ESTUDOS MOLECULARES EM PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA DO SUL DO BRASIL

Transcrição

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA ESTUDOS MOLECULARES EM PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA DO SUL DO BRASIL Carla Streit Orientador: Prof. Dr. Roberto Giugliani Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Bioquímica como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Porto Alegre, agosto de 2003.

2 Ao meu pai, Claudionor Streit, que sempre investiu e acreditou na minha formação profissional e, principalmente, pessoal.

3 A busca constante e ordenada pelo saber nos gratifica com o título maior de eterno aprendiz. J.C.B.Wagner

4 AGRADECIMENTOS Ao Professor Roberto Giugliani, pela confiança e oportunidade. À Drª Maria Luiza Pereira pela orientação em todas as etapas da realização deste trabalho, e sobretudo, pela sua amizade incessante. Ao Serviço de Pneumologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre em especial ao Dr. Fernando de Abreu e Silva e sua equipe pelo apoio e orientação. Aos pacientes e seus familiares pela colaboração e adesão. À Associação Gaúcha de Assistência à Mucoviscidose (AGAM) pela prontidão sempre dedicada. Ao Antônio Carlos Burlamaque Neto que muito me auxiliou na realização deste trabalho. Ao acadêmico de medicina Haley Calcagnotto, pelo auxílio na ánalise dos achados clínicos. Ao grupo de trabalho do Laboratório de Biologia Molecular do Serviço de Genética Médica (SGM) pela amizade. À todos os funcionários, professores e bolsistas do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre pelo convívio e amizade. À Drª Ann Harris e a equipe do Institute of Molecular Medicine John Radcliffe Hospital de Oxford, pela acolhedora receptividade. Às fontes financiadoras de pesquisa CNPq, FAPERGS e FIPE-HCPA. Ao João Patrício Herrmann, pelo apoio e amizade. À minha família e aos meus amigos pelo carinho e compreensão. Ao João Carlos Wagner pelo companheirismo infindável e pelo exemplo de força e mérito. Enfim, agradeço a todos aqueles que tornaram seus, os meus objetivos de realização deste trabalho e obtenção deste título.

5 SUMÁRIO Resumo Abstract Lista de figuras Lista de tabelas Abreviaturas 1. Introdução Fibrose Cística (FC) Contexto histórico Aspectos moleculares Mapeamento e identificação do gene da FC Estrutura molecular do gene RNA mensageiro e a proteína CFTR A mutação F Outras Mutações Descritas As mutações e a heterogeneidade populacional Genética de populações da FC Manifestações clínicas Correlação entre genótipo e fenótipo Aspectos bioquímicos e fisiológicos Fibrose Cística no Brasil Diagnóstico de FC Justificativa Objetivos Resultados Artigo I: CFTR Gene: Molecular analysis in patients from South Brasil Artigo II: Molecular analysis of a variable length polythimidine tract in the CFTR gene of cysitic fibrosis from south Brasil 41 I III V VI VII Pg.

6 Pg. 5. Discussão Introdução Análise da amostra A heterogeneidade populacional brasileira Idade de diagnóstico de FC no Rio Grande do Sul Freqüência das mutações Correlações genótipo-fenótipo Fatores epigenéticos envolvidos na patologia de FC Diagnóstico molecular de FC Limitações do protocolo utilizado Considerações finais Perspectivas futuras Conclusões Referências bibliográficas e informações eletrônicas Anexos Caracterização da população estudada Coleta e armazenamento das amostras Oligonucleotídeos iniciadores (Primers) Protocolo laboratorial Extração de DNA genômico a partir de sangue Purificação do DNA extraído Amplificação do DNA genômico pela reação em cadeia da polimerase (PCR) Análise dos produtos amplificados em gel de agarose Análise de polimorfismos conformacionais de cadeia simples (SSCP ou SSCA) Digestão com enzimas de restrição Fundamentação da detecção de mutações com endonucleases de restrição Análise estatística Resultados Exemplificação da amplificação do exon 7 por PCR 118

7 Pg Exemplificação da análise do exon 7 por SSCP Exemplificação da análise do exon 4 por seqüenciamento direto de dna do gene CFTR (detecção da mutação R117H) Ficha clínica do paciente 121

8 RESUMO Fibrose Cística (FC) ou mucoviscidose é uma das doenças hereditárias mais comuns em caucasóides, com uma freqüência estimada em um caso em cada 2000 nascimentos sendo a freqüência de indivíduos portadores estimada em 5% em indivíduos. Esta doença caracteriza-se principalmente por infecções e obstrução crônica do aparelho respiratório, insuficiência pancreática exócrina e suas conseqüências nutricionais e por elevados níveis de eletrólitos no suor. A apresentação clínica, a gravidade da doença e a velocidade de progressão da FC variam consideravelmente, incluindo-se entre as manifestações a agenesia congênita de vasos deferentes (ACVD). Dentre as 1006 mutações associadas à FC, a R117H foi descrita em associação com um sítio polimórfico de timidinas no intron 8 do gene CFTR, a qual pode estar relacionada a ACVD. Este trabalho teve como objetivos: 1 identificar alterações nas seqüências de nucleotídeos dos exons 3, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 19, 20 e 22 do gene CFTR; 2 identificar a freqüência de algumas mutações freqüentes no gene CFTR (R347P, R347H, R334W, Q359K, G542X, G551D, R553X, S549N, R1162X, W1282X e N1303K) na amostra e estimar a freqüência destas mutações na população estudada; 3 determinar o genótipo dos pacientes com FC participantes do estudo; 4 estabelecer um protocolo eficiente e rápido para identificar as alterações de politimidinas em pacientes não homozigotos para a mutação F508; 5 estabelecer a freqüência dos alelos 5T, 7T e 9T em pacientes com FC do sul do Brasil; 6 estabelecer a correlação do polimorfismo politimidinas com manifestações clínicas da doença, como por exemplo, azoospermia. Para a identificação das mutações no gene CFTR foram avaliados 100 alelos ou 50 pacientes portadores de FC. No entanto, para a avaliação do polimorfismo de politimidinas foram avaliados 54 pacientes não relacionados. Estes pacientes foram previamente diagnosticados e se encontram em tratamento no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Após extração de DNA destes pacientes, o material foi amplificado por PCR utilizando-se primers específicos para as regiões de interesse. A identificação de alterações nas seqüências de nucleotídios foi possível através da técnica de SSCP. Esta

9 técnica permitiu a detecção de 7 pacientes com alteração no exon 7, 3 pacientes com alterações no exon 11, 2 pacientes com alterações no exon 19 e de 3 pacientes com alterações no exon 20. Nenhum paciente apresentou alteração molecular nos exons 3, 4, 5, 12 e 22. As freqüências das mutações R334W, R1162X e W1282X na amostra estudada foram estabelecidas em 1,0% para cada uma delas. Não foram encontrados pacientes portadores das mutações R347P, R334H, Q359N e S549N na amostra estudada. Com a utilização deste protocolo associado ao do estudo anterior (Streit et al., 1999) foi possível a triagem de mutações em 44,4% do gene da FC. O alelo 5T foi encontrado em 2 dos 108 alelos analisados. Já o polimorfismo 7T, o mais comum, foi detectado em 65 alelos, enquanto o polimorfismo 9T estava presente em 41 alelos. O genótipo mais comum estabelecido no presente estudo foi o 7T/9T, encontrado em 39 pacientes (72,2%), seguido do genótipo 7T/7T, encontrado em 12 pacientes (22,2%), e do 5T/7T, encontrado em 2 pacientes (3,7%) e, finalmente, do genótipo 9T/9T, em 1 paciente (1,85%). Os resultados obtidos sugerem que o fenótipo dos pacientes com FC estudados não resulta apenas do genótipo dos mesmos, pois existem pacientes com o mesmo genótipo e expressões fenotípicas diferentes. Fatores epigenéticos assim como ambientais devem influenciar a expressão das alterações moleculares. Entretanto, a identificação do defeito molecular básico é de fundamental importância para a confirmação precoce e precisa do diagnóstico em pacientes suspeitas e para o estudo familiar permitindo que as medidas de tratamento e prevenção sejam implementadas do modo mais eficiente.

10 ABSTRACT Cystic Fibrosis (CF), or mucoviscidosis, is one of the most common genetic disease in Caucasians, with an incidence of one case in every 2000 lifebirths, giving a frequency of 5% in the general population. CF is an autosomal recessive disorder characterized mainly by chronic pulmonary illness, pancreatic exocrine insufficiency and high levels of sweat electrolytes. Clinical manifestations and severity of this disease varies greatly among patients including congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD). Up to date, more than 1000 mutations are associated with CF, and R117H mutation was related to a variable length of a polythymidine tract in intron 8 of CFTR. This polymorphism could be related to CBAVD in CF patients. The present work aimed to identify molecular alterations in the nucleotide sequence of exons 3, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 19, 20 and 22 of the CFTR gene; to establish the frequency of some common mutations in the CFTR gene (R347P, R347H, R334W, Q359K, G542X, G551D, R553X, S549N, R1162X, W1282X and N1303K) in our sample; to establish the genotype of CF patients included in this study; to establish a rapid and accurate protocol to identify the polythymidines tract; to establish the frequency of the 5T, 7T and 9T alleles in patients from South region of Brazil; to establish a relationship between polythymidines and clinical manifestation, such as male infertility. Hundred alleles or fifty unrelated patients were analyzed to identify specific mutations in the CFTR gene. Fifty-four CF patients were analyzed to identify identify the polythymidines tract in intron 8 of the CFTR gene. These patients were previously diagnosed and are currently under treatment in the Pneumology Service of the HCPA. Following DNA extraction, regions of interest were amplified by PCR using specific primers. Using the SSCP protocol, seven patients were found to have a sequence alteration in exon 7, 3 patients in exon 11, 2 patients in exon 19 and 3 patients in exon 20. No alterations were detected in exons 3, 4, 5, 12, and 22. Frequencies of mutations R334W, R1162X, and W1282X in the studied sample were established to be 1.0% for each mutations. No alleles carried mutations R347P, R334H, Q359N, and S549N in this sample. This

11 protocol associated to a previous study (Streit et al., 1999) screened 44.4% of the coding region of CFTR. The 5T allele was present in 2 alleles out of 108 alleles tested; while allele 7T, the most common, was detected in 65 alleles. The 9T was present in 41 alleles. The most common genotype established in the present study was 7T/9T identified in 39 patients (72.2%), followed by genotype 7T/7T in 12 patients (22.2%), and 5T/7T, detected in 2 patients (3.7%) and, finally, the genotype 9T/9T, founded in one patient only (1.85%). Our results suggested that the phenotype of CF patients is influenced by many factors due to the fact that patient can carry same genotype and show different clinical presentation of the disease. CF is a genetically heterogeneous and complex disorder, involving mutations, variants of the CFTR gene and epigenetic factors. This study is important to help families at risk, in addition to provide diagnosis confirmation and an earlier and accurate diagnosis for CF patients.

12 LISTA DE FIGURAS Pg. Parte 1. Figura 1.1- O gene e a proteína CFTR 5 Figura 1.2- Estrutura prevista da proteína CFTR 7 Figura 1.3- Representação das cinco classes de mutações responsáveis por FC 20 Parte 8. Figura 8.1- Protocolo laboratorial empregado no presente estudo 98 Figura 8.2- Protocolo laboratorial empregado para a investigação de politimidinas no presente estudo 99 Figura 8.3- Seqüência de oligonucleotídeos de regiões do CFTR 104 Figura 8.4 Amplificação do exon 7 do gene CFTR 118 Figura 8.5- Análise do exon 7 pela técnica de SSCP do gene CFTR 119 Figura 8.6- Análise do exon 4 pela técnica de seqüenciamento direto de DNA (primer utilizado no sentido 3 a 5 ) 120 Figura 8.7- Análise do exon 4 pela técnica de seqüenciamento direto de DNA (primer utilizado no sentido 5 a 3 ) 120

13 LISTA DE TABELAS Pg. Parte 1. Tabela 1.1- Localização das mutações mais freqüentes no gene CFTR 10 Tabela 1.2- Freqüência relativa de mutações no gene CFTR em diferentes populações 12 Tabela 1.3- Resultados de estudos realizados no Brasil 26 Parte 5. Tabela 5.1- Número de pacientes identificados com alterações pela técnica de SSCP em seus respectivos exons 65 Tabela 5.2- Mutações específicas pesquisadas 66 Tabela 5.4- Genótipo do gene CFTR para os 54 pacientes 72 Parte 8. Tabela 8.1- Idade dos pacientes no momento do diagnóstico 94 Tabela 8.2- Relação de oligonucleotideos iniciadores utilizados neste estudo 95 Tabela 8.3- Protocolo básico para as reações de amplificação por PCR 107 Tabela 8.4- Condições de amplificação 108 Tabela 8.5- Fragmentos do gene CFTR analisados neste estudo 112 Tabela 8.6- Detecção das mutações R334W, R347H, R347P, Q359K, S549N e W1282X no gene CFTR 114

14 ABREVIATURAS 1X uma vez 5X cinco vezes 10X dez vezes A adenina ACVD agenesia congênita de vasos deferentes camp adenosina monofosfato cíclico datp 2 -desoxiadenosina 5 -trifosfato APS persulfato de amônio ATP adenosina trifosfato BRL Bethesda Research Laboratories BSA albumina de soro bovino C citosina CFTR Condutância Transmembrânica da Fibrose Cística ºC graus Celsius dctp 2 -deoxicitidina 5 -trifosfato Co. Companhia CO 2 dióxido de carbono cdna ácido desoxirribonucleíco complementar DMSO dimetil sulfóxido DNA ácido desoxirribonucleíco del deleção EDTA ácido etilenodiaminotetracético FC fibrose cística G guanina g grama dgtp 2 -desoxiguanosina 5 -trifosfato HCl ácido clorídrico HCPA Hospital de Clínicas de Porto Alegre

15 Ins inserção IP insuficiência pancreática IRT tripsinogênio imunorreativo Kb quilobases KDa quilodaltons L litro M molar µg micrograma µg/ml micrograma por mililitro µl microlitro meq/l miliequivalente por litro mg miligrama mg/ml miligrama por mililitro ml mililitro min minuto mm milimolar mrna ácido ribonucleíco mensageiro MSD domínio de expansão de membrana (membrane spanning domain) NBD domínio de ligação de ATP (nucleotide binding domain) ng nanograma dntp desoxinucleotídeo trifosfato pb pares de bases PCR reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) PGE 2 prostaglandina E 2 PM peso molecular ρmol/µl picomoles por microlitro PrS prova do suor p/v peso/volume

16 q.s.p. quantidade suficiente para RD domínio regulatório (regulatory domain) RFLP polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição (RestrictionFragment Length Polymorphism) RNA ácido ribonucleíco rpm rotações por minuto RT-PCR PCR de transcrição reversa SDS dodecil sulfato de sódio SGM Serviço de Genética Médica SSCP conformação de polimorfismos de cadeia simples SP suficiência pancreática T timina dttp 2 -desoxitimidina 5 -trifosfato TBE tris/ácido bórico/edta TE tris-edta TEMED tetrametiletilenodiamina TR repetições seqüênciais nas mucinas (Mucin tanden repeats) Tris tris-(hidroximetil)-aminoetano U/µL unidades por microlitro U/mL unidades por mililitro v/v volume/volume V volts W watts

17 Parte 1 INTRODUÇÃO Pg FIBROSE CÍSTICA CONTEXTO HISTÓRICO ASPECTOS MOLECULARES MAPEAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DO GENE DA FC ESTRUTURA MOLECULAR DO GENE RNA MENSAGEIRO E A PROTEÍNA CFTR A MUTAÇÃO F OUTRAS MUTAÇÕES DESCRITAS AS MUTAÇÕES E A HETEROGENEIDADE POPULACIONAL GENÉTICA DE POPULAÇÕES DA FC MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS CORRELAÇÃO ENTRE GENÓTIPO E FENÓTIPO ASPECTOS BIOQUÍMICOS E FISIOLÓGICOS FIBROSE CÍSTICA NO BRASIL DIAGNÓSTICO DE FC 25

18 1.1- FIBROSE CÍSTICA Fibrose Cística (FC) ou mucoviscidose é uma das doenças hereditárias mais comuns em caucasóides, com freqüência estimada em um caso em cada 2000 nascimentos (Rommens et al., 1989). A freqüência calculada de indivíduos portadores de mutações no gene da FC é de aproximadamente 5% em indivíduos normais caucasóides (Rommens et al., 1989). Atualmente, existem mais de indivíduos afetados no mundo (Colledge, 1994). A FC é um importante problema médico, pois esta é uma patologia complexa, crônica, grave, envolvendo diversos sistemas orgânicos. É caracterizada, principalmente, por infecções e obstrução crônica do aparelho respiratório, insuficiência pacreática exócrina e suas conseqüências nutricionais e por elevados níveis de eletrólitos no suor. FC está associada a uma morbidade e mortalidade em jovens adultos (Welsh et al., 2001) CONTEXTO HISTÓRICO A primeira menção quanto às características relevantes nos pacientes com FC está na própria denominação conferida pelo patologista Landsteiner em 1905 ao descrevê-la como fibrose cística do pâncreas, uma enfermidade do pâncreas exócrino, não envolvendo as ilhotas de Langherans. Landsteiner já constatara em alguns pacientes recém-nascidos, a concomitância de íleo meconial. Em 1936, Fanconi e colaboradores descreveram uma síndrome celíaca com alterações pancreáticas, percebidas por eles como diferentes da doença celíaca típica (Campos et al., 1996). Em 1938, Dorothy Andersen, em um estudo minucioso, associou definitivamente as lesões pancreáticas às pulmonares, indicando também o íleo meconial como manifestação mais precoce da doença. Assim, Andersen consolidou a FC como uma entidade clínica autônoma, multissistêmica, com uma incidência familiar significativa. Farber, em 1944, observou o caráter anormal espesso e viscoso das secreções mucosas das várias glândulas exócrinas. Este cientista conferiu a designação de mucoviscidose à doença, enfatizando o bloqueio dos ductos pancreáticos e da árvore brônquica por esta secreção anômala (Campos et al., 1996). Em 1946, sugeriu-se, pela primeira vez,

19 o padrão de herança autossômico recessivo. Um passo essencial para o diagnóstico foi dado em 1953, quando Di Sant Agnese e colaboradores demostraram o teor anormalmente elevado de íon cloreto no suor (Campos et al., 1996). Em seguida, Schwachman e colaboradores, com base nas observações feitas por Di Sant Agnese em , pesquisaram as taxas de eletrólitos no suor, o que hoje é um referencial no diagnóstico de FC, conhecido universalmente como prova do suor (PrS). Em 1970, Campos e Szterling registraram grandes avanços sobre a estrutura das membranas celulares, com enfoque na dinâmica do transporte de íons por canais bioquímicos e na presença de permeases ou proteínas na estrutura bilipídica da membrana apical. Estes pesquisadores buscaram subsídios científicos na seqüência gene-enzima-rota bioquímica, retomando os antigos ensinamentos de Garrod que, em 1908, propusera o conceito dos erros inatos do metabolismo. Na revisão realizada por Campos e Szterling foi chamada a atenção para a hipótese de Johansen e colaboradores sobre as bombas celulares de íons cloreto e sódio na FC (Campos et al., 1996). Em 1983, Paul Quinton descreveu que a permeabilidade do escoamento do íon cloreto para os ductos estava defeituosa em pacientes com FC (Quinton, 1983). Canais apicais para o íon cloreto estavam presentes, mas sua regulação pelo AMP-cíclico mostrava-se alterada. Sabe-se hoje que, para tal alteração, concorre um comprometimento estrutural de uma proteína reguladora da condutância transmembrânica da fibrose cística (cystic fibrosis transmembrane condutance regulator - CFTR). Quinton e Bijman em 1983 registraram altos potenciais bioelétricos a nível da membrana devidos ao decréscimo da absorção de íon cloreto nas glândulas sudoríparas dos pacientes com FC (Quinton e Bijman, 1983). Em 1984, Anderson comentou as alterações do metabolismo de prostaglandina E 2 (PGE 2 ) e a associação destas alterações com FC (Campos et al., 1996). Em 1985, surge a primeira indicação da presença do gene da FC no cromossomo 7 (Wainwright et al., 1985). Em 1989, foi descoberto o gene que, quando defeituoso, causava FC e o defeito na proteína produzida pelo gene CFTR. Com base em pesquisas realizadas de mapeamento genético e físico foi

20 possível a realização de estudos de clonagem molecular com pequenos segmentos de DNA do cromosssomo ASPECTOS MOLECULARES O defeito bioquímico primário na FC permaneceu desconhecido até alguns anos atrás, quando o isolamento do gene relacionado a esta doença proporcionou as informações necessárias para a melhor compreensão da estrutura da proteína, da sua função e do efeito de mutações neste gene. A maior dificuldade no mapeamento e identificação do locus da FC foi a falta de translocações e deleções cromossômicas conhecidas e associadas com a doença. Várias estratégias e técnicas moleculares de clonagem foram empregadas na tentativa de isolar o gene e este objetivo foi alcançado em 1989 através de protocolos de "triagem do cromossomo" (chromosome walking and jumping) (Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989) MAPEAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DO GENE DA FC Em 1985, encontrou-se ligação genética entre a enzima paraxonase e a fibrose cística (Eiberg et al., 1985). Entretanto, a localização cromossômica do gene da paroxanase não era bem conhecida. Nesse mesmo ano encontrou-se uma forte ligação genética entre a FC e um marcador polimórfico de localização desconhecida (DOCRI-917), posteriormente localizado no cromossomo 7 (Knowlton et al., 1985). Análise de ligação utilizando um grande número de marcadores polimórficos de DNA reduziram a possível região para o locus do gene da FC a cerca de 700 kilobases (kb). Foi localizado, então, o gene da FC no braço longo do cromossomo 7, na região q31-32 (figura 1.1) (Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). Em 1989, o gene responsável pela FC foi identificado. Uma região do DNA de 250kb foi isolada através de uma série de experimentos de clonagem molecular que se basearam no isolamento de pequenos segmentos da região de interesse.

21 a) Gene CFTR (a) Gene CFTR b) Proteína CFTR MSD1 NBD1 Domínio R MSD2 NBD2 Figura 1.1: O gene e a proteína CFTR. (a) Organização exon-intron do CFTR. Os exons são indicados por retângulos. (b) Estrutura do polipeptídeo com seus múltiplos domínios. (Reproduzido de Welsh et al.; 2001). Estes fragmentos foram purificados e testados para a presença de seqüências codificadoras (Rommens et al., 1989; Welsh et al., 2001) ESTRUTURA MOLECULAR DO GENE O gene da FC engloba 250kb de DNA genômico (Welsh et al., 2001). A região codificante do gene está dividida em 27 exons numerados de 1 a 24, mas incluindo os exons 6a e 6b, 14a e 14b e 17a e 17b (figura 1.1). A maioria desses exons compreendem entre 50 a 250 pb, com exceção do exon 13 (Harris, 1992). O tamanho médio dos exons é de 200pb. O exon 6a é o menor e mede 38pb, enquanto o exon 13 é o maior, com um tamanho de 723pb. A seqüência de nucleotídeos dos exons e de suas seqüências flanqueadoras é conhecida e é altamente conservada em espécies distintas, incluindo as que apresentam grande divergência evolutiva (Tuker et al., 1992). Estes exons codificam a síntese de uma proteína denominada regulador de condutância transmembrânica da fibrose cística ou cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). O tamanho dos introns também é muito variável, ficando na faixa de 1,1kb (intron 6a) e 40kb (intron 3).

22 RNA MENSAGEIRO E A PROTEÍNA CFTR O mrna produzido pelo gene CFTR apresenta aproximadamente 6,5kb e pode ser identificado em uma grande variedade de tecidos afetados, incluindo o pulmão, o pâncreas, as glândulas sudoríparas, os pólipos nasais, as glândulas salivares e o cólon (Welsh et al., 2001). Considerando a seqüência do DNA complementar (cdna) do CFTR, a estrutura desta proteína filamentar é composta por 1480 aminoácidos, com uma massa molecular de aproximadamente 168 kda (Harris, 1995; Welsh et al., 2001) (figura 1.2). Esta proteína é definida como uma peça bioquímica fundamental, a qual é transportada do local de síntese (núcleo) para a membrana celular apical e direcionada através do retículo endoplasmático. Esta proteína ancora-se na estrutura bilipídica da membrana em áreas hidrofílicas e hidrofóbicas afins (Campos et al, 1996). Um verdadeiro canal é formado por um longo filamento da CFTR, numa adaptação conformacional, por sobreposição em alças (Welsh et al., 2001). Nessa disposição transmembrânica, esse canal direciona e regula os fluxos bidirecionais de água e íons cloreto no sentido do ambiente intracelular para o extracelular e vice-versa. Entre os vários canais iônicos normalmente existentes na membrana, este é o chamado canal do cloro ligado à CFTR, cuja regulação, também bidirecional, de abertura e fechamento, é ativada por fosforilação e intermediada pelo camp na presença de ATP. O CFTR é um componente da família das glicoproteínas de transporte que necessitam de ligação de ATP (Hyde et al., 1990). A estrutura da proteína pode ser dividida em cinco regiões: duas regiões que se estendem pela membrana, duas regiões de ligação de nucleotídios e uma região regulatória (figura 1.2) (Harris, 1995; Welsh et al., 1995; Patrizio e Zielenski, 1996). As duas regiões que se estendem pela membrana são compostas por 6 segmentos intra-membrânicos (hidrofóbicos) e são denominados domínios de expansão de membrana (MSD). Os dois domínios de ligação de nucleotídios (NBD) interagem com o ATP (figura 1.1).

23 EXTERNO Externo MEMBRANA Membrana Amino-terminal NBD1 Domínio R NBD2 INTERNO Carboxi-terminal Figura 1.2: Estrutura prevista da proteína CFTR. (Reproduzido de Harris e Argent, 1993). Finalmente, a região regulatória (RD), localizada na porção intermediária da molécula do CFTR, é codificada por um único exon (exon 13) e contém múltiplos sítios de fosforilação para proteína kinases A e C (Harris e Argent, 1993; Welsh et al., 1995; Patrizio e Zielenski, 1996). Tanto na secreção da glândula sudorípara quanto na secreção epitelial dos brônquios existem falhas bidirecionais no transporte de íon cloreto pelo canal específico dirigido pela proteína CFTR. Quanto à secreção de suor na FC, a disfunção, isto é, a falha da captação eficiente pelo canal de cloreto, que é ionicamente acompanhada por proporcional interferência no transporte de sódio, situa-se no bordo apical das células epiteliais que recobrem os ductos finos das glândulas sudoríparas (Quinton, 1983). A secreção fluida e serosa, que é hipertônica na parte mais profunda da glândula devido a falta da captação ativa de cloreto, compromete a transferência facilitada do sódio ao passar pela área tubular. Entretanto, ao invés do suor tornar-se hipotônico, quase desionisado, levemente salino, acaba atingindo a superfície da pele com

24 taxas iônicas elevadas. Este fato explica o suor salgado dos pacientes e sua fragilidade à desidratação pelo calor e quando expostos ao sol. Quanto à secreção brônquica, do tipo mucoso, Knowles e colaboradores (1983) demonstraram que na FC existe uma diminuição no transporte direcional do íon cloreto da membrana apical das células epiteliais para a superfície do lúmem. Entretanto, a captação de sódio está aumentada no sentido oposto. Haveria uma compensação direcional em sentido oposto, isto é, na condução de sódio e água para o interior da célula, visando a eletroneutralidade. A redução da água retirada do fluído peri-ciliar ou perimicrovilositário de ambas camadas de superfície do glicocálix, conduziria ao espessamento do muco característico da FC (Campos, 1993b) A MUTAÇÃO F508 A mutação mais freqüente encontrada associada à FC é uma deleção do codon 508 (CTT - 3 pares de bases) no 10 0 exon causando a perda de um resíduo de fenilanina na posição 508 da proteína (Kerem et al., 1989); sendo denominada F508. Esta mutação é responsável por aproximadamente 68% dos genes mutantes causadores de FC em diferentes populações pelo mundo (Welsh et al., 2001). Os cromossomos portadores da deleção 508, possivelmente derivaram de um único evento mutacional (Russo et al., 1995). A mutação F508 interrompe o processo de biossíntese de CFTR sendo que a proteína fica retida no retículo endoplasmático, sendo degradada. Como resultado, na membrana apical do epitélio afetado, falta a proteína CFTR e falta a estimulação de camp que permite a permeabilidade aos íons cloreto (Zeiher et al., 1995). Portanto, a mutação F508 está associada às manifestações clínicas graves de FC; entretanto, existe ainda uma grande variabilidade do grau de comprometimento da doença entre as pessoas que apresentam esta mutação e quando em combinação com outra mutação no CFTR (homozigotos ou heterozigotos compostos). Insuficiência pancreática (IP) está associada à F508, pois esta manifestação clínica foi encontrada em 99% dos pacientes homozigotos para esta mutação e em 72% dos heterozigotos para a deleção, enquanto que

25 apenas 36% dos pacientes com outras mutações apresentaram IP (Kerem et al., 1990a). A distribuição da mutação F508 na Europa apresenta freqüência elevada no nordeste europeu e mais baixa no sudeste da Europa. Isto ocorre, provavelmente, devido à dispersão desta mutação pelos primeiros fazendeiros que migraram do médio oeste durante o período Neolítico. A difusão do gene pode ter sido favorecida por uma vantagem seletiva conferida a ele. Uma alta freqüência desta mutação foi encontrada em províncias Bascas, uma das populações mais antigas da Europa, onde a incidência de FC era de aproximadamente 1:4500 indivíduos. Triagens de mutações realizadas em milhares de famílias com casos de FC demonstraram que cerca de 75% dos cromossomos mutados no locus da FC na população do Norte da Europa (McIntosh, Lorenzao e Brock, 1989) e da América do Norte (Kerem et al., 1989b) apresentam a deleção F508. Em algumas populações essa mutação não é tão freqüente. No sul da Europa, somente 50% dos alelos mutados apresentam a mutação F508 e, quanto mais nos aproximamos do sul da Europa, mais diminui a freqüência dessa mutação (Estivill et al., 1989a; Gasparini et al., 1990) OUTRAS MUTAÇÕES DESCRITAS Atualmente já foram descritas 1006 mutações pelos membros do Comitê Internacional de Análise Genética da Fibrose Cística ( cujas informações são mantidas em um banco de dados criado em Esse banco de dados é atualizado periodicamente pelos integrantes do laboratório do Dr. Lap-Chee Tsui (Canadá). Na grande maioria, as mutações descritas são consideradas patológicas, sendo que apenas um pequeno número delas determinam um comportamento clínico evidentemente grave e predominam em certos grupos populacionais (Estivill et al., 1989; Bowling et al., 1990), enquanto que em torno de 10 a 20% das mutações do gene da FC são provavelmente variações seqüenciais benignas (Welsh et al, 1995). A prevalência e a distribuição das mutações freqüentes na proteína podem ser observadas na tabela 1.1.

26 Tabela 1.1: Localização das mutações mais freqüentes no gene CFTR ( Domínios do Exon Mutação População com maior prevalência CFTR 3 394delTT Nórdicos, Irlandeses G85E 621+1G T 4 R117H Y122X Franceses, Reunion Island MSD1 I148T Franco-canadenses R347P 1078delT 7 R334W Q359K T360K A455E 9 G458V F508 Judeus Judeus 10 I507 G551D Ingleses G542X Espanhóis, Italianos NBD1 R553X Alemães 11 S549I S549N S549R (A C) S549R (T G) R560T 2183A G Italianos RD delA MSD2 17b M1101K Hutterite R1162X Italianos delC NBD2 W1282X Judeus insT Suíços, Amish, Acadian N1303K 21 W1316X Italianos

27 As mutações no gene da FC não são aleatórias, estando mais comumente localizadas na primeira metade da proteína CFTR, sobretudo no NBD1 (primeiro domínio de ligação de nucleotídeo), particularmente nos exons 10 e 11. A região MSD1 (primeiro domínio de expansão de membrana) revela um aglomerado de mutações nos exons 4 e 7. Poucas e raras mutações são encontradas no domínio R (região regulatória) e na região MSD2 (segundo domínio de expansão de membrana). A região NBD2 (segundo domínio de ligação de nucleotídeo), assim como o primeiro, é sítio de diversas mutações, principalmente nos exons 19 e 20. Cerca de 44% das mutações alteram o sentido de transcrição, devido à substituição de aminoácidos (missense), 22% são do tipo que desvia ou altera o quadro de leitura (frameshift), 14% das mutações determinam a terminação da cadeia (nonsense), 16% impedem o processamento correto do RNA mensageiro (splicing), 4% são deleções (Welsh et al, 2001). Extensas análises haplotípicas, utilizando marcadores extra e intragênicos, demonstram que a maioria das mutações estão associadas com haplótipos únicos, indicando que essas mutações são, possivelmente, derivadas de um único evento mutacional (Morral et al., 1993; Morral et al., 1996) AS MUTAÇÕES E A HETEROGENEIDADE POPULACIONAL Em nível molecular, o defeito em FC é causado por mutações que afetam a função da CFTR através de diferentes mecanismos, como a síntese desta proteína e o processamento intracelular incompleto e a maturação da mesma, além do defeito na regulação e transporte iônico. Algumas mutações são encontradas com muita freqüência em populações específicas, ao passo que, em outras populações, estas mutações são raramente encontradas; isto é, sua distribuição na população dependente da origem étnica e da localização geográfica (Patrizio e Zielenski, 1996) (Tabela 1.2). Estas considerações apresentam suma importância quando estratégias de triagem para FC são delineadas para diferentes grupos étnicos. A população de judeus Ashkenazi apresenta uma baixa freqüência da mutação F508 quando comparada com outras populações, entretanto apresenta uma freqüência elevada das mutações G542X e W1282X.

28 Tabela 1.2: Freqüência relativa de mutações no gene CFTR em diferentes populações. Mutação População Freqüência Referência Relativa Dinamarqueses 88% Welsh et al., 1995 Franco-canadenses 71% Rozen et al., 1990 F508 Judeus-Ashkenazi 30% Welsh et al., 1995 Turcos 26% Welsh et al., 1995 Mundial 66% Espanhóis G542X Belgas 7,3% Cuppens et al., 1990 Judeus-Ashkenazi 13% Lerer et al., 1992 Mundial 2,4% Ingleses G551D Celtas 3,1% Hamosh et al., 1992 Mundial 1,6% Italianos N1303K Europeus 1,5% Osborne et al., 1992 Mundial 1,3% W1282X Judeus-Ashkenazi 50% Hamosh et al., 1991 Mundial 1,2% R553X Alemães Mundial 0,7% G T Franco-canadenses Mundial 0,7% G A Franco-canadenses Mundial 0,6% R117H Mundial 0,3% R1162X Italianos Mundial 0,3% R347P Mundial 0,2% kb C T Espanhóis 2% Dreyfus et al., 1996 Mundial 0,2% I507 Mundial 0,2% G A Espanhóis G T Franco-canadenses A G Italianos G T Chineses G A Afro-americanos I148T Franco-canadenses * Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium, Pela triagem dessas três mutações pode-se determinar em torno de 90% das mutações associadas à FC nesse grupo.

29 GENÉTICA DE POPULAÇÕES DA FC A FC tem uma freqüência gênica excepcionalmente alta para uma anomalia que, até alguns anos atrás, era letal, ou seja, os indivíduos afetados não atingiam a idade reprodutiva. A FC, por ser uma doença genética transmitida de modo autossômico recessivo, apresenta igual proporção de indivíduos afetados e portadores de ambos os sexos. Além disso, não existe evidência de segregação distorcida para os alelos da FC (Kitzis et al., 1995). Baseando-se na incidência de 1 caso para cada 2500 nascimentos vivos, a freqüência total dos alelos mutados seria igual à 0,02236, segundo o teorema de Hardy-Weinberg, o que é excepcionalmente alto para uma anomalia letal. Os potencias transmissores do gene mutado são os heterozigotos, portadores assintomáticos (Raskin e Faucs, 2001). Diversas são as hipóteses a propósito da elevada freqüência das mutações FC na população caucasóide: a) heterogeneidade genética; b) taxa de mutação elevada; c) deriva ou fluxo gênico; d) vantagem seletiva para os heterozigotos. Dentre essas, a mais aceita é a possibilidade de uma vantagem para os portadores, em razão de certos fatores favoráveis, tanto na reprodução quanto na sobrevivência contra os mecanismos seletivos, atuais ou passados (Pier et al., 1998; Guggino, 1999). Todavia, alguns pesquisadores acreditam que não há necessidade de postular seleção para heterozigotos para explicar as altas freqüências gênicas, dada a recente expansão de tantas populações humanas (Thompson e Neel, 1997). Com base nas análises haplotípicas, fatores extragenéticos têm sido também propostos como explicação da vantagem seletiva (Cuppens et al., 1993). 1.4-MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS O defeito básico de FC está diretamente relacionado com uma regulação anormal da permeabilidade dos íons cloreto nas células epiteliais de vários órgãos, incluindo o pulmão, o pâncreas, o fígado, as glândulas sudoríparas e o intestino, com uma variedade muito grande dos níveis de comprometimento nos diferentes pacientes (Chou et al., 1991). As manifestações clínicas

30 freqüentes incluem cirrose do fígado, diabete mellitus e infertilidade (especialmente em homens) (Welsh et al., 2001). A manifestação multissistêmica do defeito básico confere à enfermidade extensa variabilidade clínica de acordo com os órgãos ou tecidos glandulares exócrinos envolvidos. No entanto, é possível distinguir as áreas mais intensamente comprometidas e vulneráveis aos sintomas da doença: a área respiratória: o envolvimento pulmonar é o fator de maior morbidade e mortalidade (Kerem et al., 1990a; Kerem et al., 1990b). É difícil a comprovação de uma relação direta entre a gravidade do quadro pulmonar e o genótipo, provavelmente pelo fato do pulmão sofrer mais a influência do meio ambiente, do que do componente genético variabilidade. Isto ocorre devido ao extenso contato que este órgão possui com o meio ambiente ao qual está exposto constantemente. Recentemente, foi identificado um outro locus no cromossomo 19q13 com o potencial de modulação da gravidade dos sintomas da FC (Zielenski et al., 1999). Estudos mais aprofundados podem ser de grande valor para estabelecer uma correlação genótipo/fenótipo pulmonar mais precisa. a área digestiva: se caracteriza pelo envolvimento pancreático exócrino, pela má absorção pré-entérica, pela esteatorréia e pela creatorréia, além do indicador clínico precoce, o íleo meconial (Campos, 1993a). Quanto ao quadro pancreático podemos destacar duas formas clínicas: a insuficiência pancreática (IP) e a suficiência pancreática (SP). A IP acomete cerca de 85% dos pacientes e a SP, que está presente em 15% dos pacientes, não requer a reposição de enzimas junto com os alimentos. Embora o nível de atividade pancreática residual varie segundo os pacientes, a grande maioria dos pacientes homozigotos para a mutação F508 evoluem para IP, enquanto os pacientes com SP são heterozigotos compostos desta mutação associada a outra mutação (não- F508) no outro cromossomo ou apresentam duas mutações diferentes da F508 (Kerem et al., 1989b; Gasparini et al., 1990). Portanto, a mutação F508 seria uma mutação grave com efeito parcialmente compensado quando acompanhada de uma mutação mais leve, evoluindo,

31 neste caso, dentro do grupo de pacientes com SP (Kerem et al., 1990a). Todas as mutações que alteram o código de terminação, o processamento do mrna, que desviam ou alteram o quadro de leitura e as deleções seriam do tipo grave. As mutações que causam a substituição de aminoácidos, poderiam ser graves ou leves dependendo da importância funcional do sítio da mutação. Além da F508 pelo menos mais 10 mutações estão associadas com a forma IP (mutações G542X, 390insT, 621+1G T, I507, A559T, N1303K, G551D, G1244E, S1255P, G1349D) e pelo menos 5 com a forma SP (mutações R117H, R334W, R347P, A455E e P574H) (Kristidis et al., 1992). As mutações que não acarretam IP teriam um papel dominante sobre as que causam essa insuficiência (Kerem et al., 1989b). Mesmo sabendo que a FC é uma doença autossômica recessiva, verifica-se que quando o indivíduo possui um alelo para IP e outro para SP, o fenótipo é compatível com SP. Dessa forma, uma mutação dominante estaria conferindo a atividade parcial do canal de cloro, permitindo um fenótipo mais benigno (Welsh e Smith, 1993). O comprometimento da função pancreática é freqüentemente encontrado em pacientes com idade mais avançada, sendo difícil dizer que um paciente com SP assim permaneça para o resto da vida. a área nutricional: sofre a sobrecarga de um gasto calórico hipercatabólico; a secreção anormal de eletrólitos no suor: característica marcante da doença, sendo responsável pela depleção eletrolítica, pela desidratação aguda pelo calor, etc; manifestações gênito-urinárias: variam conforme o sexo do paciente. Índices elevados de esterilidade podem ser encontrados em pacientes do sexo masculino podendo atingir 95 a 97% dos casos. As transformações mais importantes ocorrem no sistema dos ductos de Wolff, em particular no epidídimo, nos canais deferentes e nas vesículas seminais. O volume de sêmen ejaculado é reduzido. Após a puberdade, os testículos podem se apresentar de tamanho normal ou reduzidos em seu volume. Várias anormalidades descritas

32 podem ser detectadas logo após o nascimento. Apesar da esterilidade e azospermia, a função hormonal testicular e a atividade sexual masculina não são necessariamente comprometidas. Já a infertilidade feminina é discutível e quase sempre atribuída ao muco cervical espesso, que pode impedir a ascensão dos espermatozóides para a fecundação. Uma manifestação clínica leve e atípica da FC foi verificada em homens com agenesia congênita de vasos deferentes (ACVD). Estes indivíduos normalmente não apresentam comprometimento pulmonar ou pancreático, sendo a principal manifestação da doença a esterilidade. Em um estudo realizado com homens clinicamente normais para FC, portadores de ACVD e com níveis elevados ou limítrofes de cloro no suor, foi verificado que aproximadamente 40% eram heterozigotos para a mutação F508. Sendo assim, nesse grupo a freqüência desta mutação é cerca de 10 vezes maior que a freqüência de portadores de FC na população caucasóide (1:25) (Dumur et al., 1990). Sabe-se ainda que esses indivíduos são portadores de outra mutação no outro alelo desse gene. A mutação R117H apresenta alta freqüência entre os homens com ACVD, atingindo cerca de 22% desses pacientes. Dos heterozigostos para R117H, 75% possuíam a mutação F508 no outro alelo (Gervais et al., 1993). Entretanto, em estudo prévio, o primeiro paciente com ACVD homozigoto para R117H apresentava teste de suor normal (Bienvenu et al., 1993). Diversos estudos mostraram que um polimorfismo de um dinucleotídeo localizado no final do intron 8 pode interferir na manifestação clínica de esterilidade em FC, quando associado à mutação no outro alelo (Dumur et al., 1996). Aparentemente, é a primeira vez que se demonstra a ocorrência de um polimorfismo afetando a remoção de um exon em indivíduos normais, e esse exon, por sua vez, está interferindo na manifestação clínica de uma mutação deletéria (Raskin e Faucs, 2001). alterações microbiológicas e imunológicas: os pacientes com FC não apresentam deficiência imune e, exceto para o trato respiratório, não são mais suscetíveis a infecções que indivíduos normais; a septicemia é raramente relatada. O mecanismo patogênico propiciando as infecções recorrentes e crônicas relacionam-se mais às alterações das secreções, formando muco viscoso e espesso que propicia o crescimento da flora patogênica. Infecções

33 respiratórias por vírus influenza A e B, adenovírus e especialmente vírus sincicial respiratório são responsáveis por algumas exacerbações agudas da doença pulmonar dos pacientes com FC (Hoiby, 1995). A função pulmonar pode cair em cerca de 30% nestes episódios. Os pacientes tornam-se suscetíveis à colonização secundária e à infecção bacteriana principalmente por Pseudomonas aeruginosa. Quanto às infecções respiratórias bacterianas, os patógenos encontrados nos pacientes são: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Burkolderia cepacea. O S. aureus é um importante patógeno e é o mais freqüentemente isolado em crianças, porém não mais representa um grande problema pelo uso de antibióticos. S. aureus pode contribuir para o dano precoce das vias aéreas inferiores e predispor à infecção por P. aeruginosa, podendo em alguns pacientes, evoluir à infecção crônica. A P. aeruginosa é o patógeno prevalente, tornando-se endêmico em pacientes com FC em todos os países. Além de colonizar os pulmões, esta bactéria também coloniza os seios da face. Pacientes infectados por P. aeruginosa não disseminam a bactéria para outros membros da família não afetados, mas irmãos com FC freqüentemente carregam a mesma cepa, indicando contaminação da mesma fonte ambiental ou infecção cruzada, a qual parece ser a responsável pela prevalência variável desta espécie em diferentes centros. Infelizmente, o grande número de pacientes já está colonizado cronicamente na ocasião do diagnóstico. P. aeruginosa produz vários fatores de virulência e toxinas com efeito deletério para os pulmões de pacientes com FC. Já a B. cepacea é mais resistente a antibióticos e desenvolve-se mais rapidamente que a P. aeruginosa. Todas estas infecções, independentemente do patógeno responsável, quando recorrentes e persistentes, causam bronquites e insuficiência respiratória, podendo levar a morte CORRELAÇÃO ENTRE GENÓTIPO E FENÓTIPO A apresentação clínica, a gravidade da doença e a velocidade de progressão da FC variam consideravelmente e algumas variações podem ser devido à presença de diferentes combinações no locus da FC. Além do meio,

34 fatores epigenéticos ou genéticos podem contribuir para um quadro clínico de manifestação da doença (Porteous e Dorin, 1990). As tentativas de correlação entre o genótipo e o fenótipo em FC são alvo de inúmeras investigações. Contudo, tem sido difícil estabelecer esta correlação por vários motivos: a) grande número de mutações raras que podem causar a doença; b) diferença do quadro clínico observado entre irmãos afetados; c) número pequeno de pacientes homozigotos para uma mutação (Raskin e Faucs, 2001). De uma forma geral, pacientes homozigotos para mutações de terminação no quadro de leitura apresentam alterações pancreáticas graves, mas alterações pulmonares leves. As deleções de aminoácidos, como no caso da F508 e I507, são consideradas mutações precursoras de manifestações clínicas graves. Já as mutações de substituição de aminoácido podem estar associadas a um quadro clínico grave ou leve em pacientes portadores de FC (Kristidis et al., 1992). Mais de 1006 mutações foram descritas até o momento ( No entanto, a mais comum é a F508. Pacientes homozigotos para esta mutação apresentam, em geral, um quadro clínico grave, com manifestação precoce dos primeiros sintomas. A insuficiência pancreática está presente em 99% desses casos e o íleo meconial atinge, em média, 33% (Kerem et al., 1990a; Ferri et al., 1995). Os casos descritos demonstram a grande dificuldade em estabelecer um relação exata entre genótipo e fenótipo, pois muitas variáveis devem ser consideradas para esta análise. Além disso, até mesmo entre irmãos afetados por uma mesma mutação, muitas vezes não se observa uma evolução clínica semelhante da doença (Reiss et al., 1993). Uma outra tentativa de correlacionar a mutação com o fenótipo é através da análise do efeito de uma mutação em seu polipeptídeo, ou seja, verificar qual o tipo de mutação e/ou em que domínio do gene essa mutação ocorreu. E então, predizer se a mesma está alterando a função, a síntese, a estrutura secundária ou terciária da proteína. Nesse sentido, foram propostos 4 mecanismos gerais (correspondente a 4 classes de mutações) que podem levar a uma disruptura da função da CFTR (Welsh, 1994).

35 As mutações da classe I levam a uma terminação prematura na tradução do gene. Essa terminação prematura da proteína pode ser causado por: mutações em sítios de terminação ou que causem mudança no quadro de leitura, ou ainda, mutações sem sentido (Tsui, 1992). Mutações da classe II causam um defeito no processamento da proteína, onde a glicosilação é apenas parcial, provocando a degradação precoce. Nessa classe encontramos a grande maioria das mutações da FC, incluindo a mais comum, a deleção F508 (Welsh e Smith, 1993). As mutações da classe III não provocam problemas no processamento da proteína, porém há um defeito na regulação do canal de cloro. Essas alterações ocorrem nos NBDs, causando uma diminuição na freqüência de abertura do canal ou uma resposta anormal ao ATP (Anderson e Welsh, 1992). Finalmente, na classe IV, verificamos um defeito na condução de íons, onde um número de mutações nos MSDs produzem canais localizados corretamente e com regulação normal, porém, devido à formação anormal do poro do canal, a quantidade de cloro que atravessa a membrana está diminuída, geralmente em 1/3 da capacidade normal (Welsh e Smith, 1993) (figura 1.3). Apesar das inúmeras dificuldades para se estabelecer uma correlação genótipo/fenótipo, espera-se que os indivíduos da classe I e II tenham um quadro clínico grave, visto que há uma perda na localização celular correta da proteína. Assim sendo, mutações dessas classes são associadas com o fenótipo da IP grave, como, por exemplo, a F508 e a G542X (Welsh e Smith, 1993). Por outro lado, os das classes III e IV têm a proteína corretamente localizada, resultando em uma função residual ou anormal dessa proteína. Os indivíduos pertencentes à classe IV apresentam uma atividade residual do canal de cloro capaz de conferir-lhes um fenótipo de SP. Nessa classe, alguns indivíduos (R117H) assumem manifestações atípicas da FC, como apenas ACVD (Anguiano et al., 1992). Na classe III encontramos indivíduos com SP (G551S) e IP (G551D), sugerindo a existência de um grau de regulação anormal dependendo da alteração molecular (Cutting et al., 1990b; Strong et al., 1991). A gravidade desta doença genética pode ser determinada por outros loci modificadores que atuem diretamente sobre o fenótipo de FC, como os genes codificadores de muco. Um fator agravante do quadro clínico dos pacientes com