RESUMO: GRANADEIRO, P. C.; SILVA, R. A.

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1 71 EFEITO DO TEMPO E DA TEMPERATURA DE ARMAZENAMENTO SOBRE A CONTAGEM BACTERIANA EM AMOSTRAS DE LEITE DE VACAS POSITIVAS E NEGATIVAS AO CALIFORNIA MASTIT TEST PRISCILA CAMARGO GRANADEIRO 1 ROSÂNGELA ANTUNES DA SILVA 2 SHANA DE MATTOS DE OLIVEIRA COELHO 3 LIGIA PORTUGAL GOMES 3 MILIANE MOREIRA DE SOUZA 4 RITA DE CÁSSIA CAMPBELL MACHADO BOTTEON 5 1. Discente de Medicina Veterinária UFRuralRJ / Bolsista de Iniciação Científica PIBIC / CNPq; 2. Discente de Medicina Veterinária UFRuralRJ / Bolsista de Iniciação científica - FAPERJ; 3. Discente de Mestrado em Microbiologia UFRuralRJ; 4. Professor DMIV / IV / UFRuralRJ; 5. Professor DMCV / IV / UFRuralRJ; RESUMO: GRANADEIRO, P. C.; SILVA, R. A. da; COELHO, S. de M. de O.; GOMES, L. P.; SOUZA, M. M. de; BOTTEON, R. de C. C. M. Efeito do tempo e da temperatura de armazenamento sobre a contagem bacteriana em amostras de leite de vacas positivas e negativas ao California Mastit Test. Revista Universidade Rural: Série Ciências da Vida, Seropédica, RJ: EDUR, v. 25, n.1, p , jan.-jun., A qualidade do leite está intimamente ligada à carga microbiana inicial e à taxa de crescimento bacteriano. Os cuidados para obtenção de um leite de boa qualidade higiênico sanitária devem começar antes da ordenha, e a temperatura de armazenamento contribui para melhor preserva-lo. Em julho de 2004, foram obtidas 9 amostras, de vacas com resultados positivos e negativos ao CMT, visando avaliar a qualidade do leite cru, bem como verificar os efeitos do tempo e da temperatura sobre o crescimento microbiano. As amostras cuja origem foram vacas com reações negativas ao CMT em média apresentaram maiores contagens bacterianas e maiores valores de acidez. Palavras-chave: qualidade do leite, microbiologia, mastite, manejo sanitário. ABSTRACT: GRANADEIRO, P. C.; SILVA, R. A. da; COELHO, S. de M. de O.; GOMES, L. P.; SOUZA, M. M. de; BOTTEON, R. de C. C. M. Effect of time and temperature of stocking on bacterial counting in milk samples of positive and negative cows to California Mastit Test. Revista Universidade Rural: Série Ciências da Vida, Seropédica, RJ: EDUR, v. 25, n.1, p jan.-jun., Hygienic quality of milk is related to its initial microbiological load and to bacteria growth rate. Procedures in order to obtain a milk of good hygienic sanitary quality begin before milking and the storage temperature contributes for its preservation, and the storage temperature contributes for its preservation. In July/2004 were obtained nine milk samples of the cows with CMT positives and negatives, to evaluate of the raw milk and time and temperature effects on microbial increase. The samples of the CMT positives cows presented higher microbial counting and higher average acidity values. Key Words: milk quality, microbiology, mastitis, sanitary handling. temperature effects on microbial increase. The samples of the microbiology, mastitis, sanitary handling. INTRODUÇÃO O leite é um alimento de alto valor nutritivo devido sua riqueza em constituintes nutritiv os e energéticos, em f orma facilmente assimilável. Em contrapartida, o leite e seus derivados aparecem como produtos de fácil deterioração, tendo suas características f ísicas, químicas e biológicas facilmente alteradas pela ação de microrganismos e pela manipulação a que é submetido (DüR, 2004). O consumo crescente de leite e produtos derivados e a procura cada vez maior por um produto de boa qualidade, leva a uma preocupação com a segurança, uma vez que durante as diferentes etapas do processamento existem riscos de contaminação ou multiplicação de microrganismos que são potencialmente perigosos para a saúde dos consumidores (CARVALHO, L.T.) Ainda que não haja danos à saúde do consumidor, a baixa qualidade implicará em alterações de

2 72 Efeito do tempo... seus componentes. A qualidade do leite vem sendo amplamente debatida nos últimos anos, dev ido às mudanças previstas na legislação (Instrução Normativa 051/ MAPA). Mesmo não sendo autosuficiente, o Brasil é o sexto produtor mundial de leite, e considerado a importância do leite como alimento de alto valor nutricional e como atividade que tem impacto sócio econômico significativo em nosso país, a obtenção de um produto de alta qualidade, antes de ser uma opção, deve ser um compromisso de toda a cadeia produtiv a. A qualidade do leite é influenciada principalmente pelo estado sanitário do rebanho, manejo dos animais e dos equipamentos de ordenha, e pela presença de microrganismos, resíduos de drogas e odores estranhos (DÜRR et al., 2000). A avaliação dos fatores que afetam a qualidade do leite tem importância indiscutível, especialmente considerandose a realidade dos produtores de leite no Brasil, que em sua maior parte, operam com baixa tecnologia e participação decrescente no mercado lácteo global. Assim sendo, o que se espera é que os pequenos produtores, que vêm perdendo fatias do mercado, possam se adequar às novas exigências. As variações na carga microbiana do leite além dos limites preconizados pela legislação podem ocasionar problemas de ordem tecnológica e econômica, por alterações nas características sensoriais, no beneficiamento e rendimento de produção e na vida útil de prateleira do leite seus derivados, resultando em produtos de baixa qualidade, podendo colocar em risco a saúde do consumidor. O resfriamento não melhora a qualidade do leite, mas contribui para a sua preservação (SILVA et al., 2004). A qualidade do leite está intimamente ligada à carga microbiana inicial e à velocidade de multiplicação das bactérias. A contaminação pode ocorrer durante a ordenha, no processamento com equipamentos inadequados, devido à falta de limpeza e higiene dos recipientes, devido ao estado de saúde dos animais, assim como de diversas outras maneiras. Os cuidados para obtenção de um leite de boa qualidade devem começar antes da ordenha. Para isso, deve-se atentar para sanidade do rebanho quanto à ocorrência de doenças infecto-contagiosas, uso adequado de medicamentos cujos resíduos podem ser excretados pela glândula mamária, estado nutricional e condição metabólica dos animais cujo leite destinase ao consumo. Como medida essencial para garantir qualidade ao produto em questão, preconiza-se a ordenha realizada em obediência às normas básicas de higiene e de bem estar animal. Neste contexto, a higiene pessoal de quem lida diretamente com os animais e a limpeza dos equipamentos de ordenha devem ser rigorosamente controladas. A taxa de multiplicação das bactérias está diretamente relacionada a temperatura em que o leite é armazenado, uma vez que o leite é extraído com uma grande quantidade de microorganismos, ele jamais apresentará boa qualidade, mesmo que a velocidade de multiplicação seja muito pequena. Em geral, quanto maior o número de contaminantes e quanto mais alta for a temperatura na qual o leite permanece (próxima de 30 o C), menor será o seu tempo de conservação (SILVEIRA et al., 2002). Portanto, todo produtor deve adequar o manejo geral do rebanho sem omitir, em qualquer instante, as boas práticas de manipulação, para manter a qualidade da matéria prima (FUHRMANN, 1997). A temperatura ideal apontada por vários pesquisadores é de 4 C, em no máximo 2 horas após a ordenha, não devendo ultrapassar 10 C na mistura de leite em tanques comunitários ou na entrega para a indústria. A legislação permite que o leite seja transportado sem refrigeração ao posto de beneficiamento, desde que o tempo entre a ordenha e o processamento não ultrapasse 2 horas. A refrigeração entre 5 e 10 o C configura um resfriamento marginal do leite, contribuindo.

3 73 para a multiplicação de microrganismos psicrotróficos (SANTOS & LARANJA, 2001), cujo gênero mais freqüentemente isolado é Pseudomonas (SUHREN, 1989). O presente estudo visa avaliar a qualidade do leite cru, recém ordenhado, bem como v erif icar os ef eitos do tempo e da temperatura sobre o crescimento microbiano em amostras provenientes de vacas com resultados positivos e negativos ao CMT. MATERIAL E MÉTODOS O estudo foi realizado em julho de 2004, utilizando-se amostras de leite provenientes de nove vacas em lactação, sendo cinco com reação positiva e quatro com reação negativa ao CMT (Califórnia Mastits Test). Os animais utilizados pertencem ao plantel da Bovinocultura de Leite da UFRRJ, localizada na BR 465, Km 07 em Seropédica, RJ. Amostras individuais de leite foram obtidas em frascos plásticos utilizados diversas vezes para transporte de leite e armazenamento em geladeira, mantidos por 12 horas em solução de hipoclorito de sódio 1% e higieneizados com água e sabão, visando simular as condições reais em que o leite é obtido, armazenado e transportado até a indústria. Após a higienização dos quartos mamários (lavagem com água e sabão neutro e secagem com toalhas de papel descartáveis), procedeu-se a realização do CMT segundo SCHALM & NORLANDER (1957), desprezando-se os três primeiros jatos, e a coleta de amostras pareadas em frascos com numerações seqüenciais. Imediatamente, os f rascos f oram acondicionados em recipientes térmicos contendo gelo e encaminhadas para as análises, sendo as alíquotas de cada uma encaminhadas respectivamente, para os laboratórios de Pesquisas Clínicas em Bovinos e Eqüinos, no Instituto de Veterinária, para a análise físico-química e para o laboratório de Bacteriologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, no mesmo instituto, para determinação da carga microbiana. As amostras destinadas à verificação da carga microbiana foram processadas em aproximadamente trinta minutos, ao passo que aquelas destinadas á análise físicoquímica, cujas provas foram a da acidez Dornic e ph, foram analisadas em cerca de uma hora. A seguir, cada amostra foi dividida em três alíquotas, mantidas respectivamente em temperatura ambiente (TA), geladeira (TG) e em estufa (TE) a aproximadamente 35º C por 12 horas, quando foram todas novamente testadas e acondicionadas em geladeira. Uma última análise de acidez e ph foi efetuada cerca de 24 horas após a coleta, quando foram novamente encaminhadas ao laboratório de Bacteriologia para novo processamento, visando obter uma contagem bacteriana relativa aos diferentes tratamentos térmicos instituídos, 24 horas depois. No laboratório de Bacteriologia, tanto as amostras de leite fresco quanto aquelas procedentes dos tratamentos TA, TG e TE, após 24 horas, foram diluídas em solução salina 0,85% estéril até as diluições de 10³. A seguir, as diluições foram inoculadas em placas de Petri descartáveis, contendo 10 ml de Agar CLED, e mantidas em estuf a bacteriológica a 37 C. Após 24h de incubação procedeu-se a contagem do número de colônias observadas. Para efeito de enumeração de microrganismos, utilizou-se a diluição em que se obteve o menor número de colônias visíveis e ausência de crescimento na diluição seguinte, anotando-se o número de colônias e a respectiva diluição. RESULTADOS E DISCUSSÃO Três amostras obtidas de vacas com reações positivas ao CMT, na análise inicial apresentaram valores de acidez Dornic abaixo do que preconiza a legislação. Entre aquelas procedentes de vacas negativas ao

4 74 Efeito do tempo... CMT, nenhum valor de acidez abaixo de 14º Dornic, equivalente a 14g de ácido lático/100 ml de leite, foi observado, sendo a média entre estas amostras superior àquelas com CMT positivo (Tabela 01 e 02). Tabela 01. Valores de acidez em graus Dornic e contagem de bactérias em amostras de leite de vacas negativas ao Califórnia Mastit Test, segundo o tempo e a temperatura de armazenamento. CMT- T1 G12 A12 E12 G24 A24 E24 Acidez CBT Acidez Acidez Acidez Acidez CBT Acidez CBT Acidez CBT A1 15,94 206X ,92 14,94 20,92 21, X ,94 IC 54,78 IC A2 14,44 7X ,44 13,94 17,93 16,93 30 X ,94 IC 44,82 IC A3 14,94 31X ,44 13,94 15,44 15,44 3,5 X , 97 IC 54,78 IC A4 14,94 67X ,44 14,94 17,43 17,43 0,5 X ,90 IC 57,27 IC Média 15,06 16,31 14,44 17,93 17,93 14,94 IC 52,91 IC T1= Análise inicial, G12 amostras em geladeira por 12 horas, A12 - amostras em temperatura ambiente por 12 horas, E12 amostras em estufa a 35º C por 12 horas, G24 amostras em geladeira após 24 horas, A24 - amostras em temperatura ambiente por 24 horas, E24 amostras em estufa a 35º C por 24 horas, IC incontáveis. Tabela 02. Valores de acidez em graus Dornic e contagem de bactérias em amostras de leite de vacas positivas ao Califórnia Mastit Test, segundo o tempo e a temperatura de armazenamento. CMT- T1 G12 A12 E12 G24 A24 E24 Acidez CBT Acidez Acidez Acidez Acidez CBT Acidez CBT Acidez CBT A1 15,68 3 x ,21 14,26 15,21 12,95 117X ,94 32X ,39 IC A2 10,93 1 x ,88 10,46 10,46 10,46 18X ,45 6,5X ,41 98X10 4 A3 13,31 2,5 x ,83 13,31 13,79 11,95 54X ,45 2X ,92 IC A4 15,21 2,5x ,64 16,16 17,11 14,44 10,5X ,44 5,5X ,38 IC A5 11,40 2,0 x ,98 11,88 11,88 9,46 6,5X ,96 115X ,42 IC Média 13,31 2 x ,31 13,21 13,69 11,85 12,85 21,91 IC T1= Análise inicial, G12 amostras em geladeira por 12 horas, A12 - amostras em temperatura ambiente por 12 horas, E12 amostras em estufa a 35º C por 12 horas, G24 amostras em geladeira após 24 horas, A24 - amostras em temperatura ambiente por 24 horas, E24 amostras em estufa a 35º C por 24 horas; IC incontáveis. Os menores v alores de acidez observados entre as amostras CMT positivo foram 10,93 e 11,40 ºD, registrados nas amostras com menores cargas microbianas iniciais. Após 12 h, estas amostras mantiveram os menores valores de acidez, tanto em geladeira quanto em temperatura ambiente e na estufa (TG, TA e TE). Após 24h, comportamento semelhante quanto aos valores de acidez foram registrados para essas amostras mantidas em geladeira. Quanto à contagem de microorganismos, após 24 horas, o número de UFC foi menor em amostras mantidas em TA, exceto na amostra 5, que partiu de um inóculo baixo e revelou, após o tempo decorrido, uma contagem bacteriana elevada (115 x 10 UFC/mL) e bem próxima da maior contagem observada entre as amostras mantidas em geladeira (117 x 10²). Os valores de acidez das amostras em temperatura ambiente e geladeira mantiveram-se próximos aos valores iniciais, sem diferença significativa em relação a estes, quando analisados pelo teste da análise de variância (Anova fator único). Tanto para amostras conservadas em geladeira quanto para aquelas em temperatura ambiente, as maiores taxas de crescimento bacteriano não resultaram em maior acidez, mantendo-se os valores abaixo do que preconiza a legislação (14 Dornic ou 14 mg de ácido lático/100 ml de leite). Amostras mantidas a 35 C (estufa), apresentaram após 12 horas, níveis de acidez próximos aos iniciais, também sem diferença significativa em relação a estes. Igualmente ao que ocorreu.

5 75 nos outros dois tratamentos, os valores de acidez mais baixos foram observados nas amostras com contagens bacterianas menores na análise inicial. Após 24 horas da ordenha, todas as amostras mantidas em estufa demonstraram, como previsto, crescimento bacteriano significativamente maior que as amostras recém obtidas e aquelas mantidas em geladeira e ambiente, sendo apenas uma amostra dentro dos padrões exigidos pela legislação, no que se refere à acidez. As amostras cuja origem foram vacas com reações negativas ao CMT, em média apresentaram maiores contagens bacterianas e maiores valores de acidez. Na análise inicial, todas apresentaram acidez titulável entre 14 e 18 ºD, portanto dentro da normalidade. Com 12 horas de tratamento observou-se, em geladeira, que duas amostras sofreram acidificação, uma manteve a estabilidade quanto à acidez e em outra houve redução desta. Todas foram menos ácidas em ambiente que em geladeira e, em relação à análise inicial, apenas uma manteve sua acidez tituláv el igual, as demais apresentaram valores mais baixos. A temperatura ambiente, inclusive, foi o tratamento que mais propiciou alcalinização de amostras, sendo duas delas (amostras 2 e 3) ligeiramente abaixo dos 14 Dornic (ambas com 13,94). Às 12 horas de tratamento, todas as amostras TE apresentaram acidez mais elevada que seus pares mantidos refrigerados e no ambiente. Os testes 24 horas após a ordenha demonstraram acidificação em todas as amostras de todos os tratamentos, exceto em duas amostras em TA, que permaneceram com acidez semelhante à leitura das 12 horas, mantendo-se a uma delas, ainda um pouco abaixo dos 14 D. Em TG, uma amostra apresentou acidez em graus Dornic maior que 18 e em TE, todas as amostras apresentaram mais ácidas do que permite a legislação. A refrigeração do leite imediatamente após a ordenha visa diminuir o crescimento de microrganismos mesófilos causadores de acidificação, entretanto pode favorecer a microbiota psicrotrófica que estiver presente na matéria prima, o que poderá causar outras alterações no leite e seus derivados. A refrigeração do leite como forma de diminuir a multiplicação, contudo, tem sua máxima eficiência se associada a outros fatores, especialmente relacionados à higiene (FAGUNDES, et al., 2004). Desta forma, esperava-se um maior crescimento bacteriano entre as amostras mantidas em ambiente e estufa e mesmo a acidificação significativa das amostras estudadas, o que não foi confirmado em relação aos diferentes tratamentos após 12 horas, especialmente entre aquelas procedentes de vacas com CMT positivo. Pode-se sugerir que o tipo de microrganismo presente, ou pelo menos predominante, fosse não fermentativo, a exemplo das bactérias do gênero Pseudomonas. Estas bactérias não atuam sobre a lactose produzindo ácido lático. Estes resultados sugerem que os diferentes tipos de microorganismos causadores de mastites poderem agir de formas diversas sobre os componentes do leite, bem como exigem condições dif erenciadas para multiplicação. Os dados sugerem ainda, que em vacas sem mastite subclínica, a microbiota do leite é menos exigente em termos de temperatura e neste caso, as condições de higiene parecem mais signif icativ as para o crescimento microbiano. O leite de v acas que apresentam mastite desvia da composição normal, em vários aspectos. A tendência desta mudança é em direção à composição do sangue, cujo ph está entre 7,3 e 7,5 (SMITH, 1993), o que justifica os menores valores de acidez observados em amostras provenientes de vacas com CMT positivo. Considera-se que nos casos de mastite, em geral, há o predomínio de um agente patogênico, provavelmente mais exigente em termos de temperatura. Isso não ocorre nos casos de CMT negativo, onde uma população mais ampla e em equilíbrio permite uma taxa de crescimento

6 76 Efeito do tempo... maior, sendo a exigência provavelmente menor. Uma vez que os frascos de coleta e armazenamento eram apenas higieneizados, não esterilizados, visando simular a condição de obtenção, armazenamento e transporte do leite na maioria das unidades produtoras, pode-se sugerir que a flora contaminante tenha predominado, por serem estes mais tolerantes às condições ambientais impostas. Contudo, este não é um fator que justifica as maiores taxas de crescimento em amostras com CMT negativ o, considerando que todas as amostras foram obtidas e armazenadas em recipientes igualmente higieneizados. CONCLUSÕES De acordo com este estudo, é possível concluir que, embora a carga microbiana original do leite CMT positivo seja maior que a do CMT negativo, condições sanitárias e de armazenamento, especialmente temperatura, podem tomar importância maior e influenciar diretamente a qualidade final do produto obtido. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CARVALHO, L.T. Avaliação das Boas Práticas de Fabricação (BPF) e Análise dos Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) na produção de queijo minas. Tese de Mestrado, Instituto de Tecnologia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, p , DURR, J.W.; FONTANELLI, R.S.; BURCHARD, J.F. Fatores que afetam a composição do leite. Anais - EMBRAPA Trigo, DüRR, J.W. Programa Nacional de Melhoria da Qualidade do Leite: uma oportunidade única. In: DÜRR, J. W.; CARVALHO, M. P.; SANTOS, M. V. O compromisso com a qualidade do leite no Brasil, Passo Fundo: UFP Editora, 2004, 331p. FAGUNDES, C.M.; FISCHER, V.; SILVA, W.P.; CARBONERA, N.; ARAÚJO, M. R. Enumeração de Pseudomonas spp no leite bov ino cru recém-obtido e no leite refrigerado durante as diferentes etapas da ordenha com distintos manejos higiênicos. In: DÜRR, J. W.; CARVALHO, M. P.; SANTOS, M. V. O compromisso com a qualidade do leite no Brasil, Passo Fundo: UFP Editora, 2004, 331p. FUHRMANN, T.J. Quality milk starts with a quality management. Dairy Works, Tempe, Arizona, National Mastits Council Annual Meeting Proceedings, p , Instrução Normativa MAPA 051/Set2002: Regulamentos técnicos propostos na portaria 56/1999 são publicados para vigorar em julho de SANTOS, M.V.; LARANJA, F.L.F. Importância e ef eito de bactéria psicrotróficas sobre a qualidade do leite. Revista Higiene Alimentar, v. 15, n. 82, p , 2001.SCHALM & NORLANDER (1957). SCHALM, O.W. & NORLANDER, D.O. Experiments and observations leading to development of the California Mastitis Test. Journal of American Veterinary Medical Association, v.130, p , SILVA, P.H.F.; PORTUGAL, J.A.B.; CASTRO, M. C. D. Qualidade e competitividade em laticínios. EPAMIG, centro Tecnológico/ ILCT, Juiz de Fora/ MG, SILVEIRA, I.A.; CARVALHO, E.P.; TEIXEIRA, D. Influência de microrganismos psicrotróficos sobre a qualidade do leite refrigerado h t t p : / / w w w. l a t i c i n i o. n e t / inf_tecnicas.asp?cod=12..

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