonte: Elaboração própria Terapia fotodinâmica Após preparação das placas, os poços destinados à terapia fotodinâmica foram irradiados. Como protocolo para aplicação da TFD, os corantes foram mantidos em contato com as suspensões microbianas durante 5 minutos, correspondendo ao tempo de pré-irradiação. Em seguida, realizou-se a fotoativação de cada poço por 60 segundos. Durante a irradiação, a ponteira do aparelho fotopolimerizador foi mantida em contato com a embocadura do poço, para evitar variação nessa distância. Um anteparo negro fosco foi utilizado para evitar o espalhamento de luz. Anteriormente à irradiação de cada placa, a intensidade de luz visível emitida pelo aparelho fotopolimerizador foi aferida, através de um radiômetro (Radiômetro RD-7, ECEL, Ribeirão Preto, SP, Brasil). O mesmo protocolo de fotoativação foi seguido para os grupos controle Fa + FS -, no quais o efeito da luz halógena foi verificado na ausência de qualquer corante.