USO DE FERRAMENTAS MOLECULARES NA DETECÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM ESPÉCIES DE PEIXES COMERCIALIZADAS EM SORRISO-MT.

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1 USO DE FERRAMENTAS MOLECULARES NA DETECÇÃO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM ESPÉCIES DE PEIXES COMERCIALIZADAS EM SORRISO-MT. D.C. Pastro 1, E. C. Santos 2, S. Mariotto 3. Santos, D. O. Ritter 4, M. Lanzarin 5, G.S. Chitarra Mestra em Ciência e Tecnologia de Alimentos Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso, Campus Cuiabá Bela Vista CEP: Cuiabá MT Brasil, Telefone: 00 (65) Graduada em Engenharia de Alimentos Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso, Campus Cuiabá Bela Vista CEP: Cuiabá MT Brasil, Telefone: (65) Doutora em Genética e Evolução Instituto Federal de Mato Grosso, Campus Cuiabá Bela Vista CEP: , Cuiabá MT Brasil, Telefone: (65) Doutor em Medicina Veterinaria (Higiene Veterinaria e Processamento Tecnologico de Produtos de Origem Animal) pela Universidade Federal Fluminense, Instituto Federal de Educacao, Ciencia e Tecnologia de Mato Grosso, Campus Sorriso - CEP , ) 5-Doutora em Medicina Veterinaria (Higiene Veterinaria e Processamento Tecnologico de Produtos de Origem Animal) pela Universidade Federal Fluminense, Instituto Federal de Educacao, Ciencia e Tecnologia de Mato Grosso, Campus Sorriso - CEP , 6- Doutorado em Nutrição, Tecnologia e Biotecnologia de Alimentos- Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso, Campus Sinop CEP: Sinop MT Brasil, Telefone: (66) RESUMO O pescado é excelente nutricionalmente, porém é propenso a deterioração, sendo necessário analisá-lo para garantir sua inocuidade. O objetivo deste trabalho foi analisar, via PCR, a presença de Staphylococcus aureus em amostras de peixes resfriados comercializados em Sorriso-MT. Em 25g do tecido coletado foi acondicionado em caixas térmicas e encaminhadas para o laboratório de Biologia da UAB- Sorriso. Alíquotas de 0,1 ml de cada diluição foram colocadas em placas de Petri contendo meio de cultura Ágar Sangue, colocadas em estufa a 35ºC/24 horas. Extraiu-se o DNA no laboratório de Genética Animal da Universidade Federal de Mato Grosso- Cuiabá, utilizando kit de extração RTP Bactéria DNA (STRATEC Molecular). A PCR foi feita com primer espécie específico (R; 5 - ATG AAG TCA AAT AAA TCG CT 3 F; 5 - TTT GGT GAA AAA TAC TTC TC -3 ) - 458pb. para o gene nuc. O resultado foi negativo para todas as amostras. ABSTRACT The fish is excellent nutritionally, but is prone to deterioration, it is necessary to analyze it to ensure its safety. The aim of this study was to analyze, via PCR, the presence of Staphylococcus aureus in chilled fish samples marketed in Sorriso-MT. 25g of the collected tissue was placed in coolers and sent to the biology lab UAB- smile. 0.1 ml aliquots of each dilution were placed in Petri dishes containing blood agar culture medium, placed in an oven at 35 C / 24 hours. Extracted DNA in Animal Genetics laboratory of the Federal University of Mato Grosso- Cuiaba using extraction kit RTP Bacterium DNA (Molecular STRATEC). The PCR was performed with specific primer species (R; 5'-ATG AAG TCA AAT AAA GCT CT 3

2 'F; 5' - TTT GGT GAA AAA TAC TTC TC -3 ') - 458pb. for the nuc gene. The result was negative for all samples. PALAVRAS-CHAVE: Bactéria, qualidade sanitária, pescado. KEYWORDS: Bacterium, sanitary quality, fish. 1 INTRODUÇÃO A aquicultura comercial vem garantindo cada vez mais o pescado na mesa do consumidor. A indústria pesqueira no Brasil é um dos setores de maior crescimento e lucratividade (HILSDORF; PETRERE, 2002). A qualidade do pescado até a mesa do consumidor deve ser preservada, para evitar uma carga microbiana elevada, que pode ser composta por micro-organismos tanto deteriorantes quanto patogênicos, causando, dessa forma, perdas na qualidade e problemas a saúde do consumidor. Um importante avanço na área da biodiversidade microbiana foi o uso do DNA, uma impressão digital molecular que pode ser utilizada para identificar e quantificar microorganismos permitindo o desenvolvimento de técnicas que independem de cultivos puros para análise da diversidade da comunidade (AMANN et al., 1995). Os métodos tradicionais de isolamento e identificação de micro-organismos são baseados principalmente no cultivo e análise morfológico, fisiológico e bioquímico. Esses métodos demandam muito tempo e extenso trabalho. Entretanto, alguns micro-organismos podem não ser cultiváveis por técnicas padrões, pelas condições físicas ou químicas de crescimento ou até mesmo pela interdependência intrínseca de outros micro-organismos (ALMEIDA, 2009). Devido esta perspectiva de demanda e exigência de qualidades fitossanitárias dos produtos e serviços, se faz urgente o uso de tecnologias moleculares na identificação de microorganismos, por ser hoje o método mais rápido e confiável de determinação dos mesmos. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi analisar a presença de Staphylococcus aureus em espécies de peixes comercializadas em Sorriso-MT, utilizando técnicas moleculares para a sua detecção. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Coleta das Amostras A pesquisa foi realizada com amostras resfriadas das espécies de cachara, pacu, trairão, tilápia, judiará, matrinchã, tambaqui e pintado coletados em mercados, peixarias e feiras no município de Sorriso, Mato Grosso. Cerca de 25g do tecido do peixe foi coletado e as amostras foram acondicionadas em sacos plásticos estéreis, colocadas em caixas isotérmicas com bolsas de gelo e encaminhadas para o laboratório de Biologia do polo da UAB de Sorriso-MT. 2.2 Cultivo das Bactérias De acordo com Apha, 2001 e Silva, 2010, de cada amostra foram retirados assepticamente 25g, em triplicata e transferidos para frascos contendo 225 ml de água peptonada estéril a 0,1%. A seguir, a amostra foi homogeneizada e realizada a diluição até As alíquotas de 0,1 ml (100 µl) de cada diluição foram colocadas nas placas de Petri contendo meio seletivo para bactérias Gram-positivas (Ágar Sangue). As placas foram lacradas com fitas e levadas para a estufa a 35ºC por 24 horas. Após esse período, foi realizado o

3 enriquecimento das colônias em caldo BHI (Caldo infusão cérebro e coração), em estufa a 35ºC por 18 horas Extração de DNA Para a extração do DNA, utilizou-se o kit de extração RTP Bactéria DNA Mini Kit (STRATEC Molecular) conforme instruções do fabricante. Retirou-se 0,1 ml (100 µl) do caldo BHI e transferiu para o tubo de extração, adicionou-se 400 μl do tampão de ressuspensão e deixou incubar por 10 minutos a 37ºC em banho Maria. Após, incubação por mais 10 minutos a 65ºC e mais 5-10 minutos a 95ºC em banho maria. Acrescentou-se 400 μl do tampão de ligação (binding buffer) B6, e fez-se a mistura. Em seguida, a amostra foi transferida para o filtro de rotação, e foi incubado por 1 minuto e centrifugado por 2 minutos a 8000 rpm. Acrescentou-se 500 μl de tampão de lavagem I no filtro de rotação, centrifugado por 1 minuto a 8000 rpm e descartado o filtrado. Transferiu-se a solução do filtro para outro tubo e acrescentou-se 600 μl de tampão de lavagem 2, após centrifugação por 1 minuto a 8000 rpm, e descartado o liquido. Centrifugação novamente por 4 minutos a rpm para total remoção de resíduos de etanol. Após, descarte do tubo RTA receiver e a solução do filtro colocado em tubo de 1,5 ml. Pipetou-se 150 μl de tampão de eluição, e incubação por 10 minutos a temperatura ambiente e centrifugação por 1 minuto a rpm para ressuspender o DNA, descartando o filtrado e armazenando o DNA -20 C imediatamente Quantificação do DNA O DNA extraído foi quantificado em nanoespectrofotômetro da marca DeNovix e em seguida, foi feita corrida eletroforética em gel de agarose 1% corado com red, blue juice e ladder 100 bp (pares de bases) e conduzida em Tris-Borato-EDTA (TBE) 1X a 120 V por 30 minutos, sendo visualizado em transiluminador da marca UVP Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada utilizando primer espécie específico (R; 5 - ATG AAG TCA AAT AAA TCG CT 3 F; 5 - TTT GGT GAA AAA TAC TTC TC -3 ) - 458pb. para amplificação das seqüências do gene nuc. As amplificações por PCR foram realizadas em termociclador (Mastercycler- Eppendorf ), utilizando 1,0 µl de DNA (20 ng), 1,0 µl de cada oligonucleotídeo (10,0 µm), 0,5 µl de dntps (10 mm), 1,5 µl de MgCl 2 (50 mm), 2,5 µl de PCR Buffer 10x (10 mm Tris-HCl, 50 mm KCl), e 1U de Taq DNA polimerase para um volume final de 25 µl. A amplificação foi: 1período de desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, seguido de 30 ciclos de amplificação, sendo cada ciclo de desnaturação a 95 ºC por 45 segundos, anelamento a 50 ºC por 45 segundos e extensão a 72 ºC por 1 minuto. Depois de completados os 30 ciclos de amplificação, houve período de extensão final a 72 ºC por 7 minutos (MOTLAGH; ANVARI, 2010). Os produtos amplificados foram examinados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, com 120 Volts por 40 minutos. O gel foi corado gel red e blue juice na proporção de 1:1 e visualizado em aparelho transiluminador com fotodocumentador acoplado (Loccus Biotecnologia ). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO O resultado obtido para Staphylococcus aureus utilizando técnica molecular foi satisfatório, bactéria ausente em todas as amostras estudadas. Esse resultado está de acordo com o encontrado por Soares et al.,2012, que não detectaram essa bactéria em filés de tilápia conservados em gelo, comercializados no município de Apodi, Rio Grande do Norte. Lorenzon, 2009, em estudo sobre perfil microbiológico de peixes e água de cultivo em pesque-pague de São Paulo, não detectou a presença de S. aureus, pelo fato dos peixes serem coletados diretamente dos viveiros e não receberem nenhum tipo de manipulação.

4 No entanto, no estudo de Santos et al.,2008 com piramutaba (Brachyplatistoma vaillanti) congelada na região de Belo Horizonte, das 20 amostras, 10% estavam contaminadas com S. aureus. Os resultados confirmam baixa incidência desse patógeno no estudo, corroborando com Bartolomeu et al.,2001 que detectou quantidades inferiores ao que preconiza a Resolução RDC 12/2001 em 25 gramas do pescado in natura ou refrigerado (ANVISA, 2001). Resultados de pesquisas citadas estão de acordo com o presente estudo, porém com o uso de técnicas de detecção distintas. Maes et al., 2002, estudaram a comparação de técnicas fenotípicas e técnicas moleculares (PCR) para o gene nuc, na caracterização e identificação de S.aureus e obtiveram 100% de confirmação dos resultados. Este fato evidencia a confiabilidade das duas técnicas utilizadas no estudo e demonstra a efetividade do gene nuc para detecção desse patógeno. Essa bactéria geralmente é encontrada no corpo humano, trato respiratório, mucosas nasais e pele, sendo transferida ao alimento por pessoas com precários hábitos de higiene durante a manipulação ou armazenamento do produto. Estudos revelam a presença desse patógeno em diversas fontes, como ar, agua doce, agua salgada, solo e plantas (LORENZON, 2009; ADAM e MOSS, 2000). As intoxicações alimentares são ocasionadas por vários tipos de Staphylococcus, mas principalmente pelo S. aureus que exerce a sua ação através de suas toxinas, que se formam por ocasião do seu crescimento (FRAZIER et. al. 1993). 4. CONCLUSÃO Todas as amostras de peixe estudas apresentaram ausência de S. aureus, indicando que não houve falha de caráter higiênico sanitário na manipulação desse pescado, estando apto para o consumo. A técnica de PCR foi considerada eficiente na detecção e é imprescindível o uso dessa técnica nas indústrias de alimentos, pois fornece resultados mais rápidos e confiáveis. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Almeida, E.G Caracterização físico-química e microbiológica de bebidas fermentadas produzidas pelos índios Tapirapé. Tese de doutorado. Lavras:UFLA- MG, 2009, 117p. Amman, R.I. et al. Phylogenetic identification an in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiology Review, Washington, v 59: Frazier, W.C.; Westhoff, D.C. Microbiologia de los alimentos. 4.ed. Zaragoza: Acribia, p Hilsdorf, A. W. S.; Petrere, M. J. Conservação de peixes na bacia do rio Paraíba do sul. Revista Ciência Hoje. v. 30, n. 180, Lorenzon, C. S. et al. Perfil microbiológico de peixes e água de cultivo em pesque-pague situados na região nordeste do Estado de São Paulo. Arquivos do Instituto Biológico. São Paulo, v.77, n.4, p , out./dez., Maes, N.et al. Evaluation of a triplex PCR assay to discriminate Staphylococcus aureus from coagulase-negative Staphylococci and determine methicillin resistance from blood cultures. Journal of Clinical Microbiology., v.40, n.4, p , Silva, N.et al. Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos. 624p. 2. ed. São Paulo: Livraria Varela

5 Santos, T.M. et al. Inspeção visual e avaliações bacteriológica e físico-química da carne de piramutaba (Brachyplatistoma vaillanti) congelada. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2008; 60(6)

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