AVALIAÇÃO DE ALIMENTOS MINIMAMENTE PROCESSADOS, ATRAVÉS DE MARCADORES MOLECULARES ESPÉCIE ESPECÍFICOS PARA BACTÉRIAS, CUIABÁ, MATO GROSSO, BRASIL.

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1 AVALIAÇÃO DE ALIMENTOS MINIMAMENTE PROCESSADOS, ATRAVÉS DE MARCADORES MOLECULARES ESPÉCIE ESPECÍFICOS PARA BACTÉRIAS, CUIABÁ, MATO GROSSO, BRASIL. H.G.G. Reis 1, D.C. Pastro 2, E. C. Santos 3, S. Mariotto 4 1- Graduanda em Engenharia de Alimentos Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso, Campus Cuiabá Bela Vista CEP: Cuiabá MT Brasil, Telefone: 00 (65) (helengabrielareis@gmail.com) 2- Mestra em Ciência e Tecnologia de Alimentos Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso, Campus Cuiabá Bela Vista CEP: Cuiabá MT Brasil, Telefone: 00 (65) (debora_pastro@hotmail.com) 3- Engenharia de Alimentos Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso, Campus Cuiabá Bela Vista CEP: Cuiabá MT Brasil, Telefone: (65) (erika.ecs809@gmail.com) 4- Doutora em Genética e Evolução Instituto Federal de Mato Grosso, Campus Cuiabá Bela Vista CEP: Porto Alegre RS Brasil, Telefone: (65) (sandra.mariotto@blv.ifmt.edu.br) RESUMO - Os alimentos minimamente processados têm ganhado espaço na alimentação humana. São altamente perecíveis devido ao teor de umidade, favorecendo o desenvolvimento microbiano. Objetivou-se, avaliar a qualidade microbiológica de alimentos minimamente processados comercializados em supermercados de Cuiabá, Mato Grosso, Brasil, via técnica de Reação em cadeia pela polimerase, para verificar a existência de patógenos. A pesquisa foi realizada no Instituto Federal de Mato Grosso - campus Cuiabá-Bela Vista. O DNA bacteriano foi amplificado através da PCR, utilizando primers para Salmonella spp, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Os resultados demonstraram presença de E. coli e Salmonella spp e ausência de S. aureus e Shigella flexneri. A contaminação pode ter ocorrido em alguma das etapas da produção. O uso de técnicas rápidas para detecção de patógenos em alimentos favorece o controle da qualidade do produto final e pode ser usada como ferramenta de ação rápida e efetiva para evitar perdas. PALAVRAS-CHAVE: vegetais, DNA, patógenos; primers. ABSTRACT The minimally processed foods have gained ground in food. They are highly perishable due to moisture content, favoring microbial growth. The objective was to evaluate the microbiological quality of processed foods minimally commercialized in Cuiaba, Mato Grosso, Brazil, via reaction technique polymerase chain to check for pathogens. The research was conducted at the Federal Institute of Mato Grosso - Cuiabá campus-bela Vista. The bacterial DNA was amplified by PCR using primers for Salmonella spp, Shigella flexneri, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. The results demonstrated the presence of E. coli and Salmonella, and absence of S. aureus and Shigella flexneri. The contamination may have occurred in any of the stages of production. The use of rapid techniques to detect pathogens in food favors control the quality of the final product and can be used as a quick and effective action tool to avoid losses. KEYWORDS: vegetable; DNA; pathogens; primers.

2 1 INTRODUÇÃO Alimentos minimamente processados (AMP) são frutas ou hortaliças que foram alterados fisicamente, porém mantendo o seu estado fresco, eles são selecionados, sanificados, descascados, cortados e posteriormente embalados ou pré embalados, com a finalidade de oferecer aos consumidores frescor, conveniência e qualidade nutricional (IFPA, 2007). A qualidade destes alimentos está ligada diretamente a manutenção de suas características sensoriais (Santos, 2005). A contaminação de frutas e ou hortaliças por patógenos podem acontecer em uma ou várias de suas etapas de processo, como a contaminação por meio de águas contaminadas durante a irrigação, inserção de resíduos orgânicos como fertilizantes, exposição á insetos e uso de esterco animal que não sofreu compostagem (Pacheco, 2002). Os riscos podem ocorrer também durante o transporte, comercialização e durante seu preparo pelo consumidor. Tais alimentos contaminados podem veicular patógenos de importância para a saúde pública, contribuindo para ocorrência de surtos (Bean et. al., 1997; Vanetti, 2002; Coelho, 2006). Segundo Silva Jr. (2010), patógenos são microrganismos que possuem vida própria, formados por apenas uma célula. Há diversos tipos de microrganismos, cada um com suas próprias características biológicas (diferentes formatos, tamanhos e capacidade), podendo trazer riscos ou benefícios á saúde do homem. Um exemplo são as bactérias e os fungos, os quais se reproduzem rapidamente em alimentos, em condições ideais de ph, nutrientes, temperatura, água e oxigênio. Alterações físicas em alimentos intactos podem deteriorar os alimentos AMP. As lesões provocadas durante o processamento podem acarretar a descompartimentalização celular, possibilitando o contato de enzimas e substratos que originam modificações bioquímicas, como a formação de odores desagradáveis, escurecimento e perda de textura, ademais cortes e descascamentos favorecem a colonização dos tecidos vegetais por microrganismos deteriorantes e patogênicos (Wiley, 1997; Pinheiro, 2005). Sendo assim, o local adequado para o armazenamento de frutas e verduras minimante processados é um ponto fundamental para a fisiologia destes alimentos, desse modo, a temperatura, a umidade relativa e a composição atmosférica no interior da embalagem são condições ambientais que podem ser manipuladas para diminuir a respiração do vegetal e minimizar o crescimento microbiano (Shewfelt, 1986). Para avaliar a qualidade higiênica sanitária destes alimentos, a legislação brasileira estabelece limites na contagem de coliformes termotolerantes e Salmonella sp. Os coliformes totais são usados a fim de avaliar as condições higiênicas, já os coliformes termotolerantes como indicadores da qualidade sanitária e também como indicador da presença de microrganismos patogênicos (Oliveira, 2005) Produtos como frutas e verduras com processamento mínimo possui uma vida útil curta quando comparado á um alimento in natura, e requer condições específicas para armazenamento e condicionamento, principalmente quanto ao controle de temperatura (cadeia do frio) (SEBRAE, 2008). As inovações de tecnologia em várias fases das cadeias produtivas de diferentes alimentos não foram capazes de acabar com as diferentes ocorrências de surtos de toxinfecção alimentar. Há múltiplas formas de se contaminar o alimento, desde sua produção até em seu consumo. Uma das causas que aumenta o risco de probabilidade do alimento chegar ao consumidor contaminado são as práticas inadequadas de produção de alimento, as condições higiênicas sanitárias dos locais de fabricação, a não priorização por técnicas de controle, treinamento ineficaz dos manipuladores de alimentos e ou a falta de ética de alguns setores que visando somente o lucro, ignorando completamente a legislação (Takayanagui, 2000). Objetivou-se com esse estudo utilizar técnicas moleculares na detecção de bactérias e na qualidade microbiológica de alimentos minimamente processados.

3 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Materiais A pesquisa foi realizada com 12 amostras de frutas e hortaliças minimamente processados (goiaba, pera, repolho picado e maça), adquiridos nos principais supermercados de Cuiabá, Mato Grosso, no período de Fevereiro a Junho de 2016; acondicionados em caixas térmicas e encaminhadas para o laboratório de Biotecnologia do Instituto Federal de Ciência e Tecnologia de Mato Grosso (IFMT), Campus Cuiabá Bela vista. 2.2 Métodos Extração de DNA De cada amostra foram pesados 25 gramas e lavados com 5 ml de água ultrapura. 2 ml foram submetidos diretamente a extração de DNA e outros 2 ml foram colocados em meios de cultivo, de acordo com a APHA (2001), como controle. A extração do DNA foi realizada através de solução salina com proteinase K. Os procedimentos de extração detalhados foram: a) Aliquotas de 02 ml da amostra em água peptonada foram transferidas para tubos de 1,5 ml, estéril e centrifugadas por 05 minutos a 1000 rpm; b) Em seguida, o sobrenadante foi descartado e acrescentou-se 0,6 ml de solução salina e 0,02 ml de proteinase K, deixando em banho maria por 30 minutos a 50 C. Após, foi centrifugado por 5 minutos a rpm; c) O sobrenadante coletado foi transferido para um tubo de 1,5 ml estéril e acrescentado 500 ml de álcool isopropílico gelado. Foi centrifugado por 10 minutos a rpm e o sobrenadante foi descartado; d) Adicionou-se 0,5 ml de álcool 70%, para lavar os resíduos que restaram, centrifugado novamente por 10 minutos a rpm e descartou-se o sobrenadante; e) O pellet de DNA foi deixado em estufa por 12 horas para secar e hidratado com 0,03 ml de TE sendo, em seguida, armazenado a -20 C. Após a extração foi realizado a quantificação do DNA com o uso do equipamento DS 11 nanoespectrofotometro e a concentração de DNA utilizada na PCR foi de 20 ng/µl Reação em cadeia pela polimerase (PCR) A PCR foi realizada utilizando primers espécie específicos para quatro tipos de bactérias: Salmonella spp, E. coli, Shigella flexneri e Staphylococcus aureus e, em cada amplificação foram incluídos controles positivo (DNA de cepa pura certificada) e negativo (mistura da reação sem o DNA). O volume final da reação da PCR foi de 25 µl, onde 1 µl era de DNA (20ng), 05 µl era de DNTP (10 mm), 1,5 µl era de MgCl 2 (50 Mm), 0,2 µl de Taq DNA polimerase (1 U), 1,0 µl de cada oligonucleotídeo iniciador (10 µm) e 2,5 µl de tampão (10X). As condições para a amplificação foram um período de desnaturação inicial a 95 C por 5 minutos, continuado com 30 ciclos de amplificação, cada ciclo consistiu de desnaturação a 95 C por 45 segundos, anelamento a 50 C por 45 segundos e extensão a 72 C por 1 minuto. Após completar os 30 ciclos de amplificação, ocorreu o período de extensão final a 72 C por 7 minutos e a reação foi interrompida automaticamente por resfriamento a 12ºC até a aplicação em gel de agarose para a corrida de eletroforese horizontal. Em seguida, foi armazenado a -20ºC. Os produtos da amplificação foram analisados em gel de agarose a 1,5% corados com o fluoróforo gelred (Biotium), corante azul de bromofenol e DNA com bandas de peso molecular previamente conhecidas (ladder 100 pares de bases). A corrida conduzida em tampão Tris-Borato-

4 EDTA (TBE) 1X a 120 V por 40 minutos, visualizados em transiluminador com luz Ultra Violeta (UV) e fotodocumentados para análise. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Através dos resultados obtidos pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) foi possível averiguar, qualitativamente, a presença e ausência de bactérias patogênicas nesses alimentos, com o uso de marcadores moleculares específicos para as bactérias Salmonella spp, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Os resultados foram positivos para Salmonella spp e Escherichia coli em duas amostras de pera e repolho, minimamente processados e negativos em goiaba e maçã. Já para S. aureus e Shigella flexneri. Os resultados foram negativos para todas as amostras. Nos cultivos de 24 horas, em meios sólidos para bactérias Gram positivas e Gram negativas, foram verificadas colônias das amostras positivas, confirmando os resultados obtidos pelas técnicas moleculares. A presença de Salmonella spp, indica que o produto estava em desacordo com a RDC nº 12 de Janeiro de 2001, na qual está descrita que essa bactéria deve estar ausente em 25 gramas de hortaliças frescas in natura preparadas. Resultados semelhantes foram encontrados por Bruno et al. (2005) e Froder et al. (2007) que detectaram a presença de salmonela spp em frutas, tubérculos e hortaliças minimamente processadas comercializadas em Fortaleza (CE) e em hortaliças folhosas minimamente processadas comercializadas em São Paulo (SP), respectivamente. Para Escherichia coli também foi verificada a presença em duas amostras de alimentos. Cabrini et al. (2002) encontrou E. coli em 7% de amostras de alfaces e Furlaneto et al. (2005) constataram a presença dessa bactéria em 80% das amostras de variados vegetais minimamente processados. Bonnas et al. (2005) também encontraram resultados que corroboram com os trabalhos supracitados, em que a presença de Escherichia coli foi observada em 100% das amostras de vegetais minimamente processados comercializados na cidade de Uberlândia. De acordo com Seixas (2008), microrganismos indicadores de contaminação de origem fecal, quando presentes, evidenciam falhas graves em etapas de processamento, demonstrando que o alimento se encontra exposto a diversos fatores que contribuem para o seu desenvolvimento. Os resultados para S. aureus e Shigella flexneri foram negativos em todas as amostras, sendo essas bactérias restritas ao homem. Os alimentos podem ser contaminados por patógenos resultantes de condições higiênicas precárias durante o seu processamento, a partir de pessoas ou animais doentes ou por fezes de indivíduos infectados. Segundo Huss (1997), as medidas profiláticas a serem tomadas são uma boa higiene pessoal e uma educação sanitária dos manipuladores de alimentos, tratamento adequado da água utilizado na irrigação e também na lavagem dos mesmos quando já estiverem na indústria, acondicionamento em baixas temperaturas e a correta cocção antes do consumo. 4. CONCLUSÃO A utilização de métodos alternativos na detecção de bactérias patogênicas em alimentos possibilita a obtenção de resultados rápidos e também ajuda a tomar medidas corretivas em pontos críticos do processamento do alimento. A técnica utilizada na presente pesquisa foi eficaz, pois além de utilizar uma pequena quantidade de amostra é específica e precisa. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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