Bronquite Infecciosa: Aspectos Relevantes da Doença, da Imunidade e do Controle

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1 1 Bronquite Infecciosa: Aspectos Relevantes da Doença, da Imunidade e do Controle Helio José Montassier MONTASSIER, H. J. 1- Introdução A avicultura brasileira tem lugar de destaque no cenário mundial, ocupando a primeira posição na exportação de carnes de frango e a terceira em termos de produção de carne e derivados de frango, bem como há de se considerar como relevante o avanço na produção de ovos pelo setor avícola de postura de nosso país, que além de atender a toda demanda no mercador interno, tem potencial para ser destinado a suprir as necessidades do mercado externo. No entanto, as doenças infecciosas em geral e, em particular, as doenças respiratórias de etiologia viral na avicultura exercem um impacto significativo em perdas econômicas no mundo todo, relacionados à diminuição do crescimento, comprometimento da qualidade e da produção de ovos, mortalidade, condenação no abate e gastos com insumos incluindo diagnóstico, vacinas e antimicrobianos a fim de eliminar infecções bacterianas intercorrentes. Dentre as doenças com grande potencial de ocasionar as mais severas perdas em termos de mortalidade, estão aquelas causadas por estirpes de alta virulência do vírus da doença de Newcastle e do vírus da influenza aviária. Além dessas, três outras doenças respiratórias virais também possuem significativa importância em termos de severidade de lesões produzidas, tal como a laringotraqueíte infecciosa (ILT), a síndrome da cabeça inchada por metapneumovirus aviário (ampv) e a bronquite infecciosa das galinhas (BI), sendo que todas essas enfermidades virais podem ser prevenidas através da utilização de vacinas adequadas. A BI se destaca em razão de sua capacidade de se disseminar amplamente, mesmo em criações de aves vacinadas, quando estão envolvidas variantes desse vírus, ocasionando, consequentemente, enormes prejuízos diretos e indiretos, que são da ordem de milhões de dólares anualmente (JONES, 2010). A BI tem como agente etiológico um RNAvírus, que pertence à família Coronaviridae e ao gênero Coronavirus. Pode ser definida como sendo uma doença viral altamente contagiosa e de curto período de incubação, que acomete aves da espécie Gallus gallus, causando uma doença com sinais clínicos e lesões predominantemente do trato respiratório, caracterizados principalmente por espirros e estertores tráqueobronquiolares, conjuntivite, sinusite e, às vezes; na dependência especialmente da virulência e do patotipo da estirpe do VBI envolvida, podem surgir alterações patológicas de nefrite, nefrose, epididimite e ovário-salpingite. Atualmente a BI está incluída na lista da OIE (Organização Mundial de Saúde Animal) como doença transmissível de notificação anual, que tem importância sócio-econômica e implicações sanitárias, podendo trazer alguma repercussão a qualquer momento no comércio internacional de produtos e animais (CAVANAGH, 2007, ITO, 2006). Essa enfermidade foi descrita pela primeira vez em Dakota do Norte, nos Estados Unidos em 1930, e no Brasil foi inicialmente detectada em 1957, sendo que ela ocorre em praticamente todas as regiões do mundo, onde existe a avicultura industrial. Além disso, no Brasil, tem ocorrido com grande freqüência na Serra Gaúcha, Oeste de Santa Catarina, Sudoeste, Oeste e Norte do Paraná, além do Sul e Norte do estado de São Paulo e Triângulo Mineiro (CAVANAGH & NAQI, 2003; MONTASSIER et al., 2006, 2008, MONTASSIER, 2010). A despeito de existirem vacinas vivas e inativadas contra a BI, persistem grandes entraves para se estabelecer uma condição de controle mais efetivo da infecção pelo

2 2 VBI nos plantéis avícolas comerciais brasileiros, o que parece ser agravado no nosso país pela utilização de apenas um sorotipo viral (Massachusetts) nas vacinas vivas atenuadas. Deve-se salientar que as maiores dificuldades, nesse caso, estão mais diretamente relacionadas ao aparecimento, entre essas populações de aves, de novos sorotipos ou variantes do VBI, as quais são genetica e antigenicamente distintas das estirpes selvagens e vacinais. Em decorrência disso, no mundo todo e, inclusive no Brasil, tem sido crescente a identificação de variantes genéticas e antigênicas do VBI, tornando muito difícil o controle da infecção e consequentemente da enfermidade por esse vírus (MONTASSIER, 2010). 2. Características Moleculares e Estruturais do VBI em Relação às suas Principais Propriedades Biológicas As partículas do VBI são pleomórficas, com aproximadamente 120 nm de diâmetro e apresentam um envelope lipoprotéico provido de projeções bem demarcadas (espículas - glicoproteína de S) e distribuídas por toda a superfície do vírion. Tais espículas possuem cerca de 20 nm de comprimento e são responsáveis pela aparência de coroa do virion á microscopia eletrônica (CAVANAGH, 2007, MONTASSIER, 2010). O VBI apresenta, ainda, quatro proteínas estruturais principais, que foram identificadas como a glicoproteína de espícula (S), a glicoproteína integral de membrana (M), a proteína pequena de membrana (E) e proteína fosforilada de nucleocapsídeo (N) (CAVANAGH, 2007). A glicoproteína S atua, através da subunidade S1, na adsorção do VBI com os receptores presentes na membrana das células alvo e, em seguida, através da subunidade S2 desencadeia o processo de fusão do envelope viral com a membrana das células do hospedeiro, o que contribui para a liberação do genoma viral para o interior da célula infectada. Por essa razão, a subunidade S1 está envolvida na infectividade viral e, em adição a isso, contém epítopos vírus-neutralizantes, os quais são constituídos por determinadas seqüencias de aminoácidos que conferem a especificidade de sorotipo a cada estirpe do VBI. A par disso, essa proteína apresenta sítios responsáveis pela atividade hemaglutinante do VBI e também epítopos para a interação com linfócitos T citotóxicos. A glicoproteína S1 se caracteriza ainda por apresentar uma variabilidade acentuada na composição de determinadas sequencias de aminoácidos de sua estrutura, fenômeno este que foi identificado quando se fez a comparação dessas proteínas provenientes de diferentes estirpes européias e também de algumas delas pertencentes ao sorotipo Massachusetts (Mass) do VBI (CAVANAGH, 2007, MONTASSIER, 2010). A proteína de nucleocapsídeo (N) se localiza na parte mais interna do vírion, encontrando-se diretamente associado com o RNA genômico viral, exercendo, durante o ciclo de infecção intra-celular, um papel importante nos processos de replicação e montagem de novas partículas do VBI. Está também envolvida na indução de respostas imunes cito-mediadas de proteção, uma vez que contém em sua estrutura epítopos para a interação com células T citotóxicas específicas, as quais contribuem decisivamente para a restrição da disseminação da infecção pelo VBI dentro do organismo hospedeiro. Nesse sentido, os resíduos de aminoácidos presentes na porção carbóxi-terminal da proteína N se revelaram críticos para a indução de células T citotóxicas efetoras contra esse patógeno viral e, em adição a isso, foram reconhecidos outros importantes epítopos dessa mesma proteína para a interação com o MHC de classe II e com os linfócitos T auxiliares (CAVANAGH, 2007, MONTASSIER, 2010). 3. Patogenia do VBI

3 3 O VBI infecta inicialmente o trato respiratório superior e, preferencialmente as células ciliadas e secretoras de muco desse sistema (DHINAKAR RAJ; JONES, 1997). O título infectante viral atinge valores máximos nas mucosas do nariz e traquéia, aos três dias após o início da infecção; permanecendo nesses patamares por mais dois a cinco dias. Com relação à capacidade de o VBI infectar outros órgãos do trato respiratório, estudos revelaram a presença de títulos virais similarmente elevados, nos pulmões e nos sacos aéreos (CAVANAGH e NAQI, 2003, CAVANAGH, 2007). Embora a nomenclatura do VBI sugira que se trata de um patógeno apenas do trato respiratório, este vírus, além de se replicar em tecidos e órgãos desse sistema (nariz, traquéia, pulmão e sacos aéreos), causando lesões proeminentes nesses tecidos, apresenta também tropismo e patogenicidade para muitos outros tipos de células epiteliais, incluindo as que estão presentes na constituição dos rins, das células do oviduto ou dos testículos e muitos outros tipos celulares do trato gastro-intestinal, que constituem, por exemplo, o esôfago, o proventrículo, o duodeno, o jejuno, a bursa de Fabrícius, as tonsilas cecais, o reto e a cloaca (CAVANAGH, 2005). Infecções de tecidos entéricos geralmente não se manifestam clinica e patologicamente, não obstante quadros de proventriculite ou enterite podem ser desencadeados por determinadas estirpes do VBI (CAVANAGH, 2005, 2007). Por outro lado, algumas estirpes do VBI são predominantemente nefropatogênicas, isto é, quando inoculadas em pintinhos de um dia de idade, reproduzem experimentalmente um quadro característico de nefrite, que culmina em elevada mortalidade. Alternativamente a esses patotipos do VBI, foram descritas algumas outras estirpes com uma predileção mais acentuada para replicação em tecidos gonadais, nos quais desencadeiam lesões e comprometimento do funcionamento normal desses órgãos, especialmente de ovários, ovidutos e de testículos (PENSAERT e LAMBRECHTS, 1994, PEREIRA et al., 2006). Em vista disso, verifica-se que existem diferentes patotipos do VBI com capacidade de gerar lesões significantes nos sistemas respiratórios, urinário e reprodutor de aves de todas as idades, as quais podem acarretar severas perdas econômicas à indústria avícola. (CAVANAGH; NAQI, 2003; CAVANAGH, 2007). Imunidade contra o VBI Apesar da existência de inúmeros estudos sobre as respostas imunes induzidas pela infecção ou vacinação com o VBI, a base da imunidade de proteção contra esse vírus ainda não está totalmente elucidada. Tem sido demonstrado que, na maioria das vezes, a infecção ou a vacinação com o VBI estimulam a produção de anticorpos dos isótipos IgG, IgM e IgA, tanto no compartimento sanguíneo, como no compartimentos das mucosas dos tratos respiratório e uro-genital. Além dos anticorpos, são desencadeados também os processos de proliferação e ativação de células T efetoras, isto é, as células TCD8+, com atividade citotóxica (CTL) e as células TCD4+ (Ta), com capacidade de secretarem citocinas com ações moduladoras de linfócitos T e B e que se subdividem, conforme o perfil de citocinas secretadas, nas subpopulações Ta1 e Ta2. Sabe-se também, que a maioria dos anticorpos anti-vbi dos isótipos IgA, IgG e IgM, presentes nas secreções mucosas do trato respiratório e anexos, como a mucosa ocular, é produzida pelos tecidos linfóides traqueo-bronquiais e principalmente pela glândula de Harder (órgão linfóide especializado das aves que está localizado na cavidade orbital), em resposta à inoculação de suspensões virulentas ou atenuadas (vacinas vivas ) do VBI. Para os anticorpos do soro sanguíneo foram detectadas atividades vírusneutralizantes e também hemaglutinantes usando-se suspensões antigênicas apropriadas do VBI, bem como foi verificada que a presença de altos títulos de anticorpos séricos estão associadas com a ausência de re-isolamento do VBI nos rins e no trato reprodutor

4 das aves infectadas experimentalmente. No entanto, a maior parte dos artigos da literatura destaca que os títulos de anticorpos anti-vbi do soro sanguíneo não apresentam boa correlação com o estado de proteção ao desafio com estirpe virulenta do VBI, especialmente quando o estado de proteção é avaliado na traquéia; através da mensuração do movimento ciliar, do grau de lesões histológicas e do re-isolamento viral nesse mesmo órgão. Por outro lado, considera-se que os níveis de anticorpos presentes nas secreções mucosas estão mais envolvidos na proteção do trato respiratório e, especialmente da porta de entrada desse vírus constituída pelas células epiteliais da mucosa nasal e traqueal, embora persistam muitas controvérsias sobre o efetivo papel protetor desses anticorpos locais. Por exemplo, os resultados de GELB et al. (1998) sugerem que os anticorpos lacrimais produzidos após o estímulo vacinal nos tecidos linfóides da glândula de Harder e conjuntival, não são, primariamente, responsáveis pela imunidade de proteção contra a infecção pelo VBI no trato respiratório. Já, MONDAL e NAQI (2001), investigando o comportamento da imunidade em pintinhos não vacinados contra bronquite infecciosa, mas portadores de imunidade materna local e sistêmica, constaram que apenas as aves desafiadas com 1 dia de idade e que portavam níveis mais elevados de imunidade materna local e sistêmica é que apresentavam uma excelente performance ao desafio; com 95% de proteção, enquanto as aves mais velhas, isto é, com 7 ou mais dias de idade, cujos anticorpos locais maternos haviam declinado 50% ou mais, embora elas continuassem detentoras de altos teores de anticorpos anti-vbi no soro sanguíneo, revelaram reduzidos estados de proteção ao desafio feito com esse mesmo vírus, cujas percentagens de proteção variaram de 0 a 27%. E, ainda, reforçando a tese de que os anticorpos locais exercem um papel importante na proteção contra a infecção pelo VBI, vem os achados de TORO et al. (1994) que evidenciaram que as aves que recebiam, por via ocular, vacina constituída pela estirpe atenuada H120 do VBI, produziam quantidades significativamente maiores de anticorpos contra o VBI da classe IgA, na secreção lacrimal, comparativamente às aves não vacinadas, tendo sido constatado, ainda, que as aves desafiadas com estirpe moderadamente atenuada desse mesmo vírus (estirpe H-52), o período (ao redor do 19º dia pós-vacinação) em que os níveis de anticorpos anti-vbi da classe IgA alcançavam máxima magnitude, coincidia com um maior proteção ao desafio. Além dessas controvérsias, há ainda uma teoria contrária a uma maior relevância do papel protetor exercido pelos anticorpos das secreções mucosas, a qual vem no sentido de conferir um papel mais importante para a resposta imune celular e, notadamente aquela que é mediada por linfócitos T citotóxicos, em aves previamente imunizadas ou não, frente à infecção com o VBI (COLLISON et al., 2000). Nesses estudos, foi observado que o início da diminuição dos sinais clínicos e da atividade replicadora desse vírus coincidia com um aumento mais pronunciado da atividade de linfócitos T citotóxicos. A par disso, foi verificado que a atividade das células T citotóxicas requer a compatibilidade de moléculas do Complexo de Histocompatibilidade Principal de classe I (MHC-I) da célula alvo do processo de citólise com o das células responsáveis por esta atividade, no caso, as células T CD8+ CD4-. Deve-se ressaltar que todos esses experimentos foram realizados com linhagens isogênicas de galinhas, que são muito diferentes das aves mantidas em granjas comerciais, tendo sido verificado que a transferência adotiva de células T CD8+, colhidas de aves convalescendo de infecção prévia com o VBI, foi eficaz em conferir proteção a aves naive frente ao desafio com esse mesmo vírus (COLLISON et al., 2000, CAVANAGH, 2007). A resposta dos linfócitos T citotóxicos em galinhas contra a infecção pelo VBI parece exercer um papel preponderante na eliminação desse vírus do meio interno do hospedeiro durante a fase 4

5 5 aguda da infecção. No tocante a isso, foi observado que a cinética da replicação viral após a infecção se correlaciona diretamente por um ou dois dias com a cinética da resposta de células T citotóxicas acompanhando, dessa forma, o aumento e depois o declínio do processo infeccioso causado pelo VBI. Todos esses estudos acima relatados, focalizaram a indução de proteção durante a fase aguda da infecção pelo VBI e, embora a atividade das células T citotóxicas tenha sido efetiva durante a fase inicial da eliminação desse vírus do organismo das galinhas, o controle do processo infeccioso em fases mais tardias provavelmente dependa dos anticorpos anti-virais específicos, especialmente os anticorpos do isótipo IgG, que provavelmente atuam no sentido de evitar a recrudescência da infecção pelo VBI (COLLISON et al., 2000, CAVANAGH, 2007). Diante disso e com o objetivo de dirimir algumas dúvidas importantes sobre as reais atividades efetoras de anticorpos no controle da infecção pelo VBI, nosso grupo desenvolveu e padronizou a técnica de Sandwich-ELISA-Concanavalina A (S-ELISA- Con A) (BRONZONI et al., 2005) para ser aplicada na mensuração de anticorpos contra o VBI e vem realizando há mais de 8 anos uma série de estudos com enfoque mais direcionado à mensuração de anticorpos anti-virais dos isótipos IgG, IgA e IgM presentes na secreção lacrimal de aves (Gallus gallus) livres de patógenos específicos (Specific Pathogen Free SPF) da linhagem Leghorn Branca ou frangos de corte de granjas comerciais submetidos à esquemas imunoprofiláticos rotineiros (Figuras 1 e 2). Em um primeiro estudo, ves SPF foram imunizadas com 3 semanas de idade, por via ocular com vacina H120 viva atenuada tendo sido determinados os níveis de anticorpos na secreção lacrimal e a possível associação desses anticorpos com o estado de proteção ao desafio experimental feito com a estirpe M41 virulenta do VBI (10 4,0 Doses Infectantes 50% para o Embrião de Galinha DIE 50 /ave), 21 dias depois da vacinação, avaliando-se para tanto inibição do movimento ciliar dos anéis da traquéia e a intensidade de lesões nesse mesmo órgão (LANCELLOTTI et al., 2002, MONTASSIER et al., 2003). Os resultados obtidos nesse primeiro estudo revelaram que os níveis dos três isótipos de anticorpos presentes na secreção lacrimal no dia do desafio, especialmente IgG e IgA, apresentam correlações estatisticamente significantes com atividade vírus-neutralizante contra o VBI e com o estado de proteção ao desafio, não tendo sido, entretanto, encontradas, nesse primeiro estudo, correlações significantes para os anticorpos lacrimais mensurados como Acs-Totais, isto é, aqueles que são detectados nos testes de ELISA com os conjugados imuno-enzimáticos anti-ig total e não com conjugados isótipo-específicos de galinhas (Figura 3). Foram também encontradas, em um outro estudo de nosso grupo, correlações similarmente significativas entre os níveis de anticorpos da secreção lacrimal quantificados como IgG através de um kit comercial de ELISA, no dia do desafio e o grau de proteção à infecção com a estirpe M41 do VBI, mensurado na traquéia; exceto que, nesse segundo estudo, foram ensaiadas aves de corte comerciais, portadoras, portanto, de níveis elevados de anticorpos maternos e que haviam sido imunizados por via aerossol com a vacina H120 do VBI com 1 dia de idade (Figuras 4 e 5) (Santos et al., 2008). Mais recentemente foi desenvolvida e padronizada, em nosso laboratório, a técnica de RT-PCR em Tempo Real para ser aplicada na mensuração da expressão de RNAs mensageiros de genes de imune-resposta na traquéia; como o gene CD8 (marcador de linfócitos T citotóxicos) e o gene da granzima A (mediador liberado pelos linfócitos T citotóxicos para a destruição de células alvo infectadas por vírus) e, mantendo-se a avaliação dos níveis de anticorpos lacrimais tanto no dia do desafio, como com 1, 5 e 10 dias pós-desafio, foram mensuradas as respostas imunes humoral e cito-mediada

6 6 detectadas localmente, isto é, ao nível das mucosas do trato respiratório, em aves SPF da linhagem Leghorn Branca, imunizadas com 1 dia de idade por via aerossol e desafiadas aos 42 dias de idade com estirpe M41 virulenta do VBI. Os principais resultados obtidos demonstraram que no grupo de aves vacinadas são induzidas respostas de memória, tanto da imunidade mediada pelos anticorpos locais anti-vbi pertencentes aos isótipos IgG, IgA e IgM, como de imunidade mediada por células T citotóxicas, caracterizadas, nesse estudo, por um aumento mais precoce, com 1 dia pósinfecção, na expressão dos genes CD8 e granzima A. Ainda, esses incrementos detectados nos níveis de anticorpos IgG, IgA e IgM e na expressão dos genes CD8 e Granzima A, em intervalos mais precoces pós-desafio (1 DPI) revelaram-se estatisticamente diferentes dos parâmetros da imunidade humoral e cito-mediada observados para as aves do grupo controle não vacinado. Tais aumentos mais precoces pós-desafio encontrados nos parâmetros da imunidade humoral e celular podem ser atribuídos à memória induzida pela vacinação contra o VBI e revelaram-se estar correlacionados com o grau de proteção ao desafio avaliado em nosso estudo com base na manutenção, ou não da integridade morfológica e funcional dos anéis traqueais (movimentação ciliar das células epiteliais, presença e intensidade de alterações histopatológicas e detecção viral) (Santos, 2009). Em adição a isso, novos estudos estão em curso em nosso laboratório, para avaliar na traquéia de aves vacinadas ou não desafiadas a expressão de outros genes associados às respostas imunes inata e adquirida, especialmente aqueles que são codificadores de algumas citocinas importantes, como o interferon gama (IFN-γ), o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), a interleucina 1 (IL-1), a interleucina 6 (IL-6), a interleucina 10 (IL-10) e fator de crescimento e transformação beta (TGF-β), a fim de relacionar os níveis de expressão dessas citocinas com o estado de proteção ao desafio na traquéia em aves previamente vacinadas, ou inversamente com a maior intensidade das alterações patológicas e inflamatórias produzidas nesse mesmo órgão, em aves não imunes (Okino et al., 2008, 2009). Comentários Finais As abordagens técnicas desenvolvidas e aplicadas em nossos estudos, representados, em especial, pelo método de Sandwich-ELISA-Concanavalina A empregado para a mensuração de anticorpos da secreção lacrimal anti-vbi dos isótipos IgG, IgM e IgA e pela técnica de RT-PCR em Tempo Real usada para a avaliação da expressão de genes de imune-respostas mediadas por linfócitos T citotóxicos, como o CD8 e a granzima A, revelaram-se bastante efetivas, para fazer a detecção desses mediadores das respostas imunes humorais ou celulares, respectivamente, e para correlacionar os parâmetros dessas respostas imunes com os graus de proteção ao desafio com estirpe virulenta do VBI. Dentre essas metodologias de avaliação da imunidade induzida pela vacinação contra o VBI, a mensuração de anticorpos contra o VBI nas amostras de secreção lacrimal, mostrou-se um parâmetro da resposta imune de acesso relativamente fácil de ser avaliado e com boa correlação com o estado de proteção ao desafio nas aves submetidas a esquema imunoprofilático rotineiro contra a BI, fazendo-nos recomendar a adoção desse tipo de monitoramento das respostas imunes pós-vacinação contra o VBI, em adição ou até mesmo em substituição à mensuração de anticorpos no soro sanguíneo. Em suma, o conjunto de resultados obtidos até agora nos estudos acima descritos, evidenciou que as imunização contra a estirpe H120 do VBI de pintinhos com 1 dia de idade ou de aves com 3 semanas de idade, seja por meio de aerossol ou gota ocular, estimula a ativação de linfócitos B de memória e efetores, responsáveis, nesse caso, pela produção de anticorpos antivirais específicos dos isótipos IgG, IgM e IgA, no compartimento das mucosas do trato respiratório e anexos, bem como a ativação de células T de memória e efetoras, especialmente os linfócitos T citotóxicos, sendo que ambos tipos de mediadores das respostas imunes atuam no sentido de restringir a replicação do VBI na traquéia de galinhas experimentalmente infectadas

7 com a estirpe virulenta M41 e de reduzir as alterações patológicas induzidas nesse mesmo órgão, como a ciliostase e as lesões histológicas. Referências Bibliográficas BRONZONI, R. V. M. et al. Detection of infectious bronchitis virus and specific anti-viral antibodies using a concanavalin A-sandwich-ELISA. Viral Immunol., v.18, n.3, p , CAVANAGH, D, NAQI S. Infectious Bronchitis. In: CALNEK, B. W.; BARNES, H. J.; BEARD, C. W. Diseases of poultry. 11 ed. Ames: Iowa State University Press, p CAVANAGH, D. Coronaviruse in poutry and other birds. Avian Pathol., Huntingdon, v. 34, n.6, p , CAVANAGH, D. Coronavirus avian infectious bronchitis vírus. Vet. Res., Les Ulis, v. 38, n. 22, p , COLLISSON, E.W. et al. Cytotoxic T lymphocytes are critical in the control of infectious bronchitis virus in poultry. Dev. Comp. Immunol., v.24, p , JONES, R. C. Viral respiratory diseases (ILT, ampv infections, IB): are they ever under control?. British Poul Sc., v.51:1, p.1 11, LANCELLOTTI, M., MONTASSIER, M., A.M. GIBERTONI, LUCIANO, R., PEREIRA, G. T., MONTASSIER, H. J. Relação entre as Respostas Imunes Humorais Local e sistêmica com a Proteção ao Desafio em Aves Vacinadas contra o VBI In: APINCO , 2002, Campinas - SP. Rev. Bras. Cienc. Avic. v.s-4, Campinas, v.s-4. p.116, MONTASSIER H.J., LANCELLOTTI M., MONTASSIER M.F.S., GAMA N. & FERRO P. Systemic and mucosal homotypic and heterotypic humoral immune responses to avian coronavirus, p In: Viral Vaccines. The International Human and Animal Viral Vaccination Conference, Edinburgh, MONTASSIER MFS, BRENTANO L, RICHTZENHAIN LJ, MONTASSIER, HJ. Genetic diversity on S1 glycoprotein of avian infectious bronchitis virus strains isolated in Brazil between Proceedings of the 5th International Symposium on Avian Coronavirus; 2006; Rauischholzhausen. Germany. v.1, p MONTASSIER MFS, BRENTANO L, MONTASSIER HJ, RICHTZENHAIN LJ. Genetic grouping of avian infectious bronchitis virus isolated in Brazil based on RT-PCR/RFLP analysis of the S1 gene. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.28, p , MONTASSIER, H.J. Molecular epidemiology and evolution of avian infectious bronchitis virus. Rev. Bras. Cienc. Avic. v.12, no.2, p , OKINO, C.H., SANTOS, I.L., TAMANINI, M.L.F., MONTASSIER, H.J. Avaliação da proteção vacinal contra o vírus da bronquite infecciosa através da quantificação da expressão gênica de citocinas e da replicação do vírus na traquéia. O Biológico, V.70, (2), p. 119, OKINO. CH., SANTOS, I.L., FERNANDES, C.C., MONTASSIER, H.J. PCR em tempo real para quantificação relativa da expressão de citocinas na traquéia de aves infectadas com vírus da bronquite infecciosa. In: Anais do Prêmio LAMAS 2009 da Conferência APINCO 2009, p. AS 53. PENSAERT, M. e LAMBRECHTS, C. Vaccination of chickens against a Belgian nephropathogenic strain of infectious bronchitis virus B1648 using attenuated homologous and heterologous strains. Avian Pathol., Huntingdon, v. 23, n. 4, p , PEREIRA N.A., ALESSI A.C., OKINO C.H., MONTASSIER M.F.S., SANTOS I.L., MONTASSIER H. J. & RICHTZENHAIN L.J. Uma nova estirpe brasileira do vírus da bronquite infecciosa causadora de lesões gonadais e a proteção cruzada induzida pela vacina comercial atenuada. O Biológico, São Paulo, 68 (Supl.2), p , SANTOS, I. L. ; BERNARDINO, A. ; FERNANDES, C. C. ; OKINO, C. H. ; GIBERTONI, A. M. ; MONTASSIER, H. J.. Avaliação da imunidade induzida em frangos de corte por vacinação ao nascimento contra o Vírus da Bronquite Infecciosa. Rev. Bras. Cienc. Avic. v. S10. p. 259, SANTOS, I.L. Respostas Mediadas por Anticorpos e Células T de Memória na Imunidade contra o Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. TORO, H.; FERNANDEZ, I. Avian Infectious Bronchitis: Specific lacrymal IgA level and resistance against challenge. Journal of Veterinary Medicine, v.41, p ,

8 8 Figura 1- Instalações do Laboratório de Imunologia Viral (IMUNOVIR) do Departamento de Patologia Veterinária da FCAV UNESP Campus de Jaboticabal para a Incubação de Ovos Embrionados de Galinhas SPF e para a Realização dos Procedimentos de Inoculação, Propagação e Titulação do Vírus da Bronquite Infecciosa (Fotos, OKINO, 2009) Figura 2- Instalações do Biotério do Laboratório de Imunologia Viral (IMUNOVIR) do Departamento de Patologia Veterinária da FCAV UNESP Campus de Jaboticabal com Salas de Infectório contendo os Isoladores com Pressão Negativa para a Realização dos Experimentos de Vacinação e Infecção Experimental com o Vírus da Bronquite Infecciosa e Ilustrações dos Procedimentos de Colheita de Amostras de Secreção Lacrmal, de Sangue e Traquéia das Aves (Fotos, OKINO, 2009)

9 Figura 3- Níveis de anticorpos anti-vbi dos isótipos IgG, IgA e IgM (expressos como faixas de valores A/P) e determinados pelo S-ELISA-ConA, nas amostras de secreção lacrimal de aves SPF da linhagem Leghorn Branca, do grupo controle (A) e vacinado (B) e títulos de anticorpos soro-neutralizantes (expressos em log 10), detectados pelo Teste de Vírus-Neutralização na secreção lacrimal de aves SPF da linhagem Leghorn Branca dos grupos controle (SN-cont) e vacinado (SN-vac) (C) e suas relações com os resultados da proteção ao desafio, avaliada pelo movimento ciliar das células epiteliais e lesões histopatológicas da traquéia, sendo * P< 0.05 e ** P< 0.01 indicativos de aumentos dos níveis de anticorpos e de suas correlações significativos em relação ao grau de proteção traqueal contra a infecção pelo VBI. 9

10 Figura 4 - Perfil cinético das concentrações médias de anticorpos anti-vbi determinados pelo método indireto de ELISA no soro sanguíneo (A) e na secreção lacrimal (B). (a, b) Diferenças significativas pelo Teste de Tukey (P < 0.05). Escores médios de graus de lesões encontradas no exame histopatológico (C) e escores médios de movimento ciliar da traquéia de aves vacinadas ou não (controle) três dias após o desafio (B). (a, b) Diferenças significativas pelo teste estatístico de comparação múltipla de Dunn's (P < 0.05). A seta azul identifica o dia da vacinação (1 dia de idade) e a seta vermelha o dia do desafio (42 dias de idade) 10

11 Figura 5 - Fotomicrografias de histopatologia com coloração hematoxilina-eosina, em aumento de 40x, de traquéia de ave do grupo da vacina A no quinto dia pós-desafio, demonstrando infiltrado inflamatório leve, leve perda ciliar e degeneração de glândulas epiteliais, com preservação de células epiteliais (A); de traquéia de ave do grupo da vacina B no quinto dia pós-desafio, demonstrando leve perda de cílios, com preservação de células e glândulas epiteliais, além de infiltrado inflamatório leve (B); de traquéia de ave do grupo controle (não vacinado) no quinto dia pós-desafio, demonstrando intenso infiltrado inflamatório, perda ciliar e degeneração de glândulas epiteliais, além de moderada hiperplasia (C); e de traquéia de ave do grupo contorle (não vacinado) no quinto dia pós-desafio, demonstrando moderada perda de células epiteliais, intensa perda ciliar e degeneração de glândulas epiteliais (D). 11

12 Figura 6 Avaliação da expressão gênica (número médio de vezes de aumento), mensurada pela técnica de RT-PCR em Tempo Real do marcador CD8 e da Granzima A no primeiro, quinto e décimo dias pósinfeccão (DPI) em aves não imunizadas e imunizadas com dose cheia e dose diluída de vacina viva atenuada H120 do VBI. Os símbolos a e b. indicam diferenças significativas pelo teste de Kruskal - Wallis seguido do teste de comparação múltipla de Dunn s, (p < 0,05). 12

13 Figura 7 Avaliação dos níveis de anticorpos anti-vbi dos isótipos IgG, IgM e IgA (expressos como valores médios A/P), no dia do desafio e no primeiro, quinto e décimo dias pós-infecção (DPI), e determinados pelo S-ELISA-ConA, nas amostras de secreção lacrimal de aves SPF da linhagem Leghorn Branca dos grupos controle (não imunizadas) e imunizados com dose cheia e dose diluída de vacina viva atenuada H120 do VBI. Os símbolos a e b. indicam diferenças significativas pelo teste de Kruskal - Wallis seguido do teste de comparação múltipla de Dunn s, (p < 0,05). 13

14 Figura 8 - Comparação entre os resultados de escores de ciliostase (A) e de alterações histopatológicas (B) no quinto dia pós-desafio em aves não imunizadas e imunizadas. com dose cheia e dose diluída de vacina viva atenuada H120 do VBI. Os símbolos a e b. indicam diferenças significativas pelo teste de Kruskal - Wallis seguido do teste de comparação múltipla de Dunn s, (p < 0,05). Resultados da detecção do VBI na traquéia pela técnica de RT-PCR em Tempo Real, nos grupos experimentais de aves (C). 14