biotecnológicas Estratégias O problema: Marta Vasconcelos

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1 Estratégias biotecnológicas para o combate ao NMP Marta Vasconcelos Arganil,, 3 de Fevereiro de 2010 O problema: O nemátode da madeira do pinheiro (NMP) é considerado uma das mais graves e letais pragas a nível mundial Está a destruir os pinhais portugueses (e não só ) Detectado pela primeira vez no nosso país em 1999, encontra-se presente em diversos distritos a centro/sul do país e na Madeira Declaração da totalidade do território nacional (continente) como zona afectada (Portaria 553-B/ 2008, de 27 de Junho de 2008). 1

2 A biotecnologia para combater o NMP BioTecnologia: TECNOLOGA baseada na BOlogia Definição das Nações Unidas Qualquer aplicação tecnológica que use um sistema biológico, organismos mortos ou derivados destes, para produzir ou modificar produtos para um uso específico. Estratégias 1. dentificação de genótipos resistentes 2. dentificação de locus de resistência 3. Vacinação de plantas (munização) 4. Transformação genética de pinheiro com genes de resistência 5. Utilização de micorrizas para criação de resistência 6. Monitorização de resistências em material diverso 2

3 Materiais na UCP-ESB Várias estirpes de nemátodes virulentos 1 estirpe de nemátode não virulento Várias espécies de pinheiro (de semente) Plântulas de viveiro de Pinus pinea e Pinus Pinaster Plântulas de espécies florestais diversas 1. dentificação de genótipos resistentes 3

4 Prospecção de árvores em zonas afectadas Local de estudo: Herdade da Comporta, concelho de Alcácer do Sal Georeferenciação de árvores 4

5 Colheita de material em árvores seleccionadas na Herdade da Comporta Material recolhido em árvores seleccionadas na Herdade da Comporta Localização dos quatro núcleos n de árvores seleccionadas na Herdade da Comporta: Pinheiro da Cruz, Possanco,, Miradouro e Oleoduto 5

6 Localização das árvores seleccionadas com indicação dos três níveis observados, relativamente à cor das agulhas, no local Comporta-Oleoduto Oleoduto.. nformação recolhida em Novembro de Esquematização da localização das amostras recolhidas nas árvores mortas para identificação da presença a de nematóde Distribuição do número n de árvores abatidas pelas cinco classes de frequência de nemátodes definidas para as amostras recolhidas nos três níveis n da copa estudados (Base, ntermédio e Topo). 6

7 Comparação da percentagem de nemátodes juvenis com machos, fêmeas encontrados nas 40 árvores abatidas na Herdade da Comporta Estabelecimento de descendências de geração e meia Figura 11- Aspecto geral da sementeira das descendências dos 16 clones do pomar testado do Escaroupim 7

8 Árvore nº Março 2009 Localidade: Comporta Sul Coordenadas: 38º 16,586 N 8º 43,752 W Altitude: Observações: Seleccionada no dia ; Foto ; Colheita de pinhas em Abril de 2009; nspeccionada a ; Foto ; a morrer, muito castanha; área muito devastada com muitas cortadas; nspeccionada a ; Foto ; morta; Abatida a para despiste de causa de doença; Altura 17,1 m DAP 40,5 cm Foto BR Foto BR 2. dentificação de locus de resistência 8

9 Caracterização genotípica das árvores seleccionadas por Microssatélites e AFLPs Maceração do material vegetal. 1ª amplificação pré selectiva Água Ultr a Pur a Estéril Mg Cl 2 visualização de smears e confirmação da ocorrência das reacções de corte e de préamplificação. M Dendrograma relativo à análise de 63 árvores de pinheiro-bravo da Herdade da Comporta, obtido a partir da distância genética do inverso dos alelos partilhados e pelo método de agrupamento hierárquico UPGMA, utilizando o software NTSYSpc version 2.10s (Rohlf, 1989). 9

10 Árvore PF285 Árvore 242 Electoforetograma referente à análise das árvores nº PF285 e 242 da Herdade da Comporta com a combinação de primers E-ACG/M-CAG. 3. Vacinação de plantas 10

11 + = Pinheiro susceptível Nemátode virulento munização: + = + = + Pinheiro susceptível Nemátode avirulento Pinheiro resistente Nemátode virulento Erlenmeyer contendo cevada inoculada com Botrytis cinerea Estufa contendo placas de Petri e Erlenmeyers de 100mL com culturas de fungo e NMP 11

12 Plântulas de P. pinaster e P. pinae em varanda, na Escola Superior de Biotecnologia Plântulas de P. pinaster (frente) e P. pinae (fundo) em fitoclima Table 1 Symptom development in P. pinaster (PP), P. pinea (PPi), P. nigra (Pni) e P. sylvestris (Psy), before (T0), 10 days (T10) and 20 days (T20) after inoculation with sterile water (H2O), avirulent strain (A) and virulent strain (HF) Treatment conditions T0 ncubation time (days) T10 T20 PPH 2 O PPA PPHF V PPiH 2 O PPiA PPiHF PniH 2 O PniA PniHF PsyH 2 O PsyA PsyHF 12

13 4. dentificação de genes de resistência Extracção de RNA de tecidos de P. pinaster e P. pinea M RNA de pinheiro bravo e pinheiro manso (agulhas, ramos, infectados ou não infectados) 13

14 G en e P. p in as te r H2 0 T0 T1 0 T2 0 T0 C1 4-5 T10 T2 0 T0 HF T10 T2 0 V A TT RX MA T2 /S AM 2 PR4 S H ER PE RD SEP POR A Sin tomas Figu ra 3: E xp res sã o ge né tic a m o nito riz ad a po r RT-PC R a nt es (T0 ), 1 0 d ias (T1 0 ) o u 2 0 dias (T 20 ) a pó s in oc u la çã o c o m á gu a, ne m át od e n ão virulen to (C1 4-5 ) e v iru le nt o (H F). 5. Transformação com genes de resistência 14

15 Transformação genética de pinheiro com genes de resistência Pretende-se obter plantas jovens de pinheiro bravo com expressão dos genes de resistência ao nemátode identificados previamente 6. Utilização de micorrizas para criação de resistência 15

16 Micorrização de Pinus pinea e Pinus pinaster com fungos ECM (Suillus spp., Rhizopogon spp., Pisolitus spp., Paxillus spp., Laccaria spp., Lactarius spp., Hebeloma spp.) para ensaios laboratoriais de inoculação noculação de plântulas previamente micorrizadas e não micorrizadas, com estripes virulentas de nemátodo Estabelecimento de microcosmos 16

17 7. Monitorização de resistência ou susceptibilidade noculações controladas noculações de Pinheiro bravo e manso por diversos métodos: Papel de filtro Callus Raspagem 17

18 Avaliação de resistência através de ramos segmentados 20 cm 2 cm Agradecimentos MADRP, FAP.P., AFN, FORESTS Colaboradores/Consultores: Equipa NRB, BET, Hajime Kosaka, Dr. Aikawa, Dr. Manuel Mota, Dra. Paula Castro Grupo ESB 18

19 MUTO OBRGADA PELA VOSSA ATENÇÃO 19