NOVAS TECNOLOGIAS NA REDUÇÃO DE PERDAS E AUMENTO DA EFICIÊNCIA DE SÊMEN SEXADO

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1 NOVAS TECNOLOGIAS NA REDUÇÃO DE PERDAS E AUMENTO DA EFICIÊNCIA DE SÊMEN SEXADO Rubens Paes de Arruda 1* ; Henrique Fulaneti Carvalho¹; Daniela Franco da Silva 1 ; Kleber Menegon Lemes 1 ; Maria Augusta Alonso 1 ; Fernanda Jordão Affonso 1 1 Centro de Biotecnologia em Reprodução Animal, Laboratório de Biotecnologia do Sêmen e Andrologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São de Paulo - USP , Pirassununga-SP, Brasil. *arrudarp@usp.br Desde antigüidade a determinação do sexo tem sido de interesse do homem. Por exemplo, na antiga Grécia o sexo masculino era o mais desejado por sua importância social e cultural, criando assim diferentes teorias empíricas. A primeira tentativa do controle do sexo foi descrito pelo filosofo Democritus de Abadera ( AC) quem acreditava que os machos originavam-se no testículo direito e as fêmeas no testículo esquerdo. Posteriormente, Aristoteles propôs que o sexo era determinado pelo calor do individuo masculino e que as fêmeas seriam machos cujo desenvolvimento foi interrompido precocemente quando o frio do útero superava o calor do sêmen paterno. No ano 1677 Anton van Leeuwehoek descreveu os espermatozóides pela primeira vez usando um microscópio melhorado. Já no final do século XIX a determinação do sexo era atribuída apenas ao cromossomo X, sendo o macho X0 e a fêmea XX. Foi somente no início do século XX que Bridges em 1914 descobriu que o sexo masculino era determinado pela associação de um cromossomo X com outro morfologicamente distinto, denominando Y (PERGORATO & HOSSEPIAN DE LIMA, 2001). Diferentes rotas tecnológicas são percorridas na tentativa de selecionar o sexo em mamíferos, tanto nas espécies de interesse zootécnico quanto em espécies ameaçadas de extinção, animais de companhia e na reprodução humana assistida. Neste sentido, existem duas alternativas: a separação de espermatozóides portadores do cromossomo X, daqueles portadores do cromossomo Y; ou a sexagem de embriões pré-implantados (HOSSEPIAN DE LIMA, 2007). Na separação espermática existem reportadas varias técnicas experimentais como: diferenças de densidade (ERICSSON et al., 1973), peso, diferenças em carga elétrica (KANEKO et al., 1984; ENGELMANN et al., 1988), conteúdo protéico (BLECHER et al., 1999, HENDRIKSEN et al., 1999), propriedades imunológicas (WELCH et al., 1995) ou

2 428-1 st International Symposium of Dairy Cattle volume cromossômico (VAN MUNSTER et al., 1999). Para a identificação do sexo dos embriões, algumas técnicas têm sido descritas, sendo as invasivas que incluem o método de reação em cadeia da polimerase (PCR) ou análise citogenética ou as não invasivas, como a quantificação de enzimas ligadas ao cromossomo X ou testes imunológicos (GARDON et al., 2004). O desenvolvimento da sexagem de sêmen, separando-se o espermatozóide contendo o cromossomo X do Y baseado na diferença de DNA empregando-se a citometria de fluxo, foi largamente aceito como o principal avanço na tecnologia da reprodução (BLONDIN et al., 2009). A pré-seleção do sexo pode acelerar o progresso genético como também, beneficiar o manejo e a eficiência produtiva (MAXWELL et al., 2004; PARRILLA et al., 2005). Esta técnica foi desenvolvida por Larry A. Johnson em 1989, no USDA Beltsville Agricultural Research Center (SEIDEL JR. et al., 1999; JOHNSON, 2000; GARNER & SEIDEL JR., 2003; WEIGEL, 2004; GARNER, 2006) e é o único método validado até o momento para a pré-seleção do sexo antes do nascimento (GRAAF et al., 2009). Todavia, somente nos bovinos, a tecnologia atingiu um nível de desenvolvimento que permitiu a sua aplicação comercial (RATH & JOHNSON, 2008). Na pecuária de leite a qual têm como característica ter raças especializadas, a manutenção de gestações e o nascimento de animais do sexo masculino são um dos fatores de diminuição da produtividade e aumento dos custos de produção (HOSSEPIAN DE LIMA, 2007). O objetivo do produtor de leite para acasalar uma vaca é obter uma lactação (conseqüência de uma gestação) e a produção de uma matriz seja como reposição, para aumentar o tamanho da produção ou para venda (HOHENBOKEN, 1999). Nesta ordem de ideias o nascimento de machos não é interessante em nenhum ponto de vista. Na produção de animais reprodutores, a pré-seleção do sexo permite aumentar o ganho genético mediante aumento da pressão de seleção e diminuição dos intervalos de gerações nos testes de progênie (NICHOLAS & SMITH 1983). O progresso genético será maximizado em programas de criação para a produção de leite em que a proporção sexual é controlada por ocasião da inseminação artificial, obtendo-se machos ou fêmeas, quando desejado (VAN VLECK et al., 1976). O emprego do sêmen sexado permite aumentar o impacto na eficiência produtiva de carne e leite, produzindo uma proporção ideal de machos e fêmeas, adquirindo vantagens de características limitadas e

3 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite influenciadas pelo sexo, e ainda, obter manejos práticos e flexíveis economicamente (RATH & JOHNSON, 2008). Adicionalmente permite selecionar entre seus rebanhos, as matrizes potenciais, produzindo novilhas de reposição apenas de animais geneticamente superiores (HOHENBOKEN, 1999; WEIGEL, 2004; MOCÉ et al., 2006). É esperada a elevação do ganho genético de até 15% comparado ao sêmen convencional, além da reduçãodo custo de programas de teste de progênie e transferência de embrião e, aumentodo valor de marcadores genéticos (HOHENBOKEN, 1999; JOHNSON, 2000; WEIGEL, 2004; DE VRIES et al., 2008). Já na produção in vitro (PIV) de embriões, sabe-se que a proporção de produção de embriões machos é maior do que de fêmeas e com o uso do sêmen sexado para fêmea, inverteria esta proporção, já que as fêmeas têm um valor de mercado maior do que de machos (WHEELER et al., 2006; RATH & JOHNSON, 2008; RATH et al., 2009). No âmbito da saúde humana, uma das aplicações de destaque é na prevenção de doenças genéticas ligadas ao sexo (SEIDEL JR., 2003; MAXWELL et al., 2004; MOCÉ et al., 2006). É importante ressaltar que as populações de bezerros resultantes do sêmen sexado não diferem da população de animais oriundos do sêmen convencional, incluindo o tempo de gestação, peso ao nascer, taxa de mortalidade e ganho de peso (SEIDEL JR., 2003). Não foram encontrados até o momento efeitos genotóxicos no sêmen sexado com o uso do Hoechst (PARRILLA et al., 2004; GARNER, 2006). Entretanto, o espermatozóide é sensível a diferentes etapas, incluindo o processo através do citômetro de fluxo, como a ligação ao corante nuclear Hoechst, a alta diluição, mudanças na composição dos diluidores, a alta pressão, as forças mecânicas associadas com a passagem através da máquina, a exposição ao laser UV, a descarga elétrica e a projeção no tubo coletor em alta velocidade e a centrifugação (MAXWELL & JOHNSON, 1999; JOHNSON, 2000; GARCIA et al., 2007). Baseando-se na literatura, o sêmen sexado apresenta algumas desvantagens que estão relacionadas à sua fertilidade, avaliada através da taxa de prenhez que variou de 70 a 80% em relação ao sêmen convencional (SEIDEL JR. et al., 1999; GARNER, 2006; MOCÉ et al., 2006; WHEELER et al., 2006; SEIDEL JR., 2009) em bovinos (SEIDEL et al., 1999), eqüinos (LINDSEY et al., 2002), ovinos (HOLLINSHEAD et

4 430-1 st International Symposium of Dairy Cattle al., 2002) e suínos (PARRILLA et al., 2004). Dentre eles estão: a baixa concentração (2,1 x 10 6 espermatozóides) por dose (ANDERSSON et al., 2004; PARRILLA et al., 2004), embora tenha sido reportado que doses similares tanto do sexado quanto do controle inseminadas resultaram em taxas de prenhez similares (BODMER et al., 2005); o tempo de sobrevida menor após a criopreservação (SHENK et al., 1999; SEIDEL JR & GARNER, 2002; WHEELER et al., 2006; CERCHIARO et al., 2007; GARCIA et al., 2007; RATH & JOHNSON, 2008; DE VRIES et al., 2008; SEIDEL, 2009) e aumento de danos nas membranas (PARRILLA et al., 2005). Vários estudos têm demonstrado que o processo de sexagem de sêmen pela técnica de citometria de fluxo envolve várias etapas que podem promover alterações na funcionalidade da membrana, nas características da motilidade e na morfologia espermática dos espermatozóides. Estas etapas são: o uso do corante de DNA (Hoechst 33342), reaquecimento e incubação, forças mecânicas de vibração para a formação da gota durante a passagem da célula espermática pelo nozzle-tip, a exposição ao laser UV, a carga elétrica, a alta gravidade durante a desaceleração do espermatozóide dentro do tubo coletor, a alta diluição, pressão elevada (40 psi) e resistência a mudanças na composição dos meios diluidores, a centrifução, a refrigeração e o processo de criopreservação (GARNER & SEIDEL JR., 2003; GARNER, 2006; MOCÉ et al., 2006; GRAAF et al., 2007; GARCIA et al., 2007). Desta forma muitos estudos relatam uma menor fertilidade do sêmen sexado em relação ao sêmen congelado convencional (SEIDEL et al., 1999, LU et al., 1999, SARTORI 2004, SEIDEL & SCHENK 2008). No entanto, existe a necessidade de mais estudos em relação ao assunto. Neste sentido, trabalhos desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa (TANNO, 2009; MEJIA-GALLEGO, 2010), no Laboratório de Biotecnologia do Sêmen e Andrologia do Centro de Biotecnologia em Reprodução Animal do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, localizado no Campus de Pirassununga, SP., teve como objetivo avaliar as alterações morfo-funcionais do sêmen bovino submetido à sexagem por meio da técnica de citometria de fluxo e comparar com o sêmen convencional e a diferença entre as subespécies (TANNO, 2009). O sêmen foi obtido de seis touros, sendo três taurinos (Holandês preto e branco) e três zebuínos (Gir leiteiro), com quatro ejaculados de cada animal (n = 24). Cinco tratamentos foram realizados: sêmen

5 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite convencional com diluidor L (Lagoa); sêmen convencional com diluidor S (Sexing) e sêmen sexado (nos tempos de zero, três e seis horas após a ejaculação para avaliar se existem alterações de membranas ao longo do tempo). Foram avaliados pela citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e reação acrossomal; peroxidação lipídica e capacitação espermática através de análises da fosforilação da tirosina e aumento da fluidez e desorganização da membrana plasmática. O sêmen proveniente da subespécie taurina teve um efeito negativo mais significante do que a zebuína na qualidade do sêmen. O sêmen sexado apresentou maior peroxidação lipídica nos espermatozóides com membrana íntegra e a presença de proteínas fosforiladas na superfície da membrana plasmática, fatores que são indicativos de capacitação espermática. Não houve piora na qualidade do sêmen sexado devido ao tempo de espera do ejaculado por até seis horas. Já com o mesmo delineamento experimental, Mejia-Gallego (2010) estudou os parâmetros de motilidade pelo sistema computadorizado da motilidade espermática (CASA), funcionalidade da membrana plasmática pelo teste de resistência osmótica (HOST), morfologia dos espermatozóides pela técnica de contraste de interferência diferencial (DIC). Foram observados que espermatozóides sexados apresentaram a maioria dos parâmetros de motilidade superiores aos submetidos à técnica convencional, indicando que existe uma seleção por parte do citômetro de fluxo. O tempo em que o espermatozóide bovino espera (até seis horas, neste experimento), para ser submetido ao processo de sexagem pela técnica de citometria de fluxo, alterou a linearidade (LIN). A funcionalidade da membrana plasmática foi afetada quando o espermatozóide bovino passou pelo processo de sexagem. A sexagem induziu o aumento de defeitos menores, provavelmente por alterações da membrana plasmática da cauda dos espermatozóides. Os zebuínos são mais sensíveis às alterações da membrana plasmática da cauda em relação aos taurinos. Finalmente existem fortes indícios que espermatozóides bovinos que passam pela técnica de citometria de fluxo entrem em estado de hiperativação. Para Klinc et al. (2007a) os efeitos estressores impostos ao espermatozóide pelo procedimento da sexagem causa produção de espécies reativas de oxigênio, culminando em danos à membrana plasmática, como também observado por Tanno (2009). Sendo assim, os pesquisadores (KLINC et al., 2007a,) adicionaram antioxidantes ao

6 432-1 st International Symposium of Dairy Cattle diluidor tradicionalmente utilizado na técnica de sexagem para contrabalancear os efeitos negativos. Os benefícios da catalase e do piruvato de sódio, os antioxidantes utilizados, foram marcantes na proteção da morfologia do acrossoma e melhoram a longevidade da célula espermática. Desta maneira, além da adição de antioxidantes, procedimentos como manipulação correta do sêmen e uso de touros selecionados são benéficos para a melhora no resultado final do uso do sêmen sexado (KLINC et al., 2007b). Várias etapas ao longo do processo de sexagem afetam o rendimento e a eficiência da técnica. Por esta razão, desde sua implantação há 20 anos, pesquisas e melhorias nestes pontos críticos têm sido buscadas (SHARPE & EVANS, 2009). Alguns aspectos do citômetro de fluxo foram melhorados visando reduzir ruído e, portanto aumentar a resolução de medição de espermatozóides X e Y. Laser de íon a base de gás argônio foram substituídos por unidades de baixo ruído como Vanguard TM diodepumped solid state system (Newport Corporation, Irvine, CA, USA). Segundo Evans et al., 2008, esquemas de medidas e gating alternativos que combinam área e altura do pulso fotodetector têm sido implementadas visando distinguir mais claramente os espermatozóides X e Y. Aspectos de software e visualização como dados de zoom, controle e funções de rotação também tem sido utilizados (de forma análoga à compensação de fluorescência em multifluorophore immunology applications) com o objetivo de superar a defasagem na iluminação e detecção de orientação celular abaixo do ideal (EVANS & VAN MUNSTER; 2008). Evans et al., (2008), relatam que modificações foram feitas visando maximizar a coleta de fluorescência utilizando componentes de alta abertura numérica e filtros de alta transmissão óptica. Apesar de não recomendado pelo fabricante, melhorias na resolução também foram feitas através da operação de dispositivos de detecção fotomultiplicadores em uma faixa de baixa tensão (ou seja, menos que 300 V). Investigações recentes (SHARPE et al., 2008) sugerem que a eficiência da orientação pode ser aumentada através do emprego de dois fotodetectores adicionais posicionados a 45 e 135 graus em relação ao detector 0 grau. Esse arranjo semioctagonal permite que o espermatozóide orientado diagonalmente possa ser mensurado

7 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite precisamente uma vez que o espermatozóide que esta orientado para um detector de forma imprópria esteja adequado para a outro de forma ótima. Atualmente, com a otimização do bico utilizado leva a eficiência de orientação entre 60 a 80% dependendo do touro e da qualidade da amostra (SHARPE & EVANS, 2009). Sharpe et al., (2008), também vêm explorando o uso de um par de lasers/detectores adicionais (orientado a 90 graus em relação ao primeiro feixe de laser) visando detectar espermatozóides remanescentes, que, devido a sua orientação não são classificados. Um desenvolvimento importante e recente na tecnologia do citômetro de fluxo que afeta diretamente o rendimento da sexagem espermática é a introdução do uso de um circuito de processamento de pulso digital no lugar do sistema analógico de time-gated. A maior vantagem da tecnologia digital é que a mensuração dead time (inabilidade temporária de processar e resolver pulsos fotodetectores devido a espermatozóides pouco espaçados) e, portanto, eventos dificilmente coincidentes, são quase completamente eliminados. Isso porque sistemas digitais são capazes de amostrar continuamente em tempo quase real permitindo que múltiplos pulsos fotodetectores sejam precisamente discriminados e mensurados. Isso representa um aumento de 33% no rendimento e de 30 % na eficiência de classificação quando em comparação com o sistema analógico. Segundo Garner et al., (2008), ganho de eficiência operacional vem sendo obtido através da redução do instrumento footprint e por sharing lasers, pumps e até o trabalho em múltiplos instrumentos. A introdução de meios estéreis pré-embalados e remoção de filtros em linha tem também encurtado os ciclos de limpeza (de aproximadamente 40 para 10 min). A introdução de sorters de velocidade mais alta permitiu a fluidez e a capacidade de manipulação necessárias para aumentar o rendimento, e o desenvolvimento de técnicas de orientação aumentou significativamente as taxas de classificação chegando a aproximadamente 1700/s (Johnson et al.,1986). Uma série de aspectos, incluindo a precisão da agulha de injeção na amostra, manufatura do nozzle e visualização da informação vêm reduzindo a variação na mensuração, aumentando portanto a eficiência em 30% e o rendimento do sort para 6000 espermatozóides/segundo (EVANS et al., 2008).

8 434-1 st International Symposium of Dairy Cattle Mais recentemente, a disponibilidade de sorters com tecnologia digital, aumentou a eficiência com taxas atingindo 8000 espermatozóides/segundo. Além destas mudanças, outro protocolo cujos resultados se mostraram positivos vem sendo utilizado. O novo protocolo de sexagem de espermatozóides inclui várias modificações no protocolo de sexagem e tratamento, que são resumidos sob o novo procedimento chamado Sexcess. Além de outros componentes, inclui a inibição temporária de espermatozóides com fluoretos durante a classificação bem como a suplementação com diferentes antioxidantes, e um protocolo de adaptação de equilíbrio em três etapas a 4 o C. Dados de estudos a campo inicialmente indicaram que as taxas de parto são praticamente iguais entre IA em novilhas com sêmen sexado (73,6%) e sêmen nãosexado (76,7%), utilizando ejaculados fracionados (RATH et al., 2009). O principal efeito do procedimento Sexcess nos espermatozóides tratados é o aumento da viabilidade espermática após o descongelamento. Em um recente estudo, 18 amostras de sêmen sexado empregando Sexcess de 3 touros foram comparadas com os controles (sêmen não sexado) dos mesmos ejaculados. Os resultados revelaram que a qualidade do sêmen sexado de touros sob o protocolo Sexcess não foi diferente do grupo controle (RATH et al., 2009). Como indicado pelo teste de termotolerância, o protocolo Sexcess estende a vida útil em todos os parâmetros testados e melhora significativamente a chance de fertilização. Os benefícios do Sexcess, medido pela incubação por 6 h, demonstram a manutenção da motilidade, viabilidade e integridade acrossômica (RATH et al., 2009). Atualmente, a técnica atingiu um estágio de refinamento no qual os sistemas de sexagem podem ser utilizados pelo período de 24 horas com pouco intervalo de parada, tornando-a comercialmente viável. Um equipamento é capaz de produzir 300 palhetas por dia devido as melhorias na resolução de medidas, na orientação do espermatozóide, estatística e tempo. Apesar disso, ainda cerca de 50% dos espermatozóides acaba sendo descartado, mostrando ainda a necessidade de alterações no processo de sexagem para um melhor aproveitamento de amostras valiosas (SHARPE; EVANS, 2009). Uma série de experimentos utilizando o sêmen sexado em programas de sincronização e transferência de embriões vem sendo publicados pela equipe do professor Baruselli no Departamento de

9 III Simpósio Nacional de Bovinocultura de Leite Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP (Baruselli et al., 2007; Souza et al., 2008; Sá Filho et al., 2010a; Sales et al. 2010; Sales et al. 2011; Soares et al., 2011). Nestes trabalhos os dados apresentados demonstram que as taxas de concepção após detecção de cio em novilhas inseminadas com sêmen sexado são aceitáveis. Ainda, com a adequação do momento da inseminação em relação ao início do estro está melhorando a taxa de concepção. Melhores resultados são obtidos quando as inseminações são realizadas entre 16 a 24 horas após o início do estro (ou seja, 6 a 14 horas antes da ovulação). A taxa de concepção após o uso da sincronização da ovulação para IATF com sêmen sexado foi satisfatória, desde que o momento da IATF seja ajustado para 60 horas após a retirada do implante (10 horas antes da ovulação). O uso do sêmen sexado em programas de superovulação está diminuindo a produção de embriões viáveis. No entanto, o atraso de 6 horas nas inseminações (IATF 18 e 30 horas após o indutor de ovulações), é uma alternativa para aumentar o número e embriões viáveis do sexo desejado. É importante salientar que existe grande variação individual na fertilidade de touros submetidos ao processo de sexagem. Essas diferenças devem ser levadas em consideração no momento da escolha do reprodutor para programas de inseminação artificial e de transferência de embriões. Mais experimentos são necessários para melhor compreender os fatores que afetam a fertilidade do sêmen sexado em fêmeas bovinas. Neste sentido, a literatura mostrava que a fertilidade do sêmen bovino sexado era em torno de 50 a 80% em relação ao não sexado. Ainda, vários relatos de que o sêmen sexado apresenta menor qualidade que o sêmen não sexado, entretanto em menor extensão que nos anos passados. Os dados mais recentes encontraram 60-90% de fertilidade comparando ao sêmen não sexado (SCHENK et al., 2009). Apesar disso muitos relatos indicam que um touro de boa qualidade espermática e manejado corretamente, apresenta doses de sêmen sexado com fertilidade comparada com o sêmen convencional. Essa discrepancia pode ser verdadeira ou pode ocorrer falhas nos laboratorios de congelação em dispor de condições biológicas necessárias aos espermatozóides, devido à grande produção em escala. Em qualquer caso, é irrealista, para o momento, pensar que o sêmen sexado apresenta qualidade comparável ao sêmen convencional (SEIDEL e SCHENK, 2008).

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