Controle de qualidade em imuno-histoquímica: o modelo de detecção da oncoproteína C-erbB-2.

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1 LUCIANA DE OLIVEIRA LEANDRO Controle de qualidade em imuno-histoquímica: o modelo de detecção da oncoproteína C-erbB-2. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Infecções e Saúde Pública da Coordenação dos Institutos de Pesquisa da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientador: Prof. Dr. Venâncio Avancini Ferreira Alves SÃO PAULO 2004

2 LUCIANA DE OLIVEIRA LEANDRO Controle de qualidade em imuno-histoquímica: o modelo de detecção da oncoproteína C-erbB-2. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Infecções e Saúde Pública da Coordenação dos Institutos de Pesquisa da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientador: Prof. Dr. Venâncio Avancini Ferreira Alves SÃO PAULO 2004

3 ii FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pelo Centro Técnico de Documentação/GTIS/CPS/SES Óreprodução autorizada pelo autor Leandro, Luciana de Oliveira Controle de qualidade em imuno-histoquímica: o modelo de detecção da oncoproteína C-ERBB-2 / Luciana de Oliveira Leandro São Paulo, Dissertação (mestrado) - - Programa de Pós-Graduação em Infecções e Saúde Pública da Coordenação dos Institutos de Pesquisa da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientador: Venâncio Avancini Ferreira Alves 1. Imunohistoquímica 2. Controle de qualidade 3. Antígenos de neoplasias 4. Anticorpos / uso diagnóstico 5. Mama / patologia SES/CIP/CTD-034/04

4 iii LUCIANA DE OLIVEIRA LEANDRO CONTROLE DE QUALIDADE EM IMUNO-HISTOQUÍMICA: O MODELO DE DETECÇÃO DA ONCOPROTEÍNA C-erbB-2 MESTRADO COMISSÃO JULGADORA Dr. Venâncio Avancini Ferreira Alves Dra. Regina Maria Catarino Dra. Herminia Yohko Kanamura São Paulo, 24 de agosto de 2004.

5 iv Dedico este trabalho à minha família e ao Túlio, as pessoas mais importantes da minha vida.

6 v ESTE TRABALHO FOI REALIZADO NO LABORATÓRIO DE IMUNO-HISTOQUÍMICA DA DIVISÃO DE PATOLOGIA DO INSTITUTO ADOLFO LUTZ, SP, BRASIL.

7 vi Agradecimentos Ao Prof. Dr. Venâncio Avancini Ferreira Alves, meu orientador e peça chave na minha formação; A todos os patologistas que participaram voluntariamente deste trabalho e seus técnicos imuno-histoquímicos, que realizaram as reações; Às meninas da imuno do IAL: Telma, Cristina, Alda e Sueli, que além de toda ajuda durante os 5 anos de convivência, me ensinaram minha profissão e foram grandes amigas e incentivadoras; Ao Dr. Luis Fernando Ferraz, que me ajudou nas análises estatísticas, de fundamental importância no meu trabalho; À Biogen, em especial à Beth e ao Ignazio pelo fornecimento dos reagentes, pelo treinamento oferecido aos participantes do trabalho e pela longa espera dos resultados; Ao Dr. Túlio Geraldo de Souza e Souza, meu noivo, pela contribuição com as fotos e com o ombro amigo sempre necessário na parte final de um trabalho como este; Ao amigo Valter Ruvieri, que sempre esteve por perto e ajudou na formatação final deste trabalho; Aos amigos da Divisão de Patologia do IAL e a todos aqueles que desde o começo sempre me ofereceram ajuda. A todos, muito obrigada!

8 vii RESUMO A IHQ combinada com a análise morfológica forma, hoje, a base da classificação de vários tipos de tumores, exigindo cada vez mais a alta qualidade técnica dos laboratórios, cujo controle ainda requer o desenvolvimento de programas de avaliação e desenvolvimento de métodos de padronização. A IHQ é o teste mais comumente usado para análise de distúrbios na expressão de c-erbb-2, em carcinomas de mama. A variação das técnicas empregadas pelos laboratórios e a não uniformidade na interpretação dos resultados geram grande variabilidade nos resultados entre vários laboratórios. O uso do HercepTest, o único teste em IHQ aprovado pelo FDA como preditor de resposta para terapia específica tem aumentado após o desenvolvimento do Herceptin. Neste teste, de protocolo padronizado, a superexpressão do c-erbb-2 é avaliada usando uma escala graduada de 0 a 3+, interpretada como positivo (2 ou 3+), que correlaciona com resposta à terapia, ou negativo (0 ou 1+), não-responsivo nos ensaios de validação terapêutica do Herceptin. O presente estudo visa o desenvolvimento de ações programadas para incremento da qualidade dos laboratórios inscritos no programa de Controle de Qualidade do Clube de IHQ da SBP, utilizando o c-erbb-2 como marcador modelo, de um lado pela grande utilidade atual na avaliação prognóstica e na seleção terapêutica, e por outro, pela grande variabilidade de métodos e resultados oriundos de diversos centros. Onze laboratórios participaram do estudo preparando lâminas que redistribuímos para realizarem a detecção do c-erbb-2 habitual e, adicionalmente, seguindo o protocolo do sistema HercepTest. A coloração das lâminas foi semi-quantificada pelos patologistas de cada laboratório, seguindo o guia padronizado de graduação, e também por patologista especializada em mama, considerada aqui como padrão-ouro na avaliação. Notamos grande variação na escolha do protocolo de procedimento. Os resultados obtidos pela análise dos patologistas de cada laboratório, comparando a detecção convencional ao sistema HercepTest mostrou grau de concordância de 62,5%, sendo que somente 14,16% discordaram entre positivo e negativo. Comparando a análise feita pelo patologista com a análise padrão-ouro, o grau de concordância no método convencional foi de 54,16% e no HercepTest foi de 69,16%. Porém, em se tratando de indicação ao tratamento, a concordância aumenta consideravelmente, chegando a 82,5% na coloração convencional e 90,8% no HercepTest. O sistema HercepTest registrou maior concordância entre os resultados, porém sem significância estatística. A seleção de controles de positividade intermediária, utilizados por dois laboratórios, mostrou-se mais adequada para aferição da qualidade metodológica, detectando maior número de discrepâncias e menor grau de concordância entre as avaliações. Em suma, este trabalho expõe sistemática de análise para aferição da qualidade em IHQ em material proveniente de diferentes centros, sem o controle de fixação e dos procedimentos preliminares do espécime. A variação no protocolo da técnica convencional e a heterogênea experiência na maioria dos laboratórios com o uso do novo sistema HercepTest podem ser responsabilizadas pelo intermediário grau de concordância de resultados. A análise aponta para a necessidade de desenvolvimento de protocolos mais rígidos nos métodos de preparo de espécimes, nos protocolos de reação e nos critérios de semi-quantificação, especialmente nas análises dirigidas para seleção de agentes terapêuticos. Palavras chave: imunohistoquímica, controle de qualidade, antígenos de neoplasias, anticorpos / uso diagnóstico, mama / patologia.

9 viii ABSTRACT Since c-erbb-2/her-2 detection has become a prototype of IHC test for selection of therapy in mammary carcinoma, c-erbb-2 was chosen herein as a marker for testing strategies for an Inter-laboratorial Quality Control Program in the context of experienced IHC laboratories in Brazil. The present study aims at the development and critical assessment of programmed actions as tools for increment of the quality of laboratories involved in the program of Quality Control of the Club of Immunohistochemistry of Brazilian Society of Pathology. Eleven laboratories voluntarily adhered to our proposal, discussing the protocol of procedures for this work, prepared slides we codified and distributed for each lab, where detection of c-erbb-2 was performed and interpreted by each pathologist, according to routine procedures, in comparison to another set of slides from the same blocks performed under the protocol of the HercepTest System. Besides the comparison of the procedures and grading of staining scores among the participating laboratories, we added an independent assessment of all the slides from a professor of breast pathology, who had previously participated of the validation study of the HercepTest System conducted by FDA - USA, and was herein considered the gold-standard in the evaluation. The technical reports demonstrated a wide range in procedure protocol, mainly in the method of antigenic retrieval, clone and dilution of the primary antibody, as well as in amplification systems. Another focus of analysis were the control-slides - the majority of the laboratories uses controls with high degree of positivity, while only two laboratories selected controls of intermediate positivity, which, indeed, is a better approach for gauging of the quality of daily routine, most sensitive in detecting discrepancies, either due to staining procedures or to pathologists assessment of the scores. The grading of staining by the participating pathologists using conventional detecion with the HercepTest system showed 62.5% of absolute grade agreement, whereas discordance between positive and negative scores occurred in 14.16%. The full agreement of the scoring from the participating pathologists with the gold-standard assessment occurred in 54.16% of reports using conventional method, raising to 69,16% of samples prepared with HercepTest. This agreement was better when 2+ and 3+ scores were put together, considering the indication to treatment, achieving 82.5% with conventional staining and 90.8% with HercepTest. Although HercepTest was previously applied by only four of these eleven laboratories, the consistency of results was high even in these new users of this System. In short, this work shows the value of a systematic analysis for gauging of the quality in immunohistochemistry in material proceeding from different centers, from technical procedures to microscopical grading. The rate of inter-laboratorial agreement was found rather good, validating the present routine for drug selection. Even so, a wide range in the protocol of the conventional technique and the heterogeneous experience in the majority of the laboratories with the use of HercepTest system can be pointed as causes for the conditions where a disagreement was detected. The present study shows that using markers for quality assessment it is possible to detect several relevant points for improvement of consistency in results achieved in IHC, defining the need of more rigid protocols including methods of specimen preparation, IHC reaction and the criteria for quantitation or semi-quantitation results, especially in the context of selection of therapeutical agents. Keywords: immunohistochemistry, quality control, antigens/neoplasm, antibodies/ diagnostic use, breast/ pathology

10 ix LISTA DE ABREVIATURAS ABC ADCC CEPIAL CISH CSA DAB EGF EGFR ELISA EPOS EUA FDA FISH FMUFMG IHC / IHQ kda LSAB PCR RNA SBP Complexo avidina-biotina Citotoxicidade celular dependente de anticorpo Conselho de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz Hibridização in situ com cromógeno Amplificação por sinal catalisado 3 3 Diaminobenzidina (Sigma- Aldrich Co St Louis-USA) Fator de Crescimento Epidérmico Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico Ensaio imunoadsorvente enzima-associado Método direto polímero aumentado Estados Unidos da América Food and Drug Administration Hibridização in situ fluorescente Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais Imuno-histoquímica Kilo Dalton Estreptavidina biotina marcada Reação em cadeia da polimerase Ácido ribonucléico Sociedade Brasileira de Patologia

11 x LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Fotomicrografia IHQ em cortes de tecido mamário, representando a semiquantificação da reatividade específica do antígeno c-erbb-2. Aumento: 400x Figura 2 - Fotomicrografia IHQ em cortes de tecido mamário. Duas lâminas de mesmo material, a da esquerda corada pelo HercepTest e a da direita corada pelo método convencional, com anticorpo policlonal, pelo mesmo laboratório. Aumento: 400x (Ht) e 100x (Erb) Figura 3 - Concordância entre os resultados das análises das amostras preparadas convencionalmente ou pelo HercepTest pelos patologistas generalistas, em relação à análise considerada padrão-ouro Figura 4 - Concordância entre os patologistas generalistas e o padrão-ouro após re-classificação dos relatos como positivos versus negativos Figura 5 - Concordância entre o c-erbb-2 convencional e o HercepTest por lâmina de mesma origem Figura 6 - Concordância entre os escores atribuídos às lâminas de mesma origem e o padrão-ouro para o c-erbb-2 convencional e HercepTest considerando positividade e negatividade Figura 7 - Concordância de todas as lâminas entre o c-erbb-2 convencional e o HercepTest Figura 8 - Concordância entre as análises obtidas com as duas lâminas com menor reatividade ( f e j ) Figura 9 - Fotomicrografia - IHQ de duas lâminas de mesmo material mamário, coradas pelo HercepTest, por um laboratório experimentado (esquerda 400x) e por um laboratório não-experimentado em HercepTest (direita 100x) Figura 10 - Concordância entre positivos e negativos atribuídos pelos patologistas em desvio ao padrão-ouro Figura 11 - Concordância absoluta entre os experimentados e os não-experimentados em HercepTest... 44

12 xi LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Semi-quantificação da Reatividade Específica do Antígeno Tabela 2 - Informes do tratamento das lâminas pré-reação IHQ Tabela 3 - Protocolos de procedimento da técnica convencional para detecção da proteína c-erbb Tabela 4 - Resultados obtidos pela avaliação dos patologistas responsáveis pelo laboratório que corou as lâminas Tabela 5 - Concordância entre os anticorpos policlonal e monoclonal em relação ao HercepTest, separados por laboratório Tabela 6 - Resultados padrão-ouro comparados com a avaliação pelos patologistas generalistas Tabela 7 - Concordância entre avaliação dos Patologistas versus avaliação padrãoouro Tabela 8 - Concordância entre os patologistas generalistas e o padrão-ouro após re-classificação dos relatos como positivos versus negativos Tabela 9 - Concordância entre avaliação do laboratório que corou versus avaliação padrão-ouro (lâmina de origem) Tabela 10 - Valores médios e modais das lâminas de mesma origem

13 xii ÍNDICE I - INTRODUÇÃO... 1 I.1 - Aspectos Gerais Aplicações Atuais da Imuno-Histoquímica:... 1 I.2 - Fatores Essenciais em Programas de Controle de Qualidade em Imuno- Histoquímica:... 3 I.3 - Clube de Imuno-Histoquímica da Sociedade Brasileira de Patologia (SBP)... 6 I.4 - Carcinoma Mamário... 7 I.5 - Oncoproteína C-erbB-2/ HER-2/ neu... 8 I.5.a - Histórico e biologia do C-erbB-2/ HER-2/ neu... 8 I.5.b - O C-erbB-2 como fator prognóstico e preditivo... 9 I.5.c - Métodos de detecção do C-erbB I.5.d - Variação interobservador na avaliação do C-erbB II - JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS III - MATERIAL E MÉTODOS III.1 - Laboratórios Participantes III.2 - Obtenção das Lâminas III.3 - Reação Imuno-Histoquímica Efetuada pelos Laboratórios III.4 - Avaliação III.5 - Padrão-Ouro III.6 - Análise Estatística IV RESULTADOS IV.1 - Variação do Protocolo de Procedimento para Detecção do C-erbB-2 pelo Método Convencional IV.2 - Comparação dos Resultados Obtidos Conforme o Sistema de Detecção Mediante Análise de cada Patologista Participante (Concordância Inter-Métodos).. 28 IV.3 - Comparação dos Resultados Obtidos Conforme o Sistema de Detecção Mediante Análise por Patologista Especializada ( Padrão-Ouro ) em Comparação com as Análises pelos Patologistas Generalistas Participantes IV.4 - Variações Induzidas pelos Diferentes Protocolos Aplicados às Mesmas Lâminas IV.5 - Comparação das Análises Efetuadas pelos Patologistas Experimentados em HercepTest e Não-Experimentados em HercepTest V - DISCUSSÃO VI - CONCLUSÕES VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 56

14 Introdução 1 I - INTRODUÇÃO I.1 - Aspectos Gerais Aplicações Atuais da Imuno- Histoquímica: A imuno-histoquímica (IHQ) tem sido uma importante ferramenta em Patologia, especialmente nos diagnósticos de tumores. A detecção de painéis de antígenos para diferentes tipos de tumores tem aumentado a precisão dos diagnósticos, e muitas vezes permite análise do prognóstico de diversos tipos de neoplasias. O resultado combinado da análise morfológica e da IHQ forma, hoje, a base da classificação de vários grupos de tumores 1, tornando ainda mais necessária a alta-qualidade técnica dos laboratórios. A escolha de uma metodologia adequada é uma das grandes responsabilidades do laboratório. Hoje, a aplicação da IHQ à rotina diagnóstica já é uma realidade em muitos laboratórios no Brasil, tornando necessária a busca de instrumentos para assegurar a qualidade em cada etapa dos procedimentos. As principais indicações para o exame imuno-histoquímico 2 são:

15 Introdução 2 1.Diagnóstico histogenético de neoplasias indiferenciadas onde a persistência de antígenos de determinada linhagem celular, mesmo sem evidências morfológicas de diferenciação, tem contribuído para a seleção terapêutica, cada vez melhor dirigida à linhagem das células neoplásicas. 2.Sub-tipagem de neoplasias como linfomas, que têm a seleção terapêutica direcionada pela integração dos parâmetros clínicos, morfológicos e imunohistoquímicos. 3.Busca do sítio de origem de neoplasias nos casos de metástases de origem desconhecida. 4.Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas que permite detalhada correlação com manifestações clínicas. 5.Discriminação de natureza Benigna versus Maligna de algumas proliferações celulares, pois em situações especiais, o encontro de determinadas moléculas caracteriza um comportamento biológico não identificável em bases puramente morfológicas. 6.Avaliação prognóstica de neoplasias. Tendo como protótipo o carcinoma de ductos mamários, diversas neoplasias têm sua avaliação prognóstica complementada de modo importante pela detecção de receptores hormonais, de oncoproteínas e de fatores ligados à angiogênese e ao ciclo celular. 7.Identificação de antígenos de agentes infecciosos: nem sempre identificável à morfologia, em diversas situações, a natureza do agente é esclarecida pela detecção imuno-histoquímica de seus antígenos, aspecto de grande importância em infecções em imunossuprimidos.

16 Introdução 3 I.2 - Fatores Essenciais em Programas de Controle de Qualidade em Imuno-Histoquímica: A experiência de mais de duas décadas do laboratório de imunohistoquímica do Instituto Adolfo Lutz nos mostra a importância da análise de cada etapa para a garantia de qualidade dos procedimentos em IHQ. A obtenção, manuseio e o envio do espécime são fatores críticos. Sendo a fixação em formol a 10% e a inclusão em parafina o processamento histológico mais usado internacionalmente, Wick 3, Swanson et al. 4 propõem que seja este o procedimento-padrão para comparação de desempenho diagnóstico das reações imuno-histoquímicas. A quantidade de material a analisar tem sido discutida, especialmente neste tempo em que se espera que o patologista ofereça diagnósticos cada vez mais precisos em amostras cada vez menores. No dizer de Leong, este é, dentre vários outros, um importante fator que dificulta a quantificação de reatividades em IHQ 5. A seleção de metodologia mais adequada é uma das grandes responsabilidades do Laboratório de Imuno-histoquímica. O grande avanço da IHQ com os sistemas de recuperação de epítopos através do calor 6,7 e métodos de amplificação poderosos, como o uso de polímeros com múltiplas moléculas de anticorpos acoplados a enzimas (EPOS/ Envision) 8 e o método de deposição de produto de catalisação (CSA) de Bobrow et al. 9, adicionou um paradoxo à IHQ. De um lado, numerosos casos até então insolúveis pela negatividade para os vários painéis, tornaram-se marcáveis por anticorpos que passaram a permitir o diagnóstico preciso. Por outro lado, anticorpos que marcavam caracteristicamente determinadas neoplasias passaram a reagir inespecificamente em outras situações, como a actina muscular e as citoqueratinas 10. Preocupado com o que denominou a anarquia então introduzida, Swanson 10 propôs, recentemente, que nenhum método deva ser

17 Introdução 4 universalmente aplicável, devendo a escolha recair sobre a técnica que, na experiência do próprio laboratório, ou da escola seguida por seus patologistas, melhor tiver respondido à questão diagnóstica específica. Foi publicado pela Comissão Francesa de Controle de Qualidade em IHQ, em 1997, um relatório que demonstrava que duas das principais causas de erro diagnóstico em IHQ são a não utilização de técnicas de recuperação antigênica e o uso de métodos de amplificação pouco potentes, em particular aqueles com anticorpos secundários diretamente ligados à enzima 11. A execução dos procedimentos diretamente relacionados à reação requer conhecimento, experiência e atenção continuada de toda a equipe. Uma preocupação contínua é a qualidade dos reagentes. Enquanto as substâncias químicas dos tampões e substratos já têm sua produção plenamente regulamentada, ainda há polêmicas quanto aos anticorpos policlonais ou monoclonais, cruciais para a identificação específica dos antígenos característicos de cada entidade nosológica. A origem de cada anticorpo, o(s) real(is) sítio(s) antigênico(s) por ele reconhecido e seu desempenho em diversas condições laboratoriais, são fatores cuja padronização acarreta num dilema: a falta de regulamentação pode permitir o uso de reagentes de eficácia não comprovada, enquanto seu excesso pode inviabilizar o uso de numerosos reagentes já consagrados na prática diagnóstica 12. Tal polêmica foi, em parte, resolvida nos EUA, onde o órgão regulador, FDA (Food and Drug Administration), após grande polêmica, isentou-os de muitos pré-requisitos no registro pré-comercialização, viabilizando, inclusive, o uso de anticorpos home-made, desde que comprovado por relatórios técnicocientíficos sua afinidade específica para o antígeno proposto 12,13. Fica, desta forma, reconhecido o fato de serem os anticorpos, ainda que essenciais, apenas um dos componentes para a aplicação diagnóstica da IHQ, cuja

18 Introdução 5 segurança e eficiência depende também dos protocolos de reação e, em especial, da condição clínico-morfológica específica daquela aplicação. Uma vez preparada a lâmina, tem início a importante etapa de interpretação dos achados. A validação dos achados requer a verificação dos padrões de reatividade dos controles positivos e negativos, internos e externos, que também deve ser anotada no Livro de Protocolo. Os controles externos devem ser incluídos em cada painel, preparados a partir de amostras fixadas nas mesmas condições dos casos em teste, e não em condições superiores, que poderiam implicar em falsa segurança da validade da reação. É, ainda, necessária a atenção à reatividade de estruturas presentes na própria lâmina do caso em estudo que possam servir como controles positivos, como por exemplo a reatividade dos vasos para vimentina, marcadores musculares e endoteliais ou ductos mamários adjacentes a neoplasias para receptores de estrógeno e de progesterona. De modo análogo, estruturas sabidamente negativas para um marcador oferecem excelente controle negativo interno, já que foram submetidas ao mesmo tratamento que o tecido-teste A responsabilidade indelegável do médico-patologista quanto à interpretação reside especialmente em identificar quais células exibem reatividade para o antígeno, as alterações morfológicas nas células reativas, bem como a distribuição intracelular do antígeno, em comparação com os padrões já relatados na literatura para cada molécula 18, 19. Jensen et al. 18 e Rickert & Malanick 19 consideram a interpretação, juntamente com a seleção dos painéis de anticorpos, os fatores mais críticos referentes à qualidade diagnóstica em imuno-histoquímica, sendo fundamental o domínio dos perfis de reatividade antigênica mais comuns de cada tipo de neoplasia, bem como das expressões anômalas (exceções) mais conhecidas. Ressaltam, ainda, Jensen et al. 18 a importância de se valorizar mais as positividades que as negatividades para um diagnóstico individual.

19 Introdução 6 Em trabalho de auditoria técnica de desempenho de um laboratório de patologia cirúrgica de um hospital geral na Inglaterra, Prescott et al. 20 relataram que a interpretação errônea de lâminas foi responsável por 15,8% das discrepâncias diagnósticas em IHQ. I.3 - Clube de Imuno-Histoquímica da Sociedade Brasileira de Patologia (SBP) Desde janeiro de 1984 e, de modo mais organizado, a partir de 1994, representantes de vários laboratórios de Patologia participam ativamente de reuniões mensais do chamado Clube de Imuno-histoquímica da SBP, com o intuito de promover ações para aprimoramento da qualidade, com apresentação de casos, discussões técnico-científicas, e de trabalhos em andamento. Em sua missão de incentivo à melhoria dos laboratórios, o Clube desenvolve atualmente a implantação de um programa inter-laboratorial de aprimoramento da qualidade. Dentre as estratégias para o Programa de Controle de Qualidade expostas na literatura 18,21-23, destaca-se a proposta de distribuição de amostras para os laboratórios participantes efetuarem, segundo os protocolos aplicados em sua rotina diagnóstica, a pesquisa de alguns antígenos que sirvam como indicadores de qualidade da reação. Em trabalhos preliminares 24, já utilizamos as citoqueratinas como marcador de padrão epitelial, de grande valia na prática diagnóstica atual em tumores morfologicamente indiferenciados. Outro marcador utilizado como modelo preliminar foi o receptor de estrógeno, proteína nuclear responsável pela mediação dos efeitos do estrógeno no epitélio mamário. Além de

20 Introdução 7 apresentar um fator preditivo à resposta terapêutica, sua expressão tem correlação com o curso clínico dos carcinomas de mama 25. I.4 - Carcinoma Mamário Os carcinomas mamários estão entre as neoplasias malignas mais freqüentes nas mulheres e uma das principais causas de morte por câncer. Cerca de novos casos são diagnosticados nos EUA, com cerca de mortes por esse tipo de câncer 26. No Brasil, a neoplasia mamária é a que mais causa morte entre as mulheres. Segundo o Ministério da Saúde, dos novos casos de câncer que foram diagnosticados em 97, o de mama foi responsável por casos novos e óbitos 27. Em São Paulo, estudo recente mostrou que as neoplasias são responsáveis por cerca de 12% dos óbitos registrados na população adulta. Alguns dados colocam São Paulo entre os locais com taxas de câncer mais elevadas no mundo 28. Muitos dos fatores relacionados ao comportamento biológico do câncer de mama são determinados por técnicas avançadas, como citometria de fluxo, biologia molecular e IHQ, de onde é obtida a conduta mais adequada e a previsão do prognóstico 25. O exame anátomo-patológico é, hoje, o método de escolha para o diagnóstico e a avaliação prognóstica, caracterizando especialmente o tipo histológico, o grau de anaplasia, o estadiamento e oferecendo diversos outros parâmetros de grande utilidade. A amostra anátomo-patológica oferece adicionalmente a possibilidade da pesquisa de moléculas como proteína receptora de estrógeno, proteína receptora de progesterona e marcadores de proliferação celular 25.

21 Introdução 8 I.5 - Oncoproteína C-erbB-2/ HER-2/ neu I.5.a - Histórico e biologia do C-erbB-2/ HER-2/ neu A identificação de oncoproteínas, codificadas por oncogenes e detectadas através da IHQ, também pode ser útil como fator prognóstico do carcinoma de mama. Dentre as oncoproteínas, destaca-se o c-erbb-2. Também conhecido como HER-2 ou neu, é o segundo membro da família erbb de receptores tirosina-quinase trans-membrânicos tipo I, da qual pertencem também o c-erbb-1 (receptor de fator de crescimento epidérmico EGFR/HER- 1), o c-erbb-3 e o c-erbb-4 29,30. A superposição de nomes é decorrente de sua descoberta através de três linhas independentes de investigação: o oncogene neu foi identificado como um gene transformador em neuroblastomas em ratos fetais; c-erbb-2 e Her-2 são genes humanos identificados a partir de sua homologia com o gene v-erb-b de retrovírus da eritroblastose aviária. Estudos demonstraram que os três genes propostos apresentam plena homologia 31. Neste estudo será usado o termo c-erbb-2. O proto-oncogene c-erbb-2 está localizado na banda q21 do cromossomo 17 e codifica uma proteína receptora transmembranosa de 185kDa que possui uma seqüência de aminoácidos com atividade tirosinaquinase intracelular semelhante ao receptor de crescimento epidérmico, com a habilidade de autofosforilação e de fosforilar uma variedade de substratos exógenos artificiais 32, e atua como receptor de fator de crescimento. Além disso, está envolvido na diferenciação, adesão e motilidade do c-erbb-2 e a agressividade biológica nos carcinomas mamários O oncogene c-erbb foi primeiro identificado em Sua descoberta foi agilizada por estudos mostrando que pequenas quantidades do gene poderiam transformar células normais em linhagens neoplásicas 36. Sua ativação pode ser obtida através de ligante específico ainda não purificado, ativando-a através da

22 Introdução 9 formação de homodímeros (c-erbb-2/c-erbb-2). Pode também ser ativada pela formação de heterodímeros com a proteína c-erbb-1(c-erbb-2/c-erbb-1), cujos ligantes conhecidos são o EGF (Fator de Crescimento Epidérmico) ou o fator de crescimento tumoral a (TGF-a), bem como o c-erbb-3 e o c-erbb-4, cujos ligantes são os fatores de diferenciação neu ou heregulinas 31. Diante da demonstração que muitos receptores de fator de crescimento tinham também essa função, esses dados indicavam a hipótese de que o gene erbb era derivado de um gene de receptor de fator de crescimento. Essa teoria tinha que ser rapidamente revisada à luz da demonstração que o gene erbb tinha extensiva homologia com o gene do EGFR. Sabe-se que receptores de fator de crescimento podem agir como oncogenes. No caso do erbb, presume-se que o produto do oncogene está de alguma forma subvertendo alguma característica normal do mecanismo de ação do EGFR. A proteína do c-erbb-2 mantém uma grande deleção na região aminoterminal tal que somente 61 aminoácidos restam, comparados com os 622 normalmente encontrados no domínio externo do EGFR. Essas deleções removem regiões responsáveis pela regulação da atividade da quinase pelo EGF, causando produto do gene erbb ativo, o que converte o gene EGFR a um oncogene 32. O gene c-erbb-2 tem sua expressão muito elevada em muitos diferentes tipos de carcinomas humanos, incluindo mama, ovário, pulmão e cânceres gástricos e orais 37. A superexpressão protéica do c-erbb-2 na mama tem sido relatada em 40-60% dos carcinomas intra-ductais e em 20-30% dos carcinomas invasivos. Nos carcinomas mamários a superexpressão protéica está associada à amplificação gênica em 90% dos casos 38. I.5.b - O C-erbB-2 como fator prognóstico e preditivo Slamon et al. 39 foram os primeiros a demonstrar a amplificação do gene c-erbb-2 em 30% de 189 carcinomas mamários invasivos, e sua associação

23 Introdução 10 com prognóstico desfavorável. O c-erbb-2 tem demonstrado correlação com a sobrevida, indicando ser um fator de prognóstico ruim, especialmente em pacientes com metástases axilares 40,41. Recentemente, a detecção do c-erbb-2 se tornou mais importante após a aprovação pelo FDA do Herceptin (Trastuzumab, Genentech, San Francisco, CA, USA), que utilizado juntamente com a quimioterapia, pode diminuir a progressão tumoral do carcinoma mamário I.5.c - Métodos de detecção do C-erbB-2 Não há consenso de qual o melhor método para detectar a amplificação gênica e/ou superexpressão protéica do c-erbb Há grande variação nos dados publicados quanto a sistemas de graduação e de valores de corte utilizados. O c-erbb-2 pode ser mensurado de várias formas: 1) Superexpressão Protéica: através de IHQ em material congelado ou incluído em parafina, utilizando anticorpo monoclonal ou policlonal contra a proteína de 185kDa ou contra o produto fosforilado; através de ELISA ou por Western Blot. 2) Amplificação Gênica: através da hibridização por Southern Blot, PCR, FISH ou CISH. 3) RNA mensageiro através do Northern Blot 46. No uso do Southern Blot, a incidência média da amplificação, em 17 trabalhos, valendo-se desta técnica foi de aproximadamente 22%, em mais de 200 pacientes. Estes índices, entretanto, variaram de 10% a 34%, sendo tal variação atribuída, pelo menos em parte, a dificuldades tecnológicas Os resultados dos estudos realizados por Lacroix et al. 57, Tandon et al. 63 e Borg et al. 64 em Western Blot mostraram a média de 18,9% de superexpressão em 1135 carcinomas de mama. Tanto quanto o Southern Blot, esta técnica necessita de espécimes a fresco, mas está sujeito a variações e erros, resultantes da presença de células normais nos espécimes Por isso, outros métodos são utilizados para se medir a superexpressão do c-erbb-2 em carcinoma de mama.

24 Introdução 11 O FISH é a mais nova técnica utilizada para testar a alteração genética do c-erbb-2. Esta técnica mostrou ser superior a todas as outras metodologias acima citadas, testadas em material de c-erbb-2 amplificado, fixados em formol e embebidos em parafina. Esse método de análise é rápido, reprodutível e extremamente confiável na detecção da presença de c-erbb Porém, o teste mais comum usado para a análise de distúrbios na expressão de c-erbb-2 usa a IHQ em amostras de tumores fixados, imunocorando a proteína c-erbb-2 na membrana das células superficiais 46. Vários autores, utilizando esta técnica, demonstraram uma freqüência média de 19% de superexpressão em mais de pacientes Diversos estudos demonstraram que a sensibilidade da medida da superexpressão do c-erbb-2, através da IHQ é significativamente menor em tecidos fixados do que em tecidos frescos Apesar disso, este método é o de escolha para a medida da superexpressão do c-erbb-2, especialmente porque os espécimes fixados são de fácil obtenção e preparados rotineiramente. A IHQ tem vantagem sobre outras técnicas para avaliar a expressão do c-erbb-2 por ser uma técnica sensível e rápida, que usa poucos reagentes e requer equipamentos comumente encontrados na maioria dos laboratórios. Diversos anticorpos estão agora disponíveis para a detecção da proteína c-erbb-2. Os mais comuns utilizados na IHQ são os anticorpos policlonais c- erbb-2 (DakoCytomation, Carpinteria, CA, EUA) e 21N (NovoCastra Laboratories Ltd), e os monoclonais CB11 (Ventana Medical System s Pathway Her2), CNeu (Abcam Ltd) e CBE1 (Novocastra Laboratories Ltd). A incidência da coloração positiva da membrana das células tumorais nos diferentes anticorpos é de 33% (21N e CBE1) a 46% (c-erbb-2 e Cneu) 82. Nas linhagens celulares testadas por Bodrow et al. 82, o nível de expressão detectado com os diferentes anticorpos variou de acordo com o nível conhecido de expressão da proteína, porém algumas variabilidades foram observadas. Os anticorpos c-erbb-2 e Cneu foram os mais sensíveis e 21N e CB11 foram os menos sensíveis.

25 Introdução 12 Em estudo anterior comparando diferentes anticorpos, Press et al. 83 demonstraram que os anticorpos policlonais foram mais sensíveis do que os monoclonais, mas o anticorpo policlonal mais sensível testado detectou a superexpressão em somente 70% dos casos positivos. Oito dos anticorpos testados por ele detectaram menos de 30% da superexpressão e sete desses oito eram monoclonais, porém na maioria dos anticorpos a especificidade foi alta. O FDA aprovou, até o momento, dois testes de FISH comerciais para a detecção do c-erbb-2 (o Pathvision Her-2 probe Kit Visys Inc. Downers Grove, IL e o Inform Her-2/neu Test Ventana Inc. Tucson, EUA) e um teste para IHQ, o HercepTest - Dako, Carpinteria, EUA). Estes testes foram aprovados para seleção da Doxorubicina no painel quimioterápico adjuvante (Pathvision Her-2 probe Kit), determinação do prognóstico em pacientes linfonodo negativo (Inform Her-2/neu Test) e seleção de pacientes para tratamento com Trastuzumab (Herceptin ) 44. Baseado no conhecimento do papel do c-erbb-2 no desenvolvimento e progressão do carcinoma de mama, estratégias de interferência na expressão do c-erbb-2 têm mostrado valor terapêutico. O Trastuzumab, anticorpo monoclonal de camundongo mumab4d5, direcionado contra a região extracelular do c-erbb-2, provou ser um potente inibidor de crescimento de células de câncer de mama humano que expressam c-erbb-2, mas infelizmente, anticorpos de camundongos têm uso limitado em humanos devido a sua imunogenicidade. Para ser usado em investigação clínica humana, o mumab4d5 foi humanizado, humab4d5, contendo somente a parte ligante do anticorpo mumab4d5 e resíduos da estrutura da região variável humana e o domínio constante da IgG1. O humab4d5 tem potência comparada ao anticorpo murino no bloqueio da proliferação de células de tumor de mama, além de ser muito mais eficiente em resistir à citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) 84. O desenvolvimento do anticorpo monoclonal humanizado anti-c-erbb-2, também chamado Trastuzumab (Herceptin ; Genentech, San Francisco), direcionado sobre o receptor c-erbb-2 representa

26 Introdução 13 uma grande aquisição na pesquisa em câncer de mama, fazendo o Trastuzumab o primeiro agente biológico dirigido a uma molécula diretamente participante na patogênese da lesão a mostrar resultados clínicos favoráveis com diminuição da progressão do câncer de mama. Testes clínicos em pacientes c-erbb-2 positivos têm demonstrado que o uso combinado de terapia localizada com Herceptin com quimioterapia citotóxica está associado com o aumento de tempo de progressão da doença e total sobrevivência 85. A redução da expressão tumoral da oncoproteína c-erbb-2 na superfície da célula tumoral induzida por anticorpo, parece reverter partes das funções da célula neoplásica. O Herceptin pode também interferir mais diretamente no receptor do fator de crescimento sinalizando propriedades do sistema c-erbb-2, por alterar sinais transmitidos para o núcleo através da cascata tirosina-quinase. Outro possível mecanismo de ação consiste na observação que Herceptin é um potente ativador da ADCC 86. Determinar o grau de imuno-expressão de c-erbb-2 de carcinomas de mama é um pré-requisito para uso do Herceptin, o qual foi recentemente licenciado para tratamento de doença metastática 87. A reação imuno-histoquímica para a expressão do c-erbb-2 é o teste de rotina mais atrativo para avaliação, devido ao menor custo, facilidade técnica e relevância biológica 88. A IHQ detecta a superexpressão protéica do c-erbb-2 localizada na membrana citoplasmática de células tumorais. Com freqüência observa-se também coloração de citoplasma, que tem sido interpretada como artefato. Entretanto, após ativação dos receptores, há internalização e degradação do c-erbb-2 nos compartimentos lisossômicos, o que pode justificar tal coloração citoplasmática 89. Problemas com a variabilidade da coloração IHQ têm sido reportados, especialmente diferenças na sensibilidade e especificidade entre vários anticorpos comerciais disponíveis, na variação da interpretação das reações e artefatos de técnica. Desde o desenvolvimento da imunoterapia original usando Herceptin como o primeiro agente especificamente indicado para superexpressão de c-

27 Introdução 14 erbb-2 em carcinomas de mama metastático, tem-se interessado pelo uso do HercepTest como um preditor de resposta para tal terapia 90. O HercepTest (DakoCytomation, Carpinteria, CA, EUA) é um teste para detecção IHQ do c-erbb-2. Esse teste ajuda a determinar se um paciente com carcinoma de mama está qualificado para tratamento com Herceptin. A superexpressão do c-erbb-2 é avaliada usando uma escala graduada, a qual é interpretada como positiva ou negativa. Escores fortemente positivos (intensidade de coloração 3+) e fracamente positivos (intensidade de coloração 2+) correlacionam com resposta à terapia, enquanto escores negativos (intensidade de coloração 1+ e 0) mostravam-se não-responsivos nos ensaios de validação terapêutica do Herceptin. Esses resultados positivos ou negativos, em combinação com a história clínica dos pacientes e outros testes diagnósticos, auxiliam na classificação de células/tecidos anormais e fornece uma base para seleção de tratamento com Herceptin 91. I.5.d - Variação interobservador na avaliação do C-erbB-2 Alguns autores sugerem a IHQ como método de rastreamento inicial dos casos extremos de superexpressão, ou seja, 0 e 3+. Os resultados 1+ e 2+ são os que mais sofrem variabilidade interobservador e recomendam a realização do FISH antes de iniciar o tratamento com Trastuzumab Thomson et al. 92 analisaram a variação interobservador na graduação das reações IHQs para c-erbb-2 utilizando critérios bem definidos. Tal variação foi atribuída à heterogeneidade da coloração, artefatos de borda, artefatos de retração do estroma, coloração inespecífica do epitélio e estroma, coloração citoplasmática, colorações pseudomembranáceas e erros de observação. Outros autores mostraram que a análise utilizando imagens digitalizadas pode reduzir a variação interobservador 95. Há ainda equipamentos automatizados, disponíveis comercialmente, desenvolvidos para a leitura da

28 Introdução 15 reação IHQ do c-erbb-2, com a intenção de reduzir a variação interobservador 96. No entanto, a análise automatizada não distingue a positividade entre os componentes in situ e invasor. Embora Jacobs et al. 97 tenham relatado concordância dos resultados em 90/93 casos analisados por 2 laboratórios diferentes, utilizando o mesmo anticorpo, sem qualquer padronização entre as técnicas de IHQ e interpretação dos resultados, a variação das técnicas empregadas pelos laboratórios também é importante. A utilização de anticorpos monoclonais e policlonais diferentes, protocolos de recuperação antigênica e de amplificação das reações de IHQ diferentes, associados à não uniformidade na interpretação dos resultados geram grande variabilidade nos resultados entre vários laboratórios.

29 Justificativas e Objetivos 16 II - JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS As aplicações da IHQ têm se expandido nos últimos anos, adicionandose seu uso na avaliação prognóstica e seleção terapêutica à já consagrada aplicação com fins diagnósticos. Com essa mudança, é ainda mais necessária uma melhora na padronização, tanto nas etapas pré-analíticas como na analítica, para que os resultados de diferentes laboratórios sejam comparáveis 98. A partir da experiência do Laboratório de Imuno-histoquímica da Divisão de Patologia do Instituto Adolfo Lutz e dos conceitos atuais em Controle de Qualidade em Imuno-histoquímica, o presente projeto visa ao desenvolvimento de ações programadas para incremento da qualidade com: 1 - análise dos protocolos de procedimentos técnicos habitualmente em uso pelos laboratórios de IHQ; 2 - análise da concordância entre os resultados interlaboratoriais obtidos com a detecção do c-erbb-2 pelos métodos atualmente em uso nos laboratórios participantes e os obtidos pela padronização imposta pelo sistema HercepTest; 3 - análise da concordância entre os resultados das análises feitas pelos patologistas cirúrgicos generalistas e a re-análise das lâminas por patologista

30 Justificativas e Objetivos 17 mamária especializada, considerada padrão-ouro para as finalidades deste estudo; 4 - análise da concordância dos resultados obtidos na detecção do c- erbb-2 pelo sistema HercepTest entre os laboratórios que já utilizavam tal sistema e aqueles que apenas tiveram acesso a este sistema por ocasião deste trabalho; 5 - avaliação crítica sobre a informação gerada pelos indicadores de qualidade técnica, selecionados para o presente estudo nestes laboratórios, reconhecidos por sua excelência em IHQ em nosso meio; 6 considerações sobre a aplicabilidade dos critérios aqui usados no aprimoramento de programas de controle de qualidade em IHQ. Para tal será utilizado o c-erbb-2 como marcador modelo, devido, de um lado, à grande utilidade atual na avaliação prognóstica e na seleção terapêutica, e, de outro, na grande variabilidade de métodos e resultados oriundos de diversos centros.

31 Material e Métodos 18 III - MATERIAL E MÉTODOS III.1 - Laboratórios Participantes Os procedimentos foram realizados em onze laboratórios de reconhecida competência que já aderiram à proposta para o desenvolvimento conjunto de um Programa de Qualidade em IHQ pelo Clube de Imunohistoquímica da Sociedade Brasileira de Patologia: - Lab. de imuno-histoquímica Divisão de Patologia - Instituto Adolfo Lutz SES São Paulo - Laboratório Cardoso de Almeida São Paulo - Multipat Lab. de Anatomia Patológica, Citologia Diagnóstica e Patologia Molecular - Campinas - Lab. de imuno-histoquímica Departamento de Anatomia Patológica da Fac. de Ciências Médicas (UNICAMP) - CICAP Centro de imuno-histoquímica, Citopatologia e Anatomia Patológica Hosp. Alemão Oswaldo Cruz São Paulo - Centro de Patologia Oncótica Hospital A. C. Camargo São Paulo - CIP - Centro Integrado de Patologia Hospital Beneficência Portuguesa São Paulo - Laboratório Fleury São Paulo - Laboratório Salomão & Zoppi São Paulo - Laboratório Delboni Auriemo São Paulo - Faculdade de Odontologia de Piracicaba UNICAMP - Piracicaba

32 Material e Métodos 19 Os onze laboratórios preencheram formulário de procedimentos laboratoriais pré-estabelecido (Anexo A) com os seguintes informes: tipo de adesivo utilizado nas lâminas, tipo de navalha, fixador, tipo de recuperação antigênica, especificações dos anticorpos primário e secundário (clone, diluição, tempo e temperatura de incubação), método de amplificação e suas especificações (diluição, tempo e temperatura de incubação), cromógeno e contra-coloração. Todas as equipes dos laboratórios participantes são experientes e notoriamente competentes nos procedimentos imuno-histoquímicos convencionais. Com relação ao HercepTest, quatro laboratórios relataram experiência em seu uso, compondo, para a presente análise, o grupo experimentado em HercepTest, enquanto os outros sete não haviam usado anteriormente este sistema, compondo, aqui, o grupo não-experimentado em HercepTest. III.2 - Obtenção das Lâminas A cada laboratório participante (n=11) foi requerido que selecionasse um bloco de parafina do material positivo para antígeno c-erbb-2, utilizado habitualmente como controle de suas reações. A partir desse bloco, cada laboratório preparou 22 lâminas, as quais foram centralizadas na Divisão de Patologia do Instituto Adolfo Lutz, onde, visando a garantir o sigilo quanto a todos os resultados, foram codificadas com letras de a a l de acordo com o laboratório de origem, e redistribuídas a todos os 11 laboratórios, de modo que cada um recebeu 2 lâminas oriundas de cada laboratório, resultando em dois conjuntos iguais de onze lâminas, um deles submetido à pesquisa de c-erbb2 pelo método convencional em uso em cada local e outra preparada pelo sistema HercepTest (Anexo B). No total, foram preparadas e avaliadas 240 lâminas (o laboratório E não incluiu seu controle nas reações).

33 Material e Métodos 20 Cada médico patologista realizou uma primeira avaliação no conjunto de lâminas coradas em seu próprio laboratório, mantendo a codificação de sigilo das lâminas (letras de a a l). Retornadas, as lâminas receberam uma segunda letra, maiúscula e posicionada antes da anterior, agora identificando o laboratório que as corou. Assim, a primeira letra do código, maiúscula, representa o laboratório que realizou os testes de coloração e a segunda, minúscula, representa o laboratório de origem da lâmina, dono do material positivo utilizado. Todas as lâminas com final a, por exemplo, vieram do mesmo laboratório, portanto possuem o mesmo material (Aa, Ab, Ac...Ba, Bb, Bc...Ca, Cb, Cc...etc). III.3 - Reação Imuno-Histoquímica Efetuada pelos Laboratórios Cada conjunto de onze lâminas foi destinado a um tipo de coloração para detecção do antígeno c-erbb-2: a IHQ convencional e o método HercepTest. Na detecção convencional, cada laboratório seguiu seu protocolo de rotina, com material e anticorpo de uso rotineiro. Tal protocolo foi recolhido junto com as lâminas coradas para análise das variáveis. Para a detecção pelo método HercepTest, cada laboratório utilizou material oferecido pela Biogen Ltda, distribuidora do fabricante DakoCytomation, EUA. Dos onze laboratórios, somente quatro já utilizavam o sistema HercepTest para detecção da proteína c-erbb-2. Nos sete restantes, foi oferecido treinamento prévio, com pessoa especializada, oferecido também pela Biogen Ltda. Esta reação foi realizada por todos os laboratórios de acordo com o protocolo padrão de procedimento oferecido pelo fabricante do produto.

34 Material e Métodos 21 III.4 - Avaliação Tendo as lâminas sido submetidas aos dois testes em questão, o médico patologista responsável em cada laboratório atribuiu inicialmente os graus de reatividade das lâminas aí coradas, seguindo protocolo de avaliação definido pelo FDA EUA, detalhadamente explicado no Sistema HercepTest, como mostra a tabela 1 e a figura 1 abaixo. Tabela 1 - Semi-quantificação da Reatividade Específica do Antígeno Negativo Negativo Fracamente Positivo Fortemente Positivo Nenhuma coloração ou coloração de membrana observada em menos de 10% das células tumorais. Fraca coloração de membrana em mais de 10% das células tumorais. Apenas parte da membrana celular é corada. Padronização conforme proposta no Sistema HercepTest. Fraca a moderada coloração em toda a membrana celular em mais de 10% das células tumorais Moderada a forte coloração em toda a membrana celular em mais de 10% das células tumorais. Todos os participantes receberam, via correio eletrônico, tal roteiro padronizado da semi-quantificação, incluindo imagens fotográficas correspondentes aos escores.

35 Material e Métodos 22 0 = negativo 1+ = negativo 2+ = positivo 3+ = positivo Figura 1 - Fotomicrografia IHQ em cortes de tecido mamário, representando a semiquantificação da reatividade específica do antígeno c-erbb-2. Aumento: 400x. As lâminas coradas, acompanhadas do protocolo de reação convencional e planilha de avaliação com os graus de reatividade atribuídos pelos patologistas, foram recolhidos para análise comparativa dos resultados de coloração e interpretação. III.5 - Padrão-Ouro Para fins comparativos, todas as lâminas foram numeradas randomicamente de 1 a 240, sem a identificação do teste realizado, e enviadas à Profª. Helenice Gobbi, especialista em Patologia Mamária da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (FMUFMG), de notório saber na área e que participou, ao trabalhar no laboratório de Patologia

36 Material e Métodos 23 Mamária comandado pelo Professor David Page, no Departamento de Patologia da Universidade de Vanderbilt, Nashville, Tennessee, da equipe multi-institucional que validou o sistema HercepTest e a padronização de análise semi-quantitativa para o governo norte-americano (FDA). Sua avaliação, realizada em conjunto com o Dr. Agostinho Pinto Gouvêa, da FMUFMG foi considerada o padrão-ouro, para as finalidades do presente estudo. III.6 - Análise Estatística As imuno-detecções habituais na rotina diagnóstica em IHQ podem ser classificadas como positivas ou negativas, isto é, fornecem resultados binários, e o acordo pode ser apresentado numa tabela 2 X 2. Para avaliação IHQ semiquantitativa, como é o caso do c-erbb2, o método Kappa é o mais indicado, onde a concordância completa é indicada por um valor 1,0 e a total discordância por um valor Embora na literatura não haja valor de Kappa amplamente aceito que indique concordância suficiente, a classificação mais aceita é a de Landis & Koch 100, que sugeriram o seguinte protocolo: K< 0,4, fraca concordância; K de 0,4 a 0,6, concordância moderada; K de 0,6 a 0,8, concordância substancial, e; K> 0,8, concordância quase perfeita. Para medir o grau de concordância neste trabalho, o método Kappa foi realizado utilizando software disponível comercialmente, SPSS for Windows versão da SPSS inc., com intervalos de confiança de 95%. Foram realizadas análises de freqüência e concordância entre os laboratórios e entre cada laboratório e o padrão-ouro já citado. Para análise de correlação entre os valores de Kappa de cada um dos testes (c-erbb-2 e HercepTest ) foi usado o teste não paramétrico de Wilcoxon. Todos os testes estatísticos foram efetuados pelo do Dr. Luiz Fernando Ferraz, do Departamento de Patologia da FMUSP.

37 Material e Métodos 24 Mesmo este sendo um trabalho que não envolve pacientes e/ou medicamentos, foi submetido e aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz (CEPIAL).

38 Resultados 25 IV RESULTADOS Com exceção do laboratório E, que não corou seus próprios controles, todos os laboratórios devolveram todas as 11 lâminas de cada teste, 22 por laboratório (laboratório E = 20), em condições adequadas para seguirem o estudo. No total foram coradas 240 lâminas. IV.1 - Variação do Protocolo de Procedimento para Detecção do C-erbB-2 pelo Método Convencional Na tabela 2 estão os informes sumarizados do procedimento de preparo do material que precede a etapa da reação IHQ, também de importante valor para um bom resultado. Vemos que todos os laboratórios utilizam formalina a 10%, tamponada ou não, porém na maioria deles sem controle de tempo e temperatura de fixação, já que a grande parte do material a ser analisado é recebida já emblocado em parafina e, portanto, sem esse tipo de informação. Um laboratório não forneceu seus dados de protocolo e, portanto, foi excluído desta primeira análise. Todos os laboratórios já aderiram ao uso do silano (dietil-tri-etoxi-silano Sigma-Aldrich Co.) como adesivo na lâmina e de navalhas descartáveis para

39 Resultados 26 a obtenção dos cortes histológicos. O tempo para adesão das secções nas lâminas variou entre 20 minutos a 18 horas e a temperatura de desparafinização de 70 a 110º C. Tabela 2 - Informes do tratamento das lâminas pré-reação IHQ. Lab. Fixador Controle de tempo da fixação? Tratamento das lâminas Tipo de navalha Tempo e temperatura para adesão do corte A NF NF NF NF NF B C D E F G H I J L Formal. 10% tamponada Formal. 10% comum Formal. 10% comum Formal. 10% tamponada Formal. 10% tamponada Formal. 10% tamponada Formal. 10% comum Formal. 10% comum Formal. 10% tamponada Formal. 10% tamponada NF= não forneceu; S= sim; N= não N Silano Descartável 30 70º C N Silano Descartável 20 70º C N Silano Descartável 1h30 100º C N Silano Descartável 1h 110º C S Silano Descartável 60 70º C N Silano Descartável 24h 38º C N Silano Descartável 1h 110 º C S Silano Descartável 16h30 64ºC N Silano Descartável 30 60º C N Silano Descartável 18h 56º C Já na etapa da reação propriamente dita (tabela 3), todos os laboratórios participantes efetuaram técnicas de recuperação antigênica baseadas em exposição ao calor. As principais diferenças encontradas no protocolo de reação de cada laboratório foram que, quatro laboratórios utilizaram panela de pressão, quatro usaram panela a vapor e dois laboratórios utilizaram microondas.

40 Resultados 27 O anticorpo primário usado por seis laboratórios foi o policlonal c-erbb-2 DakoCytomation, enquanto o monoclonal CB11 da Novocastra Laboratories Ltd foi aplicado por quatro laboratórios. A diluição do anticorpo primário também foi muito variável. Para o anticorpo policlonal da DakoCytomation, as diluições variaram de 1/200 a 1/600. Os quatro laboratórios que utilizaram o clone CB11, da NovoCastra, usaram diluições de 1/25 a 1/1000. Tabela 3 - Protocolos de procedimento da técnica convencional para detecção da proteína c-erbb-2. Lab Recuperação Antigênica Anticorpo Primário clones Diluição Tempo e temperatura de incubação Amplificação Cromógeno A NF NF NF NF NF NF B PV poli 1: min-ta LSAB DAB C PV poli 1:200 18hs-4ºC StreptABC DAB D PP poli 1:600 18hs-4ºC LSAB DAB E PV poli 1:300 18hs-4/8ºC ENVISION DAB F PP CB11 1: hs-4ºC LSAB DAB G PP CB11 1:300 18hs-4ºC LSAB DAB H PV poli 1:300 18hs-4ºC ENVISION DAB I MO CB11 1:25 18hs-TA* LSAB DAB J PP poli 1:200 18hs-4ºC StreptABC DAB L MO CB11 1:200 18hs-4ºC StreptABC DAB PP-panela de pressão; PV-panela a vapor; MO-micro-ondas; DAB-diaminobenzidina; StrepABC Complexo estreptavidina-biotina-peroxidase; LSAB Labelled Streptavidina-biotina; TA temperatura ambiente; TA* - 3 horas a 37ºC e o restante a temperatura ambiente; NF não forneceu

41 Resultados 28 O método de amplificação também variou entre o uso dos kits ABC Duet (DakoCytomation, Carpinteria, CA, EUA) - três laboratórios, o LSAB (DakoCytomation, Carpinteria, CA, EUA) - cinco laboratórios e o Envision (DakoCytomation, Carpinteria, CA, EUA) - dois laboratórios. As diluições do ABC Duet variaram de 1/200 a 1/500. Os outros amplificadores são disponíveis comercialmente pré-diluídos e prontos para uso. Como podemos ver, somente dois tipos de anticorpos primários foram utilizados pelos laboratórios, o policlonal da DakoCytomation e o monoclonal CB11 da NovoCastra Laboratories. IV.2 - Comparação dos Resultados Obtidos Conforme o Sistema de Detecção Mediante Análise de cada Patologista Participante (Concordância Inter-Métodos) As planilhas recebidas com a avaliação de cada patologista foram fundidas e estão expostas na tabela 4. Na linha horizontal da tabela podemos observar a variação na intensidade de coloração, dada pelo patologista responsável de cada laboratório, independente do material corado. Notamos que o laboratório H manteve o padrão de coloração intensamente positivo para todas as lâminas, enquanto o laboratório C variou de 0 a 3+ para as mesmas lâminas.

42 Resultados 29 Tabela 4 - Resultados obtidos pela avaliação dos patologistas responsáveis pelo laboratório que corou as lâminas. Laboratório que corou Laboratório de origem a b c d e f g h i j l erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht A B C D E F G H I J L erb coloração convencional; Ht HercepTest ; 0, 1, 2 e 3 - escores em cruzes. A porcentagem de concordância absoluta entre o HercepTest e o c- erbb-2 convencional foi de 62,5%, ou seja, 75 dos 120 pares de lâminas (uma de cada teste) tiveram o mesmo escore. Dos 45 pares discordantes (37,5%), 17 (14,16%) discordaram entre positivo e negativo (10 positivos mediante método convencional e negativos mediante HercepTest e 7 negativos mediante método convencional e positivo mediante HercepTest ). Nove casos (7,5%) receberam avaliação discordante em mais de 1+ de diferença (7 positivos mediante método convencional e negativos mediante HercepTest e 2 negativos mediante método convencional e positivos mediante HercepTest ).

43 Resultados 30 Ht Erb Figura 2 - Fotomicrografia IHQ em cortes de tecido mamário. Duas lâminas de mesmo material, a da esquerda corada pelo HercepTest e a da direita corada pelo método convencional, com anticorpo policlonal, pelo mesmo laboratório. Aumento: 400x (Ht) e 100x (Erb). Quando comparamos a avaliação feita para o HercepTest com a avaliação das mesmas lâminas coradas pelo anticorpo policlonal (figura 2), temos um índice de concordância absoluta de 69,23%, atingindo 92,30% de concordância nos escores agrupados em positivos e negativos. Comparando as lâminas coradas utilizando o anticorpo monoclonal com as mesmas coradas pelo HercepTest, temos concordância absoluta de 50,00% e concordância de 70,45% entre positivos e negativos. Assim, o anticorpo policlonal tem maior índice de concordância com o HercepTest utilizado em nosso estudo, como mostra a tabela 5. que o anticorpo monoclonal A panela de pressão foi usada tanto na recuperação antigênica na detecção com anticorpo monoclonal quanto no uso do anticorpo policlonal. A panela a vapor foi utilizada somente em anticorpo policlonal e o microondas foi utilizado na recuperação para uso do anticorpo monoclonal. Notamos que nestes dois laboratórios que usaram microondas, o anticorpo monoclonal foi mais concentrado (1/25 e 1/200). Maiores diluições dos anticorpos mostraramse eficientes quando usada recuperação em panela de pressão (1/600 e 1/1000). A menor variação entre as concentrações dos anticorpos foi obtida

44 Resultados 31 em laboratórios que usaram a panela de pressão em sua recuperação, com concentrações intermediárias (de 1/200 a 1/500). Tabela 5 - Concordância entre os anticorpos policlonal e monoclonal em relação ao HercepTest, separados por laboratório. POLICLONAIS Concordância absoluta Positivo X negativo MONOCLONAIS Concordância absoluta Positivo X negativo B 10/11 90,90% 11/11 100,00% F 9/11 81,81% 10/11 90,90% C 3/11 27,27% 8/11 72,72% G 6/11 54,54% 10/11 90,90% D 5/11 46,46% 9/11 81,81% I 1/11 9,09% 4/11 36,36% E 8/10 80,00% 10/10 100,00% L 6/11 54,54% 7/11 64,64% H 11/11 100,00% 11/11 100,00% J 8/11 72,72% 11/11 100,00% TOTAL 45/65 69,23% 60/65 92,30% TOTAL 22/44 50,00% 31/44 70,45% Mesmo com maior homogeneidade na utilização dos sistemas de amplificação nos laboratórios que usaram anticorpo monoclonal (3 dos 4 usaram LSAB), os que usaram anticorpos policlonais (2 LSAB, 2 StrepABC e 2 Envision) tiveram maior índice de concordância, com menor variação de concentração do anticorpo primário. Assim, resultados mais concordantes, comparados ao HercepTest, foram obtidos por laboratórios que usaram anticorpo policlonal com uso de panela de pressão ou panela a vapor na recuperação antigênica. Não foi notada nenhuma diferença nos sistemas de amplificação, pois os três utilizados tiveram bom desempenho.

45 Resultados 32 IV.3 - Comparação dos Resultados Obtidos Conforme o Sistema de Detecção Mediante Análise por Patologista Especializada ( Padrão-Ouro ) em Comparação com as Análises pelos Patologistas Generalistas Participantes A comparação dos escores atribuídos a cada reação pelos patologistas participantes com o resultado aqui convencionado como padrão-ouro é apresentada na tabela 6. A concordância dos escores atribuídos pelos patologistas e o padrãoouro para os dois métodos foi de 67,5% (162/240). Tal concordância foi de 54,16% (65/120) nas lâminas preparadas pelo método convencional e de 69,16% (83/120) naquelas preparadas pelo sistema HercepTest. Tabela 6 - Resultados padrão-ouro comparados com a avaliação pelos patologistas generalistas. Laboratório que corou Laboratório de origem a b c d e f g h i j l erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht erb Ht LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH LH A B C D E F G H I J L erb coloração convencional; Ht HercepTest ; L escores pelos patologistas; H escores padrão-ouro; 0, 1, 2 e 3 - escores em cruzes.

46 Resultados 33 A tabela 7 mostra a concordância entre o conjunto de valores atribuídos pelos patologistas participantes e o padrão-ouro para as colorações realizadas em cada laboratório. A análise dos resultados mostrou que não há diferenças intralaboratoriais significativas, comparadas ao padrão-ouro, entre a coloração convencional e o HercepTest, exceto nos Patologistas E e L, onde houve maior concordância entre os resultados obtidos pela reação com HercepTest, com média muito superior aos resultados obtidos pela coloração convencional (figura 3). Quatro patologistas apresentaram maior índice de concordância nas amostras submetidas à reação pelo c-erbb-2 convencional (Patologistas A, C, D e F), e 7 Patologistas (B, E, G, H, I, J e L) concordaram mais nas amostras submetidas à reação pelo HercepTest (figura 3). Tabela 7 - Concordância entre avaliação dos Patologistas versus avaliação padrão-ouro. Patologistas A B C D E F G H I J L Total Lâminas de c- erbb-2 convencional 9/11 81,81% 5/11 46,46% 6/11 54,54% 9/11 81,81% 3/10 30,00% 11/11 100% 9/11 81,81% 7/11 64,64% 0/11 0% 3/11 27,27% 5/11 46,46% 65/120 54,16% Lâminas de HercepTest 8/11 72,72% 7/11 64,64% 5/11 46,46% 7/11 63,63% 9/10 90,00% 8/11 72,72% 10/11 90,90% 9/11 81,81% 2/11 18,18% 8/11 72,72% 10/11 90,90% 83/120 69,16%

47 Resultados 34 Figura 3 - Concordância entre os resultados das análises das amostras preparadas convencionalmente ou pelo HercepTest pelos patologistas generalistas, em relação à análise considerada padrão-ouro. Os valores de Kappa variaram entre 0, nenhuma concordância (Patologista I), e 1,0, total concordância (Patologista F), com valor mediano de 0,5636 para o c-erbb-2. Para a coloração pelo HercepTest, os valores de Kappa variaram entre 0,2 (Patologista I) e 0,9 (Patologistas G e L), com valor mediano de 0,6982. Portanto, o Patologista I foi o que apresentou menor concordância entre os resultados, tanto para o c-erbb-2 convencional quanto para o HercepTest. Os Patologistas A, D, F e G foram os mais concordantes na avaliação das colorações. Quando consideramos somente os índices agrupados, indicando positividade (2+ e 3+) e negatividade (0 e 1+), vemos que as concordâncias aumentam consideravelmente entre os dois testes e entre os patologistas. As porcentagens de concordância chegam a 82,5% para o c-erbb-2 convencional e 90,8% para o HercepTest, como vemos na tabela 8.

48 Resultados 35 Tabela 8 - Concordância entre os patologistas generalistas e o padrão-ouro após reclassificação dos relatos como positivos versus negativos. Graduação c-erbb-2 conv HercepTest Positivo (2 e 3+) Negativo (0 e 1+) concordância discordância 89/120 (74,16%) 10/120 (8,33%) 99/120 (82,50%) 21/120 (17,50%) 96/120 (80,00%) 13/120 (10,83%) 109/120 (90,83%) 11/120 (9,16%) As análises relatadas por todos os patologistas possuem altos índices de concordância na avaliação da positividade versus negatividade, com valores de kappa iguais a 0,8240 e 0,9083 para o c-erbb-2 convencional e o HercepTest respectivamente. Somente o Patologista I apresentou menor concordância, com kappa igual a 0,36 para o c-erbb-2 convencional e 0,55 para o HercepTest (figura 4).

49 Resultados 36 Figura 4 - Concordância entre os patologistas generalistas e o padrão-ouro após reclassificação dos relatos como positivos versus negativos. A concordância absoluta entre os resultados obtidos mediante os dois métodos, somente pela avaliação padrão-ouro foi de 45,83% (55/120), ou seja, 55 das 120 lâminas coradas pelo método convencional obtiveram o mesmo grau de coloração quando coradas pelo HercepTest. Em 97 amostras, o resultado padrão ouro foi concordante na discriminação entre positivo e negativo (80,8%) e discordante em 23 (19,2%) (8 positivos no método convencional e negativos no HercepTest e 15 negativos no método convencional e positivos no HercepTest ). Em 10 amostras, a discordância foi superior a 1+, sendo 8 negativos no método convencional e positivos no HercepTest e 2 na situação inversa).

50 Resultados 37 IV.4 - Variações Induzidas pelos Diferentes Protocolos Aplicados às Mesmas Lâminas Quando analisamos as lâminas de mesmo material, podemos avaliar a variação técnica dos diferentes laboratórios para a mesma lâmina. Ou seja, as lâminas f e j alcançaram níveis de coloração que vão do completamente negativo (0) até o fortemente positivo (3+), passando por todos os graus de positividade, tanto para o teste convencional quanto para o HercepTest. Ao compararmos a coloração do teste convencional com o HercepTest, vemos que na maioria dos casos se equivalem, com algumas exceções para as lâminas b, e e i, coradas pelo laboratório C; e f e j, do laboratório D, que oscilaram entre 1+ e 2+, valores cruciais para a conduta terapêutica. O laboratório I variou entre 0 e 3+, onde os menores valores foram sempre para o HercepTest. A tabela 9 mostra a concordância entre a avaliação dos patologistas e a avaliação padrão-ouro, por lâmina de mesmo material. Temos que 7 dos 11 conjuntos de lâminas atingiram maiores índices de concordância para o HercepTest, porém, somente a lâmina c possui diferença significativa, conforme mostra a figura 5 e a tabela 9. O índice de concordância geral é de 56,60% para o c-erbb-2 convencional e 61,60% para o HercepTest.

51 Resultados 38 Tabela 9 - Concordância entre avaliação do laboratório que corou versus avaliação padrão-ouro (lâmina de origem). Lams. c-erbb-2 conv. HercepTest a b c d e f g h i j l Total 6/11 54,54% 7/11 63,63% 6/11 54,54% 7/11 63,63% 8/10 80,00% 5/11 46,46% 8/11 72,73% 9/11 81,81% 6/11 54,54% 3/11 27,27% 3/11 27,27% 68/120 56,60% 4/11 36,36% 9/11 81,81% 11/11 100% 8/11 72,72% 8/10 80% 6/11 54,54% 7/11 63,63% 9/11 81,81% 9/11 81,81% 5/11 46,46% 6/11 54,54% 74/120 61,60%

52 Resultados 39 Figura 5 - Concordância entre o c-erbb-2 convencional e o HercepTest por lâmina de mesma origem. Quando agrupamos os dados em positividade e negatividade, também temos maior índice de concordância entre as lâminas de mesma origem, como mostra a figura 6. Somente a lâmina f corada pela técnica convencional possui discordância significativa.

53 Resultados 40 Figura 6 - Concordância entre os escores atribuídos às lâminas de mesma origem e o padrão-ouro para o c-erbb-2 convencional e HercepTest considerando positividade e negatividade. A figura 7 mostra a concordância geral para lâmina de mesma origem entre os dois testes. O valor de Kappa para o c-erbb-2 convencional é de 0,8182 e para o HercepTest é de 0,8909.

54 Resultados 41 Figura 7 - Concordância de todas as lâminas entre o c-erbb-2 convencional e o HercepTest. A tabela 10 mostra os valores médios e modais para as lâminas de mesma origem. Tabela 10 - Valores médios e modais das lâminas de mesma origem. LAM. MODA MEDIA erb HT erb HT a 2 3 2,09 2,63 b 2 3 2,27 2,90 c 3 3 2,63 3,00 d 3 3 2,63 2,90 e 3 3 2,40 3,00 f 1 1 1,45 1,90 g 3 3 2,54 2,81 h 3 3 1,45 1,63 i 3 3 2,54 2,90 j 2 1 1,81 1,72 l 2 3 1,72 2,45

55 Resultados 42 Vemos que as lâminas f e j possuem valores menores de moda e média, sendo potencialmente as de melhor poder de discriminação quanto a variações de reação ou de interpretação. Mesmo sendo difícil a obtenção de diferença estatisticamente significante entre os dados por ser a amostragem restrita a apenas duas lâminas por laboratório, analisamos as concordâncias dos resultados obtidos nessas duas lâminas e observamos que a concordância para o HercepTest tem valor médio de Kappa maior que para o c-erbb-2, tanto quando consideramos a concordância absoluta (figura 8 à esquerda) como a concordância de positividade/negatividade (figura 8 à direita), mas tal diferença não atingiu significância estatística (p=0,16 e p=0,70 respectivamente). Figura 8 - Concordância entre as análises obtidas com as duas lâminas com menor reatividade ( f e j ).

56 Resultados 43 IV.5 - Comparação das Análises Efetuadas pelos Patologistas Experimentados em HercepTest e Não-Experimentados em HercepTest Considerando a concordância entre positivos e negativos (figura 10) nas amostras submetidas ao HercepTest, observamos que a diferença de concordância entre o valor do HercepTest e do c-erbb-2 convencional é estatisticamente significante para o grupo não-experimentado (p=0,02), mas não para o grupo todo, nem para o grupo de patologistas já experimentados em HercepTest. Quando se compara os valores obtidos com o sistema HercepTest conforme experiência prévia neste sistema, a variação não é significativa, mas fica nítida a maior dispersão dos resultados obtidos pelo grupo previamente experimentado. Quando consideramos a concordância absoluta, ou seja, dos escores de 0 a 3+, não mais divididos em positivos e negativos (figura 11), não há mais diferença significativa entre os valores de HercepTest e c-erbb-2 convencional. Experimentado Não-Experimentado Figura 9 - Fotomicrografia - IHQ de duas lâminas de mesmo material mamário, coradas pelo HercepTest, por um laboratório experimentado (esquerda 400x) e por um laboratório não-experimentado em HercepTest (direita 100x).