PRODUÇÃO DE LEITE ENRIQUECIDO NATURALMENTE COM ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO (CLA) EM SISTEMAS TROPICAIS DE PASTEJO SILVA, L. H. O.¹, MACHADO, C. H. C.

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1 PRODUÇÃO DE LEITE ENRIQUECIDO NATURALMENTE COM ÁCIDO LINOLÉICO CONJUGADO (CLA) EM SISTEMAS TROPICAIS DE PASTEJO SILVA, L. H. O.¹, MACHADO, C. H. C.² ¹Zootecnista pela Universidade de São Paulo (USP), pós graduando latu sensu em Manejo da Pastagem, Faculdades Associadas de Uberaba (MG), ²Professor Especialista das Faculdades Associadas de Uberaba (MG), Superintendente técnico da Associação Brasileira dos Criadores de Zebu (ABCZ), RESUMO: O CLA (ácido linoléico conjugado) é um importante agente na prevenção do câncer e outras doenças e é encontrado em produtos derivados dos ruminantes, principalmente no leite. O leite de vacas alimentadas com volumosos verdes e frescos, especialmente àquelas em pastagens de gramíneas, apresenta mais CLA do que o leite de vacas alimentadas com silagens e concentrado. O Brasil apresenta enorme potencial de produção de leite em pasto e pode tornarse um grande produtor de leite enriquecido com CLA. Esta revisão relata os processos envolvidos na produção de CLA nos ruminantes e propõe pesquisas quanto ao manejo, adubação e seleção de pastagens visando aumentar essa substância no leite de vacas. PALAVRAS CHAVE: ácido rumênico; alimento funcional; anticarcinogênico; pastagem; ruminantes PRODUCTION OF CONJUGATED LINOLEIC ACID (CLA) NATURALLY ENRICHED MILK IN TROPICAL GRAZING PASTURE SYSTEMS ABSTRACT: CLA (conjugated linoleic acid) is an important agent on cancer and other illness prevention and it is found in foods of ruminant origin, mainly the milk. Milk from cows fed fresh green forage, especially those grazing grass, has more CLA than milk from silage and concentrate fed cows. Brazil has a huge potential for milk production in grazing pasture systems and can become a high producer of CLA enriched milk. This review describes the processes involved in the production of CLA in ruminants and proposes research about management, pasture fertilization and forage selection in order to increase this substance in milk from cows. KEY WORDS: anticarcinogenic; functional food; pasture; rumenic acid; ruminants INTRODUÇÃO O Brasil possui indiscutível potencial para produzir leite em pasto. Além da vasta extensão territorial, do clima favorável, dos bons índices pluviométricos na maior parte do país, das espécies forrageiras com grande capacidade fotossintética e de produção de massa e de animais muito produtivos e adaptados aos trópicos, existe, ainda, a viabilidade econômica do sistema, cuja rentabilidade chega a ser 30% superior àquela obtida nos sistemas de confinamento. Na gordura do leite existem substâncias comprovadamente benéficas à saúde humana. Essas substâncias, principalmente o ácido linoléico conjugado - CLA, têm gerado grande interesse às ciências médicas, devido a sua atuação na prevenção e no combate ao câncer e de outras doenças. O leite que é produzido em pasto pode apresentar de 3 a 4 vezes mais CLA quando compara-se com o leite obtido nos sistemas de produção que utilizam dieta total. Esta revisão tem por objetivo discutir os diversos fatores relacionados ao incremento das quantidades de CLA na gordura do leite produzido em pastagem tropical visando um alimento diferenciado para o mercado consumidor e com alto valor agregado aos produtores e indústria. DESENVOLVIMENTO Alimento funcional e definição de CLA Os alimentos funcionais, muitas vezes ditos nutracêuticos, são alimentos que, segundo Candido & Campos (2005), podem trazer benefícios fisiológicos específicos devido à presença de ingredientes fisiologicamente saudáveis. Atualmente, existe entre os consumidores uma crescente demanda para este tipo de alimento. O termo CLA, acrônimo de conjugated linoleic acid, em inglês; ácido linoléico conjugado, em português, refere-se a vários isômeros geométricos e posicionais do ácido linoléico (cis-9, cis-12 ácido octadecadienóico), cujas duplas ligações apresentam arranjo conjugado. As propriedades biológicas do CLA dietético atraem interesse devido aos seus diversos efeitos fisiológicos em estudos com animais. Além de ser um poderoso anticarcinogênico, o CLA também apresenta propriedades antiaterogênicas, imunomoduladoras, promotoras de crescimento e de ganho de massa muscular (PARODI, 1999). Existem dois isômeros de CLA amplamente conhecidos com atividade fisiológica. Estes são o cis-9, trans-11 C18:2 (ácido rumênico), o qual se encontra em produtos lácteos e cárneos de ruminantes, e o trans-10, cis- 12 C18:2, um isômero predominante nos suplementos de

2 CLA (CAVIEDES et al., 2011). No entanto, apenas o isômero cis-9, trans-11 é incorporado à membrana fosfolipídica das células e é considerado biológicamente ativo (PARODI, 1999). Os produtos alimentícios derivados de animais ruminantes são a maior fonte de CLA na dieta humana. (BAUMAN et al., 1999). Biosíntese de CLA nos ruminates O ácido rumênico (cis-9, trans-11 C18:2) é o isômero em maior proporção na gordura do leite e representa de 75 a 90% dos CLAs totais (BAUMAN, 2003a) e é originado de duas fontes (Fig 1). Uma fonte é o CLA formado durante o processo de bio-hidrogenação ruminal do ácido linoléico. A segunda fonte é o CLA sintetizado via endógena pela ação da enzima Δ9- dessaturase na glândula mamária, que utiliza como substrato o ácido transvacênico (trans-11 C 18:1 ), outro intermediário da bio-hidrogenação dos ácidos graxos insaturados (BAUMAN et al., 1999; BAUMAN et al, 2003b). No leite de vacas, cerca de 70% do ácido rumênico é originado da conversão do ácido transvacênico pela Δ9- dessaturase na glândula mamária e outros tecidos (GRIINARI et al., 2000; BAUMAN et al., 2001). Figura 1. Caminho da síntese ruminal endógena do ácido rumênico (cis-9, trans-11 C18:2) em vacas leiteiras. Os caminhos para a bio-hidrogenação dos ácidos linoléico e linolênico que chegam a ácido transvacênico (trans-11 C18:1) são mostrados na síntese endógena do rúmen; e pela ação da enzima Δ9-dessaturase são mostrados na glândula mamária Fonte: Costa et al. (2009). Influência da dieta na concentração de CLA A concentração de CLA na gordura do leite pode variar amplamente nos diferentes rebanhos, sendo que a dieta tem a maior influência sobre essa composição. Os fatores que afetam as quantidades de CLA no leite e carne são apresentados na Tabela 1. Valores de CLA encontrados na gordura do leite australiano e neozelandês são frequentemente 2 a 3 vezes maiores aos valores encontrados em produtos americanos equivalentes. Este fenômeno reflete ao maior acesso às pastagens frescas e ricas em ácidos graxos poliinsaturados nos países da Oceania (PARODI, 1999). Diversas pesquisas têm mostrado um aumento nas quantidades de CLA na gordura do leite de vacas alimentadas em pastagens; recebendo dieta total com 50% de volumoso e 50% de concentrado com óleos vegetais e grãos oleaginosos; e recebendo dieta total com óleo de peixe (KHANAL & OLSON, 2004). Na Tabela 2, pode-se observar a variação da concentração de CLA no leite e em outros produtos lácteos de ruminantes sob diferentes regimes alimentares. A manipulação da dieta animal, portanto, tem sido o foco para aumentar o conteúdo de CLA na gordura dos produtos derivados de ruminantes. Dietas de alto grão podem afetar negativamente as quantidades de CLA, pois contribuem com a diminuição do ph ruminal, que abaixo de 6 altera a microbiota do rúmen, especialmente as bactérias celulolíticas, que são as principais responsáveis pela hidrogenação dos lipídios no rúmen e pela produção de ácido rumênico e transvacênico (RICO, 2007). Um estudo realizado por Kelly et al. (1998) para verificar as concentrações de CLA na gordura de vacas submetidas a uma transição alimentar partindo de uma

3 dieta total para uma dieta de pasto exclusivo, já que os trabalhos prévios haviam identificado diferenças na concentração de CLA, porém entre diferentes grupos de animais. As concentrações de CLA foram afetadas pela dieta, de forma que as vacas que consumiram pasto tiveram concentrações de CLA no leite duas vezes maiores do que as que consumiram dieta total. Houve, no entanto, uma queda substancial na produção de leite das vacas que consumiram pasto. O estudo também mostrou grande variação individual das concentrações de CLA das vacas que consumiram pasto. Tabela 1. Fatores que afetam o conteúdo de CLA no leite. Fatores Efeito sobre o CLA A. Relacionados à dieta I. Relacionados à pastagem Pastagens verdes frescas Altamente positivo Pastagem + grão inteiro de soja extrusado Sem efeito Pastagem + óleo de soja Sem efeito Pastagem + óleo de peixe Maturação das pastagens Negativo Diversidade das espécies forrageiras Elevação dos pastos Terras altas>morros>terras baixas Pastagens frescas ceifadas Frescas>conservadas II. Dieta com alto volumoso III. Dieta com alto grão Negativo IV. Grãos oleaginosos crus V. Grãos oleaginosos/farinha tostados VI. Grãos oleaginosos extrusados, melhor do que grãos oleaginosos tostados VII. Óleos vegetais, melhor do que grãos processados VIII. Farinha de peixe, mais eficiente do que óleos vegetais IX. Sais de Ca dos ácidos graxos X. Algas marinhas XI. ph do Rúmen ph>6,0 positivo XII. Suplementação de CLA XIII. Gorduras trans XIV. Ionóforos Provavelmente positivo XV. Dieta de baixa energia Provavelmente positivo B. Relacionados aos animais I. Espécies Ruminantes>não-ruminantes II. Raça Holandês>Pardo Suíço>Normando>Jersey III. Estágio de lactação IV. Parto V. Idade? VI. Animal/animal com aumento da atividade Δ9-dessaturase C. Processamento I. Leite em queijo II. Leite em iogurte Provavelmente positivo III. Leite em manteiga IV. Cozimento Provavelmente mínimo V. Idade do queijo VI. Pasteurização do leite Provavelmente mínimo Fonte: Adaptado de Khanal & Olson (2004). Fatores que tornam as pastagens favoráveis à elevação do CLA do leite Elevar as concentrações de ácidos graxos desejáveis nos produtos provenientes de animais ruminantes recebe muita atenção atualmente. Ao contrário das cadeias curta e médias de ácidos graxos, os ruminantes não conseguem produzir uma cadeia longa de ácidos graxos de 18 átomos de carbono, que são pretendidos no leite e carne. Portanto, os ruminantes devem ingerir ácidos graxos de cadeia longa em sua dieta. Nas pastagens, ácidos graxos C18:3 são predominantes (ELGERSMA et al., 2006a). Nos países temperados, as gramíneas frescas contêm de 1 a 3% de ácidos graxos, sendo que na primavera e outono são observadas as maiores

4 concentrações. Ao redor de 55 a 65% destes ácidos graxos são compostos de ácido α-linolênico (BAUCHART et al., 1984 citado por CHILLIARD, 2001). As pastagens tropicais são muito diferentes: o ácido α-linolênico representa de 15 a 40% do total de ácidos graxos (O KELLY & REICH, 1976 citado por CHILLIARD, 2001). Portanto, lipídeos constituintes das forrageiras são determinantes para a composição do CLA no leite. Sabe-se que as fontes de variação da concentração lipídica são as espécies forrageiras, o estádio de desenvolvimento, temperatura e intensidade de luz (HAWKE, 1973 citado por ELGERSMA et al., 2006b). Quantificar o perfil e as concentrações de ácidos graxos nas pastagens diante dos fatores ambientais pode ajudar a desenvolver estratégias de manejo para aumentar os precursores de ácidos graxos benéficos nos produtos derivados de animais ruminantes (ELGERSMA, 2006b). Tabela 2. Conteúdo de CLA (% da gordura) nos produtos lácteos de ruminantes Produtos Raça/Espécie Dieta Conteúdo Leite Holandês Dieta total 0,44 Leite Holandês Pasto exclusivo 2,5 Leite Holandês Pasto exclusivo 1,7 Leite Holandês Pasto + soja extrusada 1,7 Leite Holandês Pasto + colza extrusada 2,5 Leite Holandês Dieta total + colza 1,4 Leite Holandês Dieta total + linhaça 1,2 Leite Holandês Pasto + mix de grãos 0,72 Leite Holandês Dieta total + 1% óleo de peixe 0,73 Leite Holandês Pasto + 150g óleo de peixe 3,3 Leite Holandês Dieta total + 3,6% óleo de soja 2,1 Leite Holandês Dieta total + 5,3% óleo de linhaça 1,67 Leite Holandês Dieta total + 5,3% óleo de girassol 2,44 Leite Jersey Dieta total 0,32 Leite Jersey Pasto + 5,5 kg de concentrado 0,59 Leite Pardo Suíço Dieta total 0,41 Leite Normando Pasto exclusivo 1,7 Leite Búfala - 0,84 Leite Cabra Vários 0,58-1,1 Leite Ovelha Vários 1,2-3,0 Leite Mulher - 0,09-0,49 Queijo Holandês Pasto exclusivo 1,5 Queijo Holandês Pasto + soja extrusada 1,4 Queijo Holandês Dieta total 0,34 Queijo Holandês Dieta total + soja extrusada 0,73 Queijo Holandês Dieta total + caroço de algodão extrusado 0,60 Queijo Ovelha - 0,8-2,0 Queijo Cabra - 0,27-0,69 Queijo Mozarela - 0,43 Queijo Cheddar - 0,40-0,47 Queijo Suíço - 0,55 Iogurte - - 0,44 Manteiga - - 0,61 Fonte: Adaptado de Khanal & Olson (2004). Manejo e adubação sobre a concentração de lipídios na pastagem Os lipídios nas plantas não são entidades estáticas, são, portanto, continuamente sujeitos a mudanças, o que significa que a degradação lipídica é um processo normal na planta viva e que lipases estão normalmente presentes. Em condições normais de crescimento isso não tem importante influência na composição de ácidos graxos da fração lipídica das plantas. No entanto, existem pelo menos três momentos em que a fração lipídica da planta ou de partes da planta podem ser significativamente alteradas: senescência, ceifa (mecânica ou pelo animal) e armazenamento após o corte (ELGERSMA et al., 2006a). Segundo Lee et al. (2003), os primeiros estágios de lipólise nos ruminantes alimentando-se de pastagens frescas podem ser mediados preferencialmente pelas lipases vegetais, ao invés das lipases microbiais. Segundo Caviedes et al. (2011), a alta disponibilidade de nitrogênio estimula a produção de matéria seca, incrementa a quantidade de folhas e estimula a síntese de componentes metabólicos, entre os quais se incluem a clorofila e proteína da folha. Com o

5 desenvolvimento da planta a proporção de folhas diminui e o aumento da parede celular diminui o conteúdo celular. Portanto, pode-se incrementar o conteúdo de ácidos graxos na planta através da fertilização nitrogenada e através do manejo de períodos de rebrote corretos, devido aos ácidos graxos localizarem-se dentro do conteúdo celular das plantas. Em um estudo, Boufaïed et al. (2003) aplicaram 0 e 120 kg N/ha em Phleum pratense. O tratamento resultou em aumento de ácido palmítico (18%), ácido linoléico (12%) e ácido linolênico (40%) na forragem e um aumento total de 26% de ácidos graxos. Não foram encontrados trabalhos que relacionassem outros elementos da fertilização, como fósforo, na concentração de CLA no leite. A idade da forragem influencia a quantidade de lipídios das pastagens, portanto, torna-se necessário desenvolver estudos para determinar a idade de rebrote mais adequada para incrementar os conteúdos de CLA no leite. A espécie forrageira também é determinante para o conteúdo e composição dos ácidos graxos das pastagens e, com isso, pode resultar em diferentes concentrações de CLA no leite (Tab. 3). Tabela 3. Perfil de ácidos graxos de diferentes espécies de gramíneas forrageiras Ácidos Graxos (%) Espécie C 14:0 C 16:0 C 18:0 C 18:1 C 18:2n6 C 18:3n3 Ryegrass 2,5 34 4,7 1,5 12,3 45,0 Alfafa 3,6 17,5 7,3 22,0 21,1 30,0 Quicuio - 15,1 4,8 3,8 22,5 53,8 Basilisk 4,6 34,4 9,5 14,7 14,4 20,3 Estrela 2,9 27,7 10,6 11,0 21,8 27,9 Fonte: Adaptado de CAVIEDES et al. (2011). Além de se identificar espécies forrageiras que possuam maior quantidade de precursores de CLA em seu perfil de ácidos graxos, seria importante, também, identificar espécies que tenham atividade reduzida das lipases, para que os ácidos graxos de cadeia longa cheguem ao ambiente ruminal sem que haja lipólises significativas. A sazonalidade do conteúdo de CLA no leite Vários trabalhos reportam uma variação na composição dos ácidos graxos do leite ao longo das diferentes estações do ano. Isso se deve principalmente ao fato de que as estratégias alimentares adotadas no inverno e no verão são diferentes para vacas criadas em sistemas de produção em pasto. Como há neve nos países de clima temperado durante o inverno, as vacas são mantidas em ambientes fechados e recebem alimentos conservados. Já os países de clima tropical caracterizam-se, geralmente, pelo inverno seco e, por isso, também adotam alimentos conservados para suprir a escassez de forragens verdes. Como consequência disso, ocorre variação sazonal da concentração de CLA, como pode ser observado na Fig. 2. O leite de vacas alimentadas com silagem de milho apresenta conteúdo de CLA reduzido, já que o grão presente na silagem contribui para diminuição do ph ruminal, que gera alteração do perfil da microbiota ruminal e, consequentemente, a bio-hidrogenação é diminuída. Figura 2. Variação sazonal da concentração de CLA do leite na Holanda. Fonte: Elgersma et al. (2006).

6 Nas silagens de capim, o murchamento reduz o conteúdo total de ácidos graxos em aproximadamente 30% e a fenação reduz o total de ácidos graxos para valores acima de 50%, similar à perda de pré-secados. (DOREAU & PONCET, 2000). Para minimizar os efeitos dessa sazonalidade no Brasil, a irrigação de pastagens pode ser uma excelente alternativa, porém seriam necessários estudos nesta área. Não foram encontrados, também, trabalhos que relacionem a quantidade de CLA no leite de vacas alimentadas com cana-de-açúcar no período seco do ano. Indivíduos, raças e CLA Segundo Kelsey et al. (2003), a raça, semelhança e estágio de lactação têm pouca relação na variação individual do conteúdo de CLA no leite. No entanto, essa variação existe e já foi relatada por diversos autores. Ela é atribuída a dois principais fatores: a) produção ruminal de ácido transvacênico e CLA e b) a atividade da enzima Δ9- dessaturase. Porém, a produção ruminal de ácido transvacênico e rumênico é relacionado à quantidade e tipo de bactérias que hidrogenam os substratos disponíveis. Portanto, a quantidade da enzima Δ9-dessaturase é o principal fator a ser levado em consideração na variação individual da concentração de CLA no leite e, em função disso, pode ser aplicada seleção genética dos animais para que se obtenham, em longo prazo, animais com maior capacidade de conversão de ácidos graxos de cadeia longa provenientes da dieta em CLA. CONCLUSÃO Vacas submetidas ao pastejo de forragens verdes e frescas produzem leite com maiores concentrações de CLA. O leite rico em CLA permite alto valor agregado aos produtores primários de um alimento tradicionalmente considerado commodity e o benefício à saúde humana, na diminuição da síntese de gordura corporal, na prevenção do câncer, diabetes e outras doenças. Para se produzir leite especificamente rico em CLA torna-se necessário avançar em pesquisas que dizem respeito: 1) À detecção de espécies forrageiras que possuam maior número de ácidos graxos de cadeia longa, os quais serão precursores do ácido rumênico, após a bio-hidrogenação ruminal e a ação das enzimas Δ9-dessaturases; 2) Ao manejo das pastagens, levando em consideração a idade de rebrota ou mesmo a interceptação de luz; 3) À fertilização das pastagens com diferentes níveis de adubação e sua relação com o conteúdo celular da planta forrageira, bem como a perfil de ácidos graxos; 4) Às estratégias para minimizar a sazonalidade do conteúdo de CLA, como a irrigação de pastagens e/ou suplementos (como óleo de peixe) que possam incrementar o CLA na estação seca, para que o produto seja bem aceito na indústria e mercado durante todo ano. 5) À seleção genética de animais que apresentem maior atividade das enzimas Δ9-dessaturases na glândula mamária. REFERÊNCIAS BAUMAN, D. E., BAUMGARD, L. H., CORL, B. A., GRIINARI, J. M. Biosynthesis of conjugated linoleic acid in ruminants. Proceeding of the American Society of Animal Science, BAUMAN, D. E., CORL, B. A., PETERSON, D. G. Conjugated linoleic acid (CLA) and the dairy cow. In: Recent advances in animal nutrition. (Garnsworthy, P. C., Wiseman, J. eds.); Nothingham University Press, Nothingham, BAUMAN, D. E., CORL, B. A., PETERSON, D. G. The biology of conjugated linoleic acids in ruminants. In: Advances in conjugated linoleic acid research; vol 2. AOCS Press, Champaim, IL, 2003a. BAUMAN, D. E., PERFIELD II J. W., DE VETH, M. J. LOCK, A. L. New perspectives on lipid digestion and metabolism in ruminants. Proc Cornell Conf, 2003b. BOUFAÏED, H., CHOUINARD, P. Y., TREMBLAY, G. F.,PETIT, H. V., MICHAUD, R., BÉLANGER, G. Fatty Acids in forages. I. Factors affecting concentratios. Can. J. Anim. Sci. 83, , CANDIDO, L. M. B.; CAMPOS, A. M. Alimentos funcionais. Uma revisão. Boletim da SBCTA. v. 29, n. 2, p , CAVIEDES, J. M. L., RESTREPOL, M. L. P., FORNAGUERA, J. E. C. Relación entre lãs características de la pastura y el contenido de ácido linoleico conjugado (ALC) em la leche. Sitio Argentino de Producción Animal, CHILIARD, Y., FERLAY, A., DOREAU, M. Effect of different types of forages, animal fat or marine oils in cow s diet on milk fat composition, especially conjugated linoleic acid (CLA and polyunsaturated fatty acids. Livest. Prod. Sci. 70, 31-48, COSTA, R. G., QUEIROGA, R. C. R. E., PEREIRA, R. A. G. Influência do alimento na produção e qualidade do leite de cabra. R. Bras. Zootec., v.38, p , 2009 (supl. especial). DOREAU, M., PONCET, C. Ruminal biohydrogenation of fatty acids originating from fresh or preserved grass. Repr. Nutr. Dev. 40, 201, ELGERSMA, A., TAMMINGA, S., DIJKSTRA, J. Lipids in herbage. Their fate in the rúmen of dairy cows na

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