DIEGO CARLOS ANDRADE PEREIRA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU CCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE DIEGO CARLOS ANDRADE PEREIRA ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA TRANSMISSÃO DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO MUNICÍPIO DE BRUMADINHO MINAS GERAIS. DIVINÓPOLIS-MG 2016

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU CCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE DIEGO CARLOS ANDRADE PEREIRA ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA TRANSMISSÃO DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO MUNICÍPIO DE BRUMADINHO MINAS GERAIS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade Federal de São João Del-Rei, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre Orientador: Eduardo Sérgio da Silva Co-orientador: Gustavo F. Paz DIVINÓPOLIS-MG 2016

3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI UFSJ CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU CCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE Defesa da dissertação de mestrado do Diego Carlos Andrade Pereira, intitulada Aspectos epidemiológicos da transmissão de Leishmaniose Visceral Canina no município de Brumadinho Minas Gerais, orientado pelo prof. Dr. Eduardo Sérgio da Silva, apresentado à banca examinadora designada pelo colegiado do Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde da UFSJ, em de de Os membros da Banca Examinadora consideram o candidato. Banca Examinadora: ii

4 Resumo As Leishmanioses são enfermidades zoonóticas com grande distribuição mundial e endêmica em vários países do mundo. A estimativa é que sua incidência anual seja de cerca de 2 milhões de casos, destes aproximadamente 1,5 milhões causados por formas tegumentares e 500 mil pela forma visceral. Nas Américas, o agente causador da forma visceral são os protozoários da espécie Leishmania (Leishmania) infantum e a transmissão ao hospedeiro ou reservatório vertebrado ocorre através da picada de dípteros da espécie Lutzomyia longipalpis. O cão tem sido apontado o principal elo da transmissão de Leishmania (L.) infantum aos seres humanos, devido ao grande número de cães infectados e o parasitismo cutâneo que ocorre nestes animais. Essa importância é evidenciada quando observa-se que casos humanos geralmente ocorrem em locais com grande prevalência canina de LV e que a infecção destes animais precede a humana. O Município de Brumadinho está situado na região metropolitana de Belo Horizonte, com uma população de habitantes segundo dados de 2010 do IBGE. Brumadinho apresentou 13 casos de LV humana nos anos de 2007 a 2013, sendo considerada de transmissão esporádica pelos critérios do Ministério da Saúde. Durante a realização do estudo, foram avaliados 1413 cães, destes 672 (47,6%) machos e 741 (52,4%) de fêmeas e deste total 60 cães identificados como infectados por LVC, sendo 34 (56,7%) machos e 26 (43,3%) de fêmeas. A prevalência global identificada neste estudo foi de 4,25%, com a variação entre os setores de 1,82% (mínima) no estrato 01 e superior a 10% no estrato 07 (máxima). A avaliação clínica realizada em 28 cães dos 60 positivos indicou que 20 (71,42%) apresentaram pelo menos um sinal clínico da LVC e 8 (28,57%) não apresentaram qualquer sinal da doença e em todos eles os protozoários pertenciam a espécie Leishmania infantum. A análise da distribuição espacial dos casos de LVC na cidade de Brumadinho auxiliada pela ferramenta densidade de Kernel aponta duas áreas principais para a estratégia de controle/combate dessa doença no município. Os resultados obtidos neste trabalho poderão direcionar as ações de controle à LV no município, contribuindo para uma possível redução da expansão da Leishmaniose Visceral. Palavras chave: Leishmaniose Visceral Canina, Prevalência, Distribuição espacial. iii

5 Abstract The Leishmaniasis are zoonotic diseases with major global and endemic distribution in countries around the world. It is estimated that the annual incidence is about 2 million cases, of these approximately 1.5 million caused by cutaneous forms and 500,000 by the visceral form. In the Americas, the causative agent of visceral leishmaniasis (VL) are protozoa of the Leishmania (Leishmania) infantum and transmission to the host or vertebrate reservoir occurs through the bite of flies of the species Lutzomyia longipalpis. The dog has been appointed the main link in the transmission of Leishmania (L.) infantum to humans due to the large number of infected dogs and the presence of the parasite in the skin. This importance is evidenced when it is observed that human cases usually occur in areas with high prevalence of canine VL with the infection of these animals preceding the human. The municipality of Brumadinho is located in the metropolitan region of Belo Horizonte, with a population of 33,973 inhabitants according to 2010 data from the IBGE. Brumadinho presented 13 cases of human VL in the years 2007 to 2013 which is considered sporadic transmission by the Ministry of Health criteria. During this study, 1413 dogs were evaluated, of these 672 (47.6%) males and 741 (52, 4%) females. 60 dogs were identified as infected with LVC, 34 (56.7%) males and 26 (43.3%) females. The overall prevalence identified in this study was 4.25%, with variation between sectors of 1.82% (minimum) in the stratum 01 and more than 10% in those 07 (maximum). Clinical evaluation in 28 of 60 positive dogs indicated that 20 (71.42%) had at least one clinical sign of CVL and 8 (28.57%) showed no signs of disease. All parasites detected belonged to protozoa species Leishmania infantum. Analysis of the spatial distribution of cases of LVC in the city of Brumadinho aided by Kernel density tool points to two main areas for the control strategy/combat of this disease in the municipality. The results of this work will direct the actions of control/anti-vl in the city, contributing to a possible reduction of the expansion of Visceral Leishmaniasis. Keywords: Canine Visceral Leishmaniasis, Prevalence, spatial distribution. iv

6 Sumário 1. Introdução Revisão da literatura As leishmanioses Aspectos Gerais da Leishmaniose Leishmaniose Visceral Humana No cão Urbanização das Leishmanioses Controle e profilaxia da LV Justificativa Objetivos Materiais e métodos Área de estudo Aspectos éticos Delineamento do estudo Estudo dos reservatórios domésticos Cálculo amostral Coleta de dados Coleta de amostras biológicas Diagnóstico parasitológico Caracterização da espécie de LVC Extração de DNA Reação em Cadeia da Polimerase Avaliação dos sinais clínicos Georreferenciamento Densidade Kernel RESULTADOS Prevalência Diagnóstico parasitológico Caracterização da espécie Avaliação Clínica Distribuição espacial da LV v

7 6.5.1 Leishmaniose Visceral Humana Leishmaniose Visceral Canina Densidade de Kernel Discussão Conclusão Anexos Referências vi

8 Lista de figuras Figura 01: Mapa de localização da área de estudo, município de Brumadinho - Minas Gerais...24 Figura 02: PCR-RFLP ITS1, das amostras de cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum. PM = Peso Molecular, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, B10, B11, B13, B14, B15, B16 amostras de DNA proveniente do baço. Lb = Leishmania braziliensis. Li = Leishmania infantum...34 Figura 03: PCR-RFLP ITS1, das amostras de cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum. PM = Peso Molecular, B17, B19, B20, B22, B23, B25, amostras de DNA proveniente do baço. Lb = Leishmania braziliensis. Li = Leishmania infantum. La = Leishmania amazonensis...34 Figura 04: PCR-RFLP ITS1, das amostras de cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum. PM = Peso Molecular, P12, P18, P24, P26, P27, P28 amostras de DNA proveniente de pele de orelha. L21 amostra de DNA proveniente de linfonodo poplíteo. Lb = Leishmania braziliensis. Li = Leishmania infantum. La = Leishmania amazonensis...34 Figura 05. Série histórica de casos de LV no mapa do município de Brumadinho MG. Os pontos em laranja representam os casos humanos no período de 2007 a Figura 06. Distribuição de cães pesquisados durante o estudo realizado entre Abril e Agosto de Os pontos verdes representam os cães não reagentes e os pontos vermelhos os cães positivos para Leishmaniose Visceral Canina...38 Figura 07. Georreferenciamento de cães positivos no município de Brumadinho, MG. Os pontos vermelhos demonstram as amostras positivas para LVC...39 Figura 08. Mapa do município de Brumadinho MG. Sobreposição de cães positivos e densidade de Kernel gerada a partir dos casos positivos e negativos georreferenciados. No mapa os pontos vermelhos representam os cães positivos e as zonas quentes (hotspots) a densidade de Kernel...40 vii

9 Figura 9. Mapa do município de Brumadinho MG. Em destaque a densidade de Kernel demonstrando as zonas quentes hotspots referente aos casos caninos de LV...40 Figura 10. O mapa demonstra a sobreposição de casos caninos, casos humanos e densidade de Kernel. Os pontos vermelhos representam os casos caninos, os laranjas representam os casos humanos (ajustados por localidade de ocorrência) e a zona quente a densidade de Kernel...41 viii

10 Lista de tabelas Tabela 01: Prevalência de Leishmaniose visceral canina no município de Brumadinho MG Tabela 02: Prevalência de LVC no município de Brumadinho-MG, distribuídas por setores e bairros Tabela 03: Número de amostras biológicas coletadas para caracterização de espécie e avaliação de sinais clínicos de acordo com sexo e sintomas. Brumadinho- MG Tabela 04: Número de sinais clínicos apresentados por cães infectados por LVC no município de Brumadinho, MG ix

11 Lista de anexos Anexo 01: Tabela para cálculo amostral segundo a prevalência e população canina...47 Anexo 02: Tabela de números aleatórios para sorteio de quarteirões...48 Anexo 03: Ficha clínica de acompanhamento em cães infectados com Leishmaniose Visceral...49 x

12 Lista de abreviaturas e siglas CCO Campus Centro-Oeste. CCZ Centro de Controle de Zoonoses. CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais. CONCEA Conselho Nacional de Experimentação Animal. DNA (ADN) DeoxyriboNucleic acid (Ácido Desoxisribonucleico). DPP Dual Plath Platform. ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay. GPS Global Positioning System. IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. L. infantum Leishmania infantum. LabDip Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias. LTA Leishmaniose Tegumentar Americana. Lu. longipalpis Lutzomyia longipalpis. LV - Leishmaniose Visceral. LVC Leishmaniose Visceral Canina. MS Ministério da Saúde. OPAS Organização Pan-Americana de Saúde. PCLV Programa de Controle Da Leishmaniose Visceral. PCR Reação em Cadeia da Polimerase. SIG Sistema de Informações Geográficas. SMS Secretaria Municipal de Saúde. SUS - Sistema Único de Saúde. WHO (OMS) World Health Organization (Organização Mundial de Saúde). xi

13 1. Introdução As Leishmanioses são enfermidades zoonóticas, com grande distribuição mundial sendo endêmica em vários países do mundo. Estão entre as seis doenças consideradas prioritárias pela Organização Mundial de Saúde. A estimativa é de que a incidência anual seja de cerca de 2 milhões de casos, destes aproximadamente 1,5 milhões causados por formas tegumentares da doença e 500 mil relacionados a forma visceral (WHO, 2015). A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença com amplo espectro clínico e considerada grave, especialmente nos casos humanos não tratados, podendo apresentar altos índices de letalidade. A LV está presente em 88 países, sendo 22 nas Américas. No continente Americano o Brasil aparece como o responsável pelo maior número de casos. Nas Américas, os agentes causadores da forma visceral, são os protozoários da espécie Leishmania (Leishmania) infantum e a transmissão ao hospedeiro ou ao reservatório vertebrado, ocorre através da picada de dípteros pertencentes à família Psychodidae, subfamília Phlebotomínae, da espécie Lutzomyia longipalpis, conhecidos como flebotomíneos (OPAS, 2015). Descrita inicialmente como uma doença de âmbito rural, a LV vem apresentando há alguns anos uma mudança no perfil epidemiológico. Estudos realizados em grandes cidades como Rio de Janeiro (RJ), Araçatuba (SP), Corumbá (MS), Natal (RN), São Luís (MA), entre outros, demonstram a urbanização da Leishmaniose Visceral. Em Minas Gerais a urbanização já foi demonstrada em cidades como Belo Horizonte, Montes Claros, Governador Valadares e Divinópolis. O cão aparece como um dos responsáveis pela urbanização da LV, uma vez que este animal é considerado o principal reservatório doméstico da LV (MS, 2006). O combate e controle da LV no Brasil é baseado em três medidas: tratamento dos casos humanos, combate ao vetor e identificação e eliminação do reservatório doméstico. Para que o controle da LV seja eficiente é necessário conhecer as características epidemiológicas de cada município (MS, 2006). O Município de Brumadinho situado na região metropolitana de Belo Horizonte, apresentou 13 casos de LV humana nos anos de 2007 a 2013 e é 12

14 considerado como sendo de transmissão esporádica segundo estratificação baseada do Ministério da Saúde. Este estudo tem a finalidade de identificar as características da transmissão de Leishmaniose Visceral no município, enfocando especialmente no reservatório canino, importante elo da cadeia de transmissão da Leishmaniose. As ações de controle e combate à LV no município, realizadas pelo Serviço de Controle de Zoonoses poderão ser direcionadas baseadas nas informações coletadas neste estudo como a prevalência de LVC, espécie circulante de LV e a distribuição espacial destes cães naturalmente infectados por Leishmaniose. 2. Revisão da literatura. 2.1 As leishmanioses. As leishmanioses são doenças infecciosas causadas por parasitos do gênero Leishmania (Ross, 1903) consideradas um grave problema de saúde pública. Os protozoários causadores destas doenças pertencem à família Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastida. Apresentam duas formas evolutivas distintas, as encontradas nos vetores são alongadas, flageladas e móveis, enquanto as formas encontradas no interior dos macrófagos de hospedeiros vertebrados se apresentam esféricas e sem flagelo aparente (Lainson & Shaw, 1987). A transmissão das leishmanioses ocorre através do repasto sanguíneo de fêmeas de dípteros pertencentes à família Psychodidae, subfamília Phlebotomínae, conhecidos como flebotomíneos (Baneth et al., 2008). A ampla distribuição geográfica e alta incidência fazem com que as leishmanioses se tornem uma doença de grande importância, além da possibilidade de assumir formas graves com taxas elevadas de mortalidade em casos não tratados na forma visceral e alta morbidade na sua forma tegumentar (Melo & Gontijo, 2004). 13

15 As diferentes manifestações clínicas causadas pela infecção por Leishmania spp. dependem de interações complexas entre os parasitos e a resposta imune dos hospedeiros. As leishmanioses são reconhecidas pela Organização Mundial de Saúde (OMS, 2015) como sendo divididas em quatro tipos clínicos: a forma visceral, a forma cutânea, a forma mucocutânea e cutânea difusa (WHO, 2015). Estas doenças acometem 98 países em cinco continentes (Alvar et al., 2012), sendo todos eles tropicais ou subtropicais. Dados da OMS indicam que aproximadamente 350 milhões de pessoas estejam expostas ao risco de contrair estas enfermidades. Estima-se que cerca de 12 milhões de pessoas estejam infectadas com alguma forma de leishmaniose no mundo, e que sua incidência anual seja de aproximadamente 2 milhões de casos, destes relacionados à leishmaniose visceral e 1,5 relacionado às formas cutâneas da doença (WHO, 2015). A forma cutânea é a mais disseminada das formas de leishmaniose, foram notificados oficialmente mais de casos por ano, sendo que destes cerca de 70-75% ocorreram em apenas dez países: Afeganistão, Argélia, Colômbia, Brasil, Irã, Síria, Etiópia, Sudão do Norte, Costa Rica e Peru. No continente Americano as formas cutâneas da doença (Leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose difusa), são denominadas como Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e nestes são apresentados cerca de casos/ano. (Alvar et al., 2012; WHO, 2014) No novo mundo, várias espécies do gênero leishmania são responsáveis pela transmissão de LTA, sendo nove do subgênero Viannia: Leishmania (Viannia) braziliensis, L. (V.) colombiensis, L. (V.) guyanensis, L (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) panamensis, L. (V.) peruvina, L. (V.) shawi e L. (V.) lindenbergi e quatro do subgênero Leishmania: Leishmania (Leishmania) amazonensis, L (L.) mexicana, L (L.) pifanoi e L. (L.) venezuelensis. (Lainson, 2010). A forma visceral, considerada a mais grave das formas clínicas, apresenta alta taxa de mortalidade, em especial em casos não tratados, estes parasitos possuem tropismo por células do Sistema Mononuclear Fagocitário (SMF) do baço, fígado, medula óssea e linfonodos. Neste continente, é causada pela espécie Leishmania (L.) infantum (Maurício, 2000) e será o objeto deste estudo. 14

16 2.2 Aspectos Gerais da Leishmaniose Visceral. A Leishmaniose Visceral (LV) é considerada primariamente como uma zoonose, pois ocorre naturalmente entre animais, podendo eventualmente acometer os seres humanos quando este entra em contato com seu ciclo de transmissão. Esta doença figura entre as seis endemias consideradas prioritárias no mundo. A LV pertence ao complexo Donovani, que compreende todas as espécies ditas viscerotrópicas. É considerada a forma mais grave da doença estando presente em 88 países, destes, 66 no velho mundo e 22 no novo mundo acometendo aproximadamente pessoas e causando cerca de mortes todos os anos. (WHO, 2015; Alvar et al., 2012) Nas Américas a LV é autóctone em 12 países com o registro de casos e média anual de casos no período de 2001 a Somente no ano de 2013 foi registrado um total de casos espalhados por oito países e distribuídos em 798 municípios. Em todo o continente sul-americano, o Brasil apresentou o maior número de casos, (96%), seguido por Paraguai 107 casos (3,2%) e Colômbia 13 casos (0,4%). Considerando apenas a população em área de transmissão, a incidência da doença nesta região foi de 2,59 casos por habitantes e no Brasil a incidência foi de 4,35 casos por habitantes (OPAS, 2015). O ciclo biológico da LV é do tipo heteroxênico, pois necessita de dois tipos de hospedeiros, um vertebrado (homem, canídeos, marsupiais) e um hospedeiro invertebrado. Os hospedeiros invertebrados e vetores da doença, são dípteros pertencentes à família Psychodidae, subfamília Phlebotomínae, conhecidos como flebotomíneos (Baneth et al., 2008; Lutz & Neiva, 1912). No Brasil, o Lutozomyia longipalpis é a espécie de flebotomíneos considerada mais envolvida na transmissão da LV (Baneth et al., 2008; Lutz & Neiva, 1912). Embora outras espécies sejam apontadas como potenciais vetores da doença como o Lutzomyia cruzi e Lutzomyia migonei (Santos et al., 1998; Salomon et al., 2010; Carvalho et al., 2010) os dípteros pertencentes à espécie Lu. longipalpis são considerados um importante elo no ciclo de transmissão da LV, isso porque esta espécie reúne fortes evidencias da sua capacidade vetorial, além da grande distribuição geográfica nas Américas (Lainson & Rangel, 2005). 15

17 Essa espécie pode ser encontrada em todo o território nacional, resiste a variadas temperaturas e se adapta facilmente ao ambiente domiciliar podendo ser encontrado também nos abrigos de animais domésticos. Os flebotomíneos são conhecidos popularmente por mosquito-palha, birigui, asa-branca, dentre outros nomes. São insetos pequenos com cerca de 1 a 3 mm, possuem dois pares de asas que lhes permitem deslocar através de saltos, são pilosos e com atividade noturna ou crepuscular. Apresentam em seu ciclo de vida as fases de ovo, larva, pupa e inseto adulto sendo, portanto considerados holometabólicos. (Lainson & Rangel, 2005) Em condições favoráveis a eclosão dos ovos ocorre de 7 a 17 dias após a sua postura e o seu desenvolvimento completo leva em torno de 30 a 100 dias, variando conforme a espécie e as condições do ambiente, nos flebotomíneos da espécie Lutzomya longilpalpis esse desenvolvimento leva de 30 a 45 dias em condições artificiais de laboratório. As larvas se alimentam da matéria orgânica disponível no solo e se desenvolvem em locais úmidos. Os adultos, como já citado, apresentam hábitos noturnos e crepusculares se escondendo durante o dia em locais sombreados como fendas de arvores, abrigo de animais, etc. (Lainson & Rangel, 2005; Killick-kendrich, 1999). Ambos os sexos se alimentam de seiva de plantas, porém apenas as fêmeas são hematófagas. A infecção do invertebrado ocorre quando fêmeas dos flebotomíneos, em busca de sangue, se alimentam de um hospedeiro vertebrado infectado. Durante o repasto sanguíneo formas amastigotas de Leishmania são ingeridas pelo inseto vetor. Segundo Bates (2007) o mecanismo de obtenção de sangue pelos flebotomíneos seria um dos fatores responsáveis pela ingestão desses parasitos. As fêmeas de Lu. longipalpis ao encontrarem um animal vertebrado, fonte de alimento, inserem seu aparelho bucal na pele, como uma serra e começam a agitá-lo produzindo um pequeno ferimento. O dano causado ao tecido, o sangue de capilares periféricos juntamente com células fagocitárias liberadas, permitem a posterior ingestão de formas amastigotas de L. infantum. Depois de ingeridas, as formas amastigotas são estimuladas a se diferenciar devido à mudança de condições entre o até então hospedeiro mamífero e o atual intestino do inseto invertebrado (queda de temperatura e alteração no ph) essas formas amastigotas passam por várias mudanças morfológicas e fisiológicas dando 16

18 origem as formas promastigotas, processo conhecido como metaciclogênese que culmina no aparecimento de promastigotas metacíclicas (que é a fase infectante para o hospedeiro vertebrado), estas migram para o tubo o tubo digestivo anterior do vetor. (Bates, 2007; Secundino et al., 2005; Barata et al., 2005). Após estas mudanças, ao realizar um novo repasto sanguíneo a fêmea estará apta a transmitir os protozoários ao hospedeiro vertebrado. Durante a realização do repasto, a fêmea infectada, inocula as formas promastigotas metacíclicas, que penetram no organismo do hospedeiro vertebrado. Dentro deste hospedeiro os parasitos são internalizados por células fagocitárias, principalmente macrófagos, o flagelo até então aparente, fica interiorizado conferindo ao protozoário um aspecto arredondado ou ovóide e este passa a ser denominado como amastigota. Nestas células, as amastigotas se reproduzem por fissão binária e esta proliferação de parasitos favorece o rompimento da membrana plasmática das células e conseqüentemente a liberação de amastigotas que serão internalizadas por outras células fagocitárias iniciando uma nova fase de multiplicação celular. (Chang, 1983; Baneth et al., 2008) A infecção de um animal não é suficiente para que ele possa ser considerado um reservatório. Um animal infectado, a principio, é um hospedeiro, porém seu papel na manutenção do ciclo de transmissão de uma determinada doença dependerá das peculiaridades da interação parasito-hospedeiro e isto irá determinar a competência da espécie na manutenção ou transmissão do parasito definindo assim seu papel como reservatório (Guerin et al., 2002; Desjeux et al., 2004). No ciclo biológico da Leishmaniose Visceral, animais silvestres como as espécies de canídeos Cerdocyon thous e Dusicyon vetulus e de marsupiais como Proechimys canicollis, Didelphis albiventris e Didelphis marsupialis são consideradas possíveis reservatórios silvestres da doença, portanto contribuem para sua manutenção no ambiente silvestre. Com relação aos roedores, mesmo com a presença do parasito sendo encontrada em alguns destes animais, confirmada através de PCR, a infecção experimental por Lu. longipalpis alimentados em espécies de roedores torna-se fundamental para confirmação dessa hipótese (Lainson & Rangel, 2005). O cão (Canis familiares) é considerado o mais importante reservatório domestico da LV, sendo o principal responsável pela manutenção do ciclo de leishmaniose no âmbito rural e urbano (Lainson & Rangel, 2005). 17

19 Apesar de contrair a doença, o homem aparece apenas como hospedeiro da Leishmania infantum, pois mesmo infectado é incapaz de transmitir a doença aos flebotomíneos. 2.3 Leishmaniose Visceral Humana O período de incubação da LV pode ser bastante variável, tão breve quanto 10 dias ou tão longo quanto 24 meses, apresentando média de 2 a 6 meses (MS, 2006). Stone e colaboradores (1952) demonstraram em seu trabalho um caso onde esse período foi de 34 meses. A infecção por L. infantum é caracterizada por um amplo espectro clínico, variando de infecção assintomática e oligossintomática até o quadro clássico (sintomático) da doença, progressiva e potencialmente fatal em casos não tratados (Pearson & Sousa, 1996) A maioria dos indivíduos infectados não apresenta sintomas da doença, estima-se que apenas 20% dos indivíduos infectados em áreas endêmicas desenvolvam a forma clássica de LV (sintomática). O aparecimento das manifestações clínicas depende da capacidade do parasito em evadir-se dos mecanismos de defesa do hospedeiro mediante uma complexa interação parasitohospedeiro. As condições ambientais, a idade, estado nutricional e resposta imune do indivíduo acometido podem estar relacionados à gravidade destas manifestações clínicas. (Badaró et al., 1986; Caldas et al., 2002). A forma oligossintomática é de difícil diagnóstico devido à sintomatologia inespecífica e apresenta um quadro clínico mais discreto geralmente com curta duração e freqüentemente evolui para cura. A forma sintomática da doença é evidenciada pela presença dos sintomas: febre recorrente, palidez, emagrecimento, hepatoesplenomegalia, anemia, além de outros como leucopenia, plaquetopenia, vômitos, tosse seca. Destes sintomas os achados mais freqüentes são febre, anemia e hepatoesplenomegalia (Brasil, 2011; Oliveira et al., 2010). 18

20 2.4 No cão O cão tem sido apontado como sendo o principal elo da transmissão de Leishmania infantum aos seres humanos, principalmente pelo grande número de cães infectados e o grande parasitismo cutâneo que ocorre nestes animais. Essa importância fica ainda mais evidenciada quando se observa que os casos humanos geralmente ocorrem em locais com grande prevalência canina de LV, além do mais até o presente momento, não há registro de casos humanos de LV sem a presença de cães infectados, o que reforça a hipótese que a infecção por LV em humanos geralmente apresenta uma dependência espacial com a LVC (Teixeira-Neto et al., 2014). No cão, a exemplo dos humanos, a doença é de evolução lenta e insidiosa e o período de incubação também é bastante variável. Os sintomas aparecem, em média, entre três a sete meses após a inoculação do agente, porém estes sintomas poderão levar anos para se manifestar (Brasil, 2011). Durante este período o protozoário (parasitando células fagocitárias) se dissemina por meio do sistema vascular e linfático para diversos órgãos, principalmente o sistema mononuclear fagocitário (Alves et al., 2010; Rigo et al., 2013) Animais infectados com Leishmaniose Visceral Canina (LVC) podem apresentar manifestações clínicas diferentes, isto devido à resposta imunológica do hospedeiro além da interação que ocorre entre ele e o parasito, interferindo direta ou indiretamente nos sinais clínicos. Os cães infectados com LVC normalmente são classificados de acordo com os sinais clínicos em: assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos. Os assintomáticos se caracterizam por cães infectados, mas sem a presença de manifestações clínicas; oligossintomáticos, cães que apresentam adenopatia linfóide, discreta perda de peso e pelo opaco e sintomáticos como aqueles infectados e que apresentam todos os sinais clínicos da doença ou os mais comuns como alopecia, ulceras, hiperqueratose, onicogrifose, emagrecimento, ceratoconjuntivite e paresia dos membros posteriores (Brasil, 2011). Apesar de cães assintomáticos não apresentarem manifestações clínicas da LVC, eles são tão competentes quanto os sintomáticos na infecção de flebotomíneos e, portanto participam da manutenção do ciclo da leishmaniose. Estima-se que entre 19

21 40-60% dos cães soropositivos no Brasil sejam assintomáticos, o que impossibilita o diagnóstico clínico desses animais, aliás, o diagnóstico clínico de LVC, mesmo cães oligossintomátios e sintomáticos deve ser baseado em informações referentes à sintomatologia apresentada pelo animal, aliada a epidemiologia da área e a confirmação de circulação do parasito, pois estes sinais podem estar relacionados a outras enfermidades (Palis et al., 2007; Bevilacqua & Alves, 2004). Assim, para que haja uma confirmação definitiva da infecção por LVC técnicas laboratoriais devem ser empregadas. Para o diagnóstico de LVC existem basicamente três categorias: métodos parasitológicos, sorológicos e moleculares (Gontijo & Melo, 2004; Nogueira & Silva, 2009). O diagnóstico parasitológico se baseia na demonstração microscópica do parasito e ainda é considerado o padrão ouro para diagnóstico da doença. É realizado através da analise citológica de lâminas com esfregaços ou imprints de tecidos. Esse método possibilita a identificação direta do parasito na sua forma amastigota em tecido animal (MS, 2006). Contudo, algumas desvantagens estão relacionadas com o emprego desta técnica, entre elas a baixa carga parasitária apresentada por alguns animais, além da necessidade de pessoal capacitado para a leitura das lâminas (Faria, 2007). Os testes sorológicos normalmente são mais empregados pelos programas de controle devido ao seu menor custo e maior rapidez, seu uso é recomendado em inquéritos amostrais e censitários para avaliar a prevalência de LVC. A utilização de técnicas sorológicas para a detecção de anticorpos circulantes anti-leishmania, constitui um importante instrumento no diagnóstico da LVC. No entanto, testes sorológicos devem ser avaliados com cautela, pois não são 100% sensíveis. Os principais métodos sorológicos utilizados para a identificação de anticorpos circulantes anti-leishmania são, entre outros, a imunofluorescência indireta (RIFI), o ensaio Imunoenzimático (ELISA) e o DPP (Kiral, 2004; MS, 2006). Atualmente o Ministério da Saúde recomenda o uso do teste DPP em inquéritos sorológicos para a triagem de cães e o material biológico dos animais reagentes ao DPP é submetido ao teste ELISA para confirmar a infecção por LVC. Quanto aos testes moleculares, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) apresenta grande especificidade e sensibilidade para a detecção de DNA Leishmania e conseqüente diagnóstico de LVC. A técnica de PCR permite a 20

22 amplificação de seqüências especificas do genoma de Leishmania e pode ser realizada a partir de vários tipos de tecidos, sangue, fluidos biológicos ou amostras histopatológicas (Solano-Gallego et al., 2009). Em relação aos métodos sorológicos e parasitológicos a PCR se apresenta muito mais sensível e especifica, além de possibilitar a identificação da espécie causadora da infecção, o que pode ser útil em áreas onde diferentes espécies de tripanosomatideos co-existem. A importância dessa técnica tem sido demonstrada em vários trabalhos, porém o custo, a disponibilidade de equipamentos sofisticados e reagentes tem sido apontada como algumas de suas limitações (Romero & Boelaert, 2010). 2.5 Urbanização das Leishmanioses Descrita inicialmente como uma doença de âmbito rural, a Leishmaniose Visceral vem apresentando uma mudança no seu perfil epidemiológico desde a década de 80. Diversos estudos apontam que a urbanização da leishmaniose é um fato consolidado inclusive em cidades de médio e grande porte (Moura et al., 2012; Leite & Araújo 2013; Silva et al., 2001). Dados do Ministério da Saúde divulgados em 2006 já demonstravam a urbanização e periurbanização da leishmaniose, destacando os surtos ocorridos nas cidades do Rio de Janeiro (RJ), Belo horizonte (MG), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina (PI), Natal (RN), São Luís (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA), Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e Palmas (TO). Impactos ambientais como secas prolongadas e periódicas, migração desordenada e conseqüente urbanização, além do aumento no número de cães infectados, poderiam justificar esta transição epidemiológica e permitir a adaptação da doença a um novo nicho ecológico (Oliveira et al., 2005; Melo & Gontijo, 2004). 2.6 Controle e profilaxia da LV Segundo a OMS, as leishmanioses estão entre as seis enfermidades consideradas prioritárias em relação ao controle. O Brasil contribui com cerca de 90% dos casos de leishmaniose que ocorrem em todas as Américas e é o único país 21

23 do endêmico do mundo a manter um programa epidemiológico e profilático regular no combate a essa doença (Palatnik-De-Sousa et al., 2001). Segundo a política de saúde atual no nosso país, o controle da leishmaniose é de responsabilidade do Sistema Único de Saúde (SUS) e após a descentralização das endemias as ações do Programa de Controle da Leishmaniose Visceral (PCLV) ficaram a encargo dos estados e municípios. O PCLV é baseado em três medidas, que buscam atingir cada elo da cadeia epidemiológica da doença, são eles: diagnóstico e tratamento dos casos humanos; combate ao vetor através da aplicação de inseticidas; identificação e eliminação dos reservatórios domésticos (cães) infectados (MS, 2006). É importante salientar que estas ações devem ser adotadas de forma integrada. Dentre estes elos, um dos mais importantes a ser eliminado para a redução da doença é o vetor, sendo que atualmente o controle químico é a medida mais objetiva disponível, ainda que insuficiente e complexa. A indicação do uso de inseticidas para o controle vetorial depende da situação epidemiológica de cada localidade. Esta medida é direcionada apenas ao flebotomíneo adulto (alado) tendo como objetivo reduzir o contato entre vetor e hospedeiro susceptível, conseqüentemente reduzir o risco de infecção pela doença. O controle químico é recomendado em áreas com o primeiro registro de caso autóctone de LV humano, em áreas de transmissão moderada e intensa e em áreas com surto de LV. O controle químico, na zona rural, deve ser realizado em todos os domicílios onde ocorreu transmissão e apenas em áreas previamente delimitadas indicadas pela classificação epidemiológica na zona urbana (MS 2006). Quanto às ações relacionadas ao reservatório, o Ministério da Saúde recomenda a prática da eutanásia em todos os cães com sorologia positiva e/ou exames parasitológicos positivos para Leishmania. Esta recomendação se apóia na consideração de que o cão é um dos principais reservatórios domésticos da doença e que a infecção canina, normalmente precede a infecção humana. Por fim, como medida profilática, o manejo ambiental através da modificação do ambiente, promovendo a limpeza urbana e domicílios com a retirada de substratos orgânicos que propiciam o desenvolvimento do ciclo biológico do inseto vetor, se mostra bastante promissor (MS 2006). 22

24 3. Justificativa A Leishmaniose Visceral é uma doença em franca expansão, sendo considerada a forma mais grave entre os tipos desta doença especialmente em casos humanos não tratados, pois pode alcançar altas taxas de mortalidade. Brumadinho já registrou vários casos autóctones de LV humana, além de apresentar grande ocorrência de casos caninos. Além disso, o município recebe um grande número de turistas, pois tem como atrativo o Parque de Inhotin, conhecido internacionalmente, esses visitantes podem estar susceptíveis à infecção por LV no município. Portanto, para que não haja a expansão da doença no município e aumento dos casos humanos, o conhecimento das áreas com maior risco de transmissão de Leishmaniose Visceral Canina através da identificação da prevalência de cães naturalmente infectados, a análise espacial destes casos e a identificação da espécie circulante, é necessária para a tomada de decisões quanto ao controle da doença. 4. Objetivos 4.1 Objetivo geral Estimar a prevalência e distribuição espacial dos casos de Leishmaniose Visceral Canina no município de Brumadinho MG. 4.2 Objetivos específicos Estimar a prevalência da LVC no município de Brumadinho Caracterizar a espécie circulante de LVC Descrever os sinais clínicos apresentados por cães infectados. Identificar através de pontos referenciados a distribuição espacial da LVC. 23

25 5 Materiais e métodos 5.1 Área de estudo O estudo foi realizado no município de Brumadinho - Minas Gerais, que está localizado na mesorregião Metropolitana de Belo Horizonte porção central, microrregião Belo Horizonte (Figura 01). O município se encontra a 749 metros acima do nível do mar com área de Km² e clima subtropical úmido com temperatura média de 21ºC. Segundo dados do IBGE (Censo de 2010), a população do município é de habitantes e a densidade demográfica é de 53,13 hab/km². Destes, (84,3%) são residentes em área urbana e (15,7%) são residentes em área rural. O município de Brumadinho, de acordo com a estratificação do Ministério da Saúde é considerado de transmissão esporádica, quando analisado os dados dos últimos anos em que ocorreram casos de Leishmaniose Visceral Humana. Brumadinho apresentou de 2007 à 2015 um total de 13 casos de LV humana, sendo: 01 caso de LV em 2007; 04 casos em 2008; 02 casos em 2009; 02 casos em 2010; 03 casos em 2011; 01 caso em 2012 (notificado na cidade mas por se tratar de um caso importado, não será considerado neste estudo) e 01 caso em Nos anos de 2014 e 2015, não houve registro de casos confirmados (SMS Brumadinho-MG, 2015) Figura 01: Mapa de localização da área de estudo, município de Brumadinho - Minas Gerais. 24

26 5.2 Aspectos éticos O projeto foi submetido para análise e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Fundação Oswaldo Cruz, sob protocolo P-16/13.4. Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as determinações e convenções da legislação vigente. 5.3 Delineamento do estudo Trata-se de um estudo observacional analítico do tipo transversal para a identificação da prevalência e LVC no município de Brumadinho MG, identificados através de inquérito sorológico amostral realizado no período de 08 de abril a 04 de Agosto de Estudo dos reservatórios domésticos Para a determinação da prevalência e distribuição espacial dos casos de LVC no município de Brumadinho, um inquérito amostral foi realizado durante o ano de 2014, onde alíquotas de sangue periférico foram coletadas da orelha de cães para realização do diagnóstico sorológico, realizada por agentes do Programa de Controle de Leishmaniose Visceral (PCLV) do município. Foram utilizados dois testes para essa confirmação, o teste rápido DPP e o ensaio imunoenzimático (ELISA). O teste DPP foi utilizado como triagem e as amostras dos cães reagentes a este teste, foram submetidas ao teste do ensaio imunoenzimático (ELISA), para confirmação da infecção por LVC conforme orientação do Ministério da Saúde. Para este estudo o município contou com um total de 08 setores, sendo divididos da seguinte maneira: Conceição do Itaguá e Creche, Setor 01; Sol Nascente, São Judas Tadeu, Dom Bosco, Residencial Bela Vista, Setor 02; Grajaú, Progresso, Cohab, Setor 03; Carmo, São Sebastião, Santa Efigênia, Lourdes, Setor 04; Estela Passos, Centro, Jota, Bela Vista, Silva Prado, Setor 05; José Henriques, São Bento, Planalto, Varjão; Setor 06; São Conrado, Santo Antônio, Santa Cruz, Setor 07; Casa Branca, Alberto Flores, Parque da Cachoeira, Piedade do Paraopeba, Córrego do Feijão, Setor 08. Este último estrato foi agrupado de acordo 25

27 com a característica das localidades que se encontram distantes da região central do município. 5.5 Cálculo amostral Para o cálculo do tamanho da amostra de cada setor, foi utilizada a tabela indicada pelo Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral do Ministério da Saúde (Anexo 01). Segundo essa tabela para cada setor a amostra de cães deve ser determinada levando em consideração a prevalência esperada e o número de animais em cada um dos setores (MS, 2006). A prevalência estimada (esperada) foi de 10%, baseada em um estudo piloto realizado pela equipe do PCLV da Secretaria Municipal de Saúde de Brumadinho, levantamento este realizado em um local específico do município. Para indicar a população de cães pesquisada de cada setor foi utilizado o censo canino, realizado no município antes do início do inquérito sorológico amostral. Este censo canino identificou aproximadamente 8000 cães, distribuídos por todas as localidades do município. O sorteio dos quarteirões para coleta de amostras em cada setor foi baseado na utilização de uma tabela de números aleatórios. (Anexo 02). 5.6 Coleta de dados No momento da coleta do sangue periférico para avaliação sorológica dos cães pesquisados foi preenchida uma ficha contendo informações sobre a data da coleta, dados dos proprietários como endereço, localidade, quarteirão e estrato, além disso, os cães pesquisados receberam um número de identificação. Após a coleta realizada em campo, esses dados foram transferidos para um banco de dados criado exclusivamente para esse fim. Esse banco de dados foi alimentado com informações posteriores a coleta, como resultado do teste DPP e ELISA. A data de captura e eutanásia dos cães reagentes aos dois testes também foi inserida em cada um dos casos. 26

28 5.7 Coleta de amostras biológicas Do total de 60 cães identificados como reagentes para LVC, foram extraídas amostras biológicas de 28 (46,7%) animais. Essa coleta de amostras biológicas foi realizada pela equipe do Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias (LabDip) da Universidade Federal de São João Del-Rei (Campus Centro-Oeste) preparada e treinada para esse procedimento. Porém, vários fatores impediram a coleta de amostras de todos os cães infectados e identificados durante o trabalho, dentre esses fatores podemos destacar o deslocamento até a cidade, a política de eutanásia de cães adotada pelo município, que não permite o acondicionamento de animais com LVC nas dependências do Centro de Controle de Zoonoses (a eutanásia é realizada logo após a captura do animal) as mudanças ocorridas na liderança do PCLV do município, neste caso representado pelo médico veterinário, além da eventual morte natural de cães antes da captura dos mesmos. Os cães foram submetidos à eutanásia pelo médico veterinário do município, sendo administrado tiopental (Thionembutal ), derivado dos barbitúricos, para alcançar o estado de inconsciência e após a perda do reflexo corneal foi administrado solução de Cloreto de Potássio (KCL) obedecendo às determinações da legislação vigente, Resolução Normativa nº 13, de 20 de Setembro de 2013, intitulada Diretrizes da Prática de Eutanásia do Conselho Nacional de Experimentação Animal CONCEA. Após confirmação da morte pelo médico veterinário, foi realizada a coleta de amostras biológicas. Foram coletados tecidos como pele da orelha, baço e linfonodo poplíteo, além da coleta de sangue punção de medula óssea. Estas amostras foram utilizadas para a caracterização da espécie circulante através da técnica de PCR e para a montagem de lâminas citológicas para realização de diagnóstico parasitológico. 5.8 Diagnóstico parasitológico O diagnóstico parasitológico é considerado o padrão ouro para confirmação da infecção, pois permite a visualização direta de formas amastigotas do parasito. Neste estudo o diagnostico sorológico foi realizado através da leitura de lâminas 27

29 citológicas confeccionadas pela técnica chamada de imprint, ou citologia de decalque. Essa técnica consiste na aplicação do material coletado em uma lâmina limpa, para tal é necessário retirar o excesso de sangue da amostra utilizando papel filtro e depois pressionar o material sobre a área da lâmina (por aposição), após esta etapa as lâminas foram coradas através de um conjunto para coloração rápida (Panótico Rápido). Este conjunto é composto por um fixador e duas soluções corantes. As amostras são submetidas a imersões de 5 segundos em cada um destes compostos e ao final da última a lâmina se encontra pronta para a leitura. Para cada um dos 28 animais, foram confeccionadas três lâminas dos tecidos: baço, pele (de orelha) e linfonodo poplíteo. 5.9 Caracterização da espécie de LVC Extração de DNA A extração de DNA das amostras biológicas coletadas foi realizada segundo o Protocolo de Extração de DNA pelo Fenol-Clorofórmio do LabDIP da Universidade Federal de São João Del-Rei (UFSJ), Campus Centro Oeste. Foi retirado 50mg dos tecidos (baço, pele e linfonodo) de cada uma das 28 amostras e colocado em uma placa de petri, a amostra foi cortada em fragmentos pequenos com auxilio de uma lâmina de bisturi e transferida para um tubo de 1,5 ml estéril, 500µl de solução de lise foi adicionada ao tubo e neste a mesma foi macerada. Após esta etapa o tubo foi agitado e a proteinase K adicionada, a amostra foi novamente agitada e incubada em banho-maria a 55ºC por uma noite. Após a incubação o tubo foi agitado a fim de homogeneizar o seu conteúdo (lisado) e adicionado a ele um (01) volume de Fenol-Clorofórmio. A amostra foi agitada lentamente por inversão por dez minutos e centrifugada a rpm s (Rotações por Minuto) por cinco minutos. Ao final desta etapa, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo e as últimas etapas repetidas, a partir do acréscimo de um (01) volume de Fenol-Clorofórmio. Para a etapa final da extração do DNA um (01) volume de clorofórmio e álcool isoamílico foi adicionado à amostra e o tubo agitado de forma lenta por inversão por 28

30 dez minutos. Por fim, o tubo foi centrifugado rpm s e o sobrenadante transferido para um novo tubo. O isolamento do DNA no tubo foi feito por precipitação. Para tal, 100µl de Acetato de sódio foi adicionado à amostra, juntamente com um (01) volume de isopropanol (95-100%) gelado e incubado a -80ºC por vinte minutos. Após esta etapa, o tubo foi centrifugado a rpm s e o sobrenadante descartado, 500µl de etanol gelado foi adicionado ao tubo e o mesmo invertido de forma lenta por dois minutos e centrifugado a rpm s por quinze minutos. Novamente, o sobrenadante foi descartado e adicionado ao tubo Água MiliQ para a hidratação do DNA. Por fim, a amostra foi incubada a 37ºC por trinta minutos e depois acondicionada no freezer até o seu uso Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) A Reação em Cadeia da Polimerase do alvo ITS1 foi utilizada nas 28 amostras, para a caracterização da espécie circulante de Leishmania. Para que ocorresse a amplificação do fragmento foram adicionadas as amostras uma solução tampão 1x (200mM Tris-HCl ph8,4, 500 mm KCL), 1,5 mm de MgCl 2, 200µM de mix de dntp s, 0,5 pmol de Primer F (LITS1R), 0,5 pmol de Primer R (L5.8S), 1,25 U de Taq Polimerase e 2µl de DNA template para um volume final de 25µl. Após os reagentes terem sido adicionados as amostras, estas foram acondicionadas no termociclador automático para a amplificação do DNA alvo, alternando em 32 ciclos de 95ºC por dois minutos, 95ºC por vinte segundos, 53ºC por trinta segundos, 72ºC por um (01) minuto, 72ºC por seis minutos Avaliação dos sinais clínicos Para a avaliação dos sinais apresentados por cães sintomáticos infectados por LVC, dos 60 cães positivos, 28 cães (dos quais foram coletas as amostras biológicas para a determinação da espécie e demonstração do parasito), passaram por uma avaliação clínica conduzida pelo veterinário responsável do Serviço de Controle de Zoonoses do município de Brumadinho - MG. Esta avaliação seguiu uma ficha especialmente preparada para este estudo (Anexo 03). O veterinário 29

31 responsável avaliou nove sinais clínicos descritos na literatura e que poderiam ser apresentados por cães infectados por LVC, além de avaliar a presença de ectoparasitas, sexo, raça e estado nutricional geral. Cada um destes cães recebeu uma identificação especifica na ficha Clinica de Acompanhamento. Sinais clínicos como hepatoesplenomegalia e linfonodos aumentados, foram avaliados durante a necropsia e anotados em um espaço reservado na ficha. Neste presente estudo, classificamos os cães como sendo assintomáticos, ou seja, aqueles que não apresentaram sinais clínicos da LVC e sintomáticos, aqueles que apresentaram qualquer um dos sintomas da LVC Georreferenciamento Os cães pesquisados durante a execução do inquérito e todos os casos de LV humana do município de Brumadinho, foram georreferenciados utilizando o sistema de posicionamento global GARMIM GPSMAP 76 (Olathe, KS, USA) e as coordenadas geográficas ajustadas para a região próxima de onde as mesmas ocorreram com a ajuda do programa Google Earth (Mountain View, CA, USA). Um banco de dados foi utilizado para armazenar e organizar estas informações. Após o georreferenciamento, estes dados foram utilizados no programa ArcGIS versão 10.0, para a confecção dos mapas e análise espacial da ocorrência da doença Densidade Kernel O mapeamento digital vem apresentando diversas vantagens quando comparado aos métodos tradicionais, entre elas a possibilidade da geração de mapas de densidade, conhecidos como Mapas de Kernel ou Densidade de Kernel. O termo kernel em inglês significa núcleo e nesse contexto esse termo faz referência a um método estatístico de estimação de densidades. O núcleo, valor central é a referência para cada uma das observações que serão indicadas. No mapa é plotado a intensidade pontual de determinado fenômeno em toda a região do estudo, portanto a densidade de Kernel é uma boa alternativa para análise geográfica do comportamento de padrões, proporcionando uma visão geral da 30

32 intensidade do processo nas regiões do mapa. Este produto cartográfico é uma poderosa ferramenta de análise espacial (Fernanda et al., 2014). Neste estudo o programa ArcGIS foi utilizado para a geração dos mapas e densidade de Kernel. 6 Resultados 6.1 Prevalência. Foram avaliados 1413 cães, 672 (47,6%) machos e 741 (52,4%) fêmeas. Deste total 60 (4,2%) cães foram identificados como sororeagentes por LVC, sendo 34 (56,7%) machos e 26 (43,3%) fêmeas. A prevalência no inquérito sorológico foi de 4,25%, conforme demonstrado na tabela abaixo (TABELA 01). A diferença entre gêneros não foi estatisticamente significativa. Tabela 01 Prevalência de Leishmaniose visceral canina no município de Brumadinho MG N % Cães + % Prevalência P* Sexo Macho 672 (47,6%) 34 (56,7%) 2,4% 0,18 Fêmea 741 (52,4%) 26 (43,3%) 1,8% Total % % 4,2% Fonte: Serviço de controle de zoonoses do município de Brumadinho MG. *Nível de significância de 0,05 (x²). O inquérito sorológico foi realizado em todo o município de Brumadinho e a distribuição das prevalências dos bairros e setores podem ser observadas na tabela a seguir (TABELA 02). 31

33 Tabela 02 Prevalência de LVC no município de Brumadinho-MG, distribuídas por setores/bairros Localidade Cães examinados Cães positivos % (total de positivos) Prevalência SETOR ,3 1,82 Creche Conceição do Itaguá ,3 3,33 SETOR ,0 3,13 Sol Nascente Dom Bosco R.B.V SETOR ,0 3,59 Grajaú ,57 Progresso ,3 3,84 COHAB ,7 3,22 SETOR ,3 4,63 Carmo São Sebastião ,37 Santa Efigênia ,3 5 Lourdes SETOR ,0 3,26 Estela Passos Centro Jota Bela Vista ,3 8,69 Silva Prado ,7 4,54 SETOR ,6 6,67 José Henriques ,3 8,69 São Bento Planalto ,71 Varjão ,3 4,65 SETOR ,6 10,10 São Conrado ,3 11,94 Santo Antônio ,7 5,88 Santa Cruz ,7 6,66 SETOR ,0 3,77 Casa Branca ,7 3,98 Alberto Flores ,3 4,25 Parque da Cachoeira ,3 3,12 Piedade da Paraopeba ,8 5,26 Córrego do Feijão ,3 3,5 Monte Cristo ,7 2,2 TOTAL

34 6.2 Diagnóstico parasitológico Para cada um dos 28 animais, foram confeccionadas três lâminas dos tecidos: baço, pele (de orelha) e linfonodo poplíteo e em pelo uma destas lâminas de cada animal pudemos visualizar as formas amastigotas de Leishmania, confirmando assim a infecção do animal. 6.3 Caracterização da espécie Para tentar identificar a espécie de Leishmania circulante em Brumadinho, as amostras biológicas coletadas dos 28 cães foram submetidas à amplificação do material genético e posterior visualização em gel (2,5%). Na maioria das amostras o material genético amplificado foi extraído do baço dos cães, com exceção da amostra L21 proveniente do linfonodo poplíteo e as amostras P12, P18, P24, P26, P27 e P28 provenientes da pele de orelha, nestas últimas não foi possível a amplificação a do material genético a partir da amostra do baço, por isso, a necessidade da amplificação através dos outros tecidos. Todas as amostras demonstraram padrão semelhante à amostra Leishmania (L.) infantum (Li) utilizada como referência, conforme demonstrado nas figuras abaixo. (FIGURAS 02, 03 e 04) 33

35 Figura 02: PCR-RFLP ITS1, das amostras de cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum. PM = Peso Molecular, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, B10, B11, B13, B14, B15, B16 amostras de DNA proveniente do baço. Lb = Leishmania braziliensis. Li = Leishmania infantum. Figura 03: PCR-RFLP ITS1, das amostras de cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum. PM = Peso Molecular, B17, B19, B20, B22, B23, B25, amostras de DNA proveniente do baço. Lb = Leishmania braziliensis. Li = Leishmania infantum. La = Leishmania amazonensis Figura 04: PCR-RFLP ITS1, das amostras de cães naturalmente infectados por Leishmania (L.) infantum. PM = Peso Molecular, P12, P18, P24, P26, P27, P28 amostras de DNA proveniente de pele de orelha. L21 amostra de DNA proveniente de linfonodo poplíteo. Lb = Leishmania braziliensis. Li = Leishmania infantum. La = Leishmania amazonensis 34

36 6.4 Avaliação Clínica A avaliação clínica realizada antes da coleta das amostras biológicas indicou que dos 28 cães, 20 (71,42%) apresentaram pelo menos um sinal clínico da LVC e 8 (28,57%) não apresentavam qualquer sinal da doença. Destes, 15 (53,6%) machos e 5 (17,8%) fêmeas apresentaram algum sinal da doença.(tabela 03) Tabela 03. Número de amostras biológicas coletadas para caracterização de espécie e avaliação de sinais clínicos de acordo com sexo e sintomas. Brumadinho-MG Característica Clínica Sexo Sintomático % Assintomático % TOTAL % P* Machos 15 53,6 % 4 14,3 % 19 67,9 % 0,40 Fêmeas 5 17,8 % 4 14,3 % 9 32,1 % TOTAL 20 71,4 % 8 28,6 % % Distribuição entre animais do mesmo sexo Machos 15 78,9 % 4 21,1 % % 0,40 Fêmeas 5 55,6 % 4 44,4 % % Fonte: LabDip. Universidade Federal de São João del-rei. CCO. *Nível de significância de 0,05. Os principais sintomas apresentados nos cães sintomáticos foram: linfonodo ativado, descamação, onicogrifose e hiperceratose. (TABELA 04) 35

37 Tabela 04. Número de sinais clínicos apresentados por cães infectados por LVC no município de Brumadinho, MG Sinal Clínico N (Sintoma) Cães examinados % (Por sintoma) Descamação 12 42,9% Alopecia 7 25% Secreção ocular 2 7,1% Opacidade córnea 6 21,4% Conjuntivite 5 17,8% P. Patas 1 3,6% Onicogrifose 11 39,3% Mucosa pálida 6 21,4% Hiperceratose 11 39,3% Linfonodo ativado 14 50% 6.5 Distribuição espacial da LV Leishmaniose Visceral Humana Os casos humanos notificados e confirmados do município de Brumadinho foram georreferenciados e identificados no mapa (FIGURA 05). Os pontos no mapa foram ajustados para que representem apenas a localidade (bairro) onde ocorreram não sendo, portanto, o local exato de sua ocorrência. Esta medida foi tomada para evitar qualquer identificação e/ou constrangimento dos afetos por LV humana. O mapa abaixo demonstra os casos de LV humana no período de 2007 a

38 Figura 05. Série histórica de casos de LV no mapa do município de Brumadinho MG. Os pontos em laranja representam os casos humanos no período de 2007 a

39 6.5.2 Leishmaniose Visceral Canina Todos os cães pesquisados durante o estudo foram georreferenciados e receberam um ponto no mapa (FIGURA 06). Figura 06. Distribuição de cães pesquisados durante o estudo realizado entre Abril e Agosto de Os pontos verdes representam os cães não reagentes e os pontos vermelhos os cães positivos para Leishmaniose Visceral Canina. Os cães reagentes aos testes DPP e ELISA, considerados positivos, foram georreferenciados e plotados no mapa (FIGURA 07). Durante o estudo foram identificados 60 cães sororeagentes para Leishmaniose Visceral conforme demonstrado na figura abaixo. 38

40 Figura 07. Georreferenciamento de cães positivos no município de Brumadinho, MG. Os pontos vermelhos demonstram as amostras positivas para LVC Densidade de Kernel A densidade de Kernel realizada com dados deste estudo demonstrou que a LVC está concentrada principalmente em duas regiões do município de Brumadinho, a região central e bairros que a circundam e a região de Casa Branca, onde se encontram alguns dos condomínios fechados da cidade. Estas zonas quentes indicam que essas regiões citadas podem ser prioritárias para a estratégia de combate e controle da LV no município. 39

41 Figura 08. Mapa do município de Brumadinho MG. Sobreposição de cães positivos e densidade de Kernel gerada a partir dos casos positivos e negativos georreferenciados. No mapa os pontos vermelhos representam os cães positivos e as zonas quentes (hotspots) a densidade de Kernel. Figura 09. Mapa do município de Brumadinho MG. Em destaque a densidade de Kernel demonstrando as zonas quentes hotspots referente aos casos caninos de LV. 40

42 Figura 10. O mapa demonstra a sobreposição de casos caninos, casos humanos e densidade de Kernel. Os pontos vermelhos representam os casos caninos, os laranjas representam os casos humanos (ajustados por localidade de ocorrência) e a zona quente a densidade de Kernel. 7 Discussão No nosso estudo realizado em Brumadinho, identificamos cães infectados pela LVC e sua distribuição espacial no município através do inquérito sorológico. Nos cães sororeagentes, identificamos a espécie causadora da infecção e descrevemos os principais sinais clínicos. A prevalência global apresentada em Brumadinho foi de 4,25%. Muitos trabalhos realizados no Brasil tem se dedicado ao levantamento de dados epidemiológicos sobre a leishmaniose, em especial aos dados referentes à soroprevalência dos cães infectados por LVC. Isso se deve ao fato de o cão ser considerado o principal reservatório doméstico da doença, representando um elo fundamental na cadeia de transmissão da doença (Moreno, 2002). 41

43 Dentre estes estudos podemos citar no estado de Minas Gerais os trabalhos desenvolvidos por Silva et al., (2001) em Belo Horizonte que identificou a prevalência de 3,6%, Teixeira-Neto et al.,. (2014) em estudo realizado na cidade de Divinópolis, descreveu uma prevalência de 4,63%, na cidade de Montes Claros a prevalência foi de 4,9% segundo Monteiro et., al; (2005). O trabalho de Borges et al.,. (2014) demonstrou uma prevalência de 10,6% no município de Juatuba MG e em Governador Valadares, Barata (2013) apontou uma prevalência acumulada de 30,2% em seu estudo realizado ao longo dos anos de 2008 a Em outras regiões do país estudos como o de Almeida (2012) e Oliveira (2015) identificaram as prevalências de 22,1% e 15,5%, respectivamente, nas cidades de Cuiabá MT e no distrito de Jacaré em Niterói RJ. Na região Nordeste Barbosa et al., (2015) identificou uma prevalência de 10,30% em Natal RN. Em Campina Grande PB, 4,3% dos cães pesquisados eram sororeagentes (Brito et al., 2016), enquanto Fernandes et al., (2016). A prevalência de LVC no município de Brumadinho identificada no nosso estudo se apresenta muito próximo da maioria dos trabalhos realizados em diversas regiões do estado e do país e apresentados acima, porém, ele se distancia de valores encontrados por alguns outros autores. As diferenças nos valores encontrados entre os estudos podem estar relacionadas às características de cada município, uma vez que existem diferentes fatores de risco relacionados à transmissão da LVC que podem variar de uma região para outra. Os principias fatores são a degradação do ambiente, os fluxos migratórios, a ocupação desordenada, o saneamento precário, as características socioeconômicas de cada região, e a interrupção das ações de controle da LV (Missawa; Borba, 2009; Gontijo & Melo, 2004; MS, 2006) Além disso, as características individuais dos cães pesquisados devem ser levadas em consideração. Desde seu estilo de vida que pode favorecer a exposição a vetores (Santos, 2010), até uma possível via alternativa de transmissão, como proposto por Paz (2013), sugerindo a participação de ectoparasitas como vetores mecânicos de LVC. Entretanto essas características individuais não são, até o momento, totalmente claras em relação ao impacto na epidemiologia da doença. A disparidade encontrada entre os estudos pode ainda, ser resultado da inexistência de um padrão para o levantamento dos dados em diferentes 42

44 localidades, diferenças nas áreas pesquisadas que muitas vezes não representam todo o município, nos métodos de diagnóstico utilizados e na metodologia empregada na seleção das amostras, por exemplo, em áreas previamente identificadas como de maior transmissão de LV e com casos de LV humana, representando, portanto um viés. As amostras coletadas dos 28 cães (dentre os positivos) foram submetidas à amplificação do material genético pela técnica de PCR e posterior avaliação em gel de agarose 2%. Todas as amostras, independentemente do local de onde o cão era domiciliado, apresentaram um padrão semelhante à amostra de referência utilizada de Leishmania infantum, isto sugere que a espécie responsável pela infecção de cães em Brumadinho é de fato a L. infantum a exemplo do que é amplamente descrito na literatura (Zuben et al., 2013; Santis et al., 2011; Silva et al., 2001; Teixeira-Neto et al., 2014). Os sinais clínicos mais freqüentes encontrados na população canina sintomática avaliada neste estudo foram: linfonodo ativado, descamação, hiperceratose, onicogrifose, alopecia, mucosa pálida e opacidade córnea. Estes sinais são semelhantes com o que foi encontrado em outros estudos. Oliveira et al., (2015). No trabalho realizado por Gonçalves (2010) as manifestações mais freqüentes foram descamação, alopecia caquexia, onicogrifose, mucosa hipocoradas (pálidas). Dantas-Torres et al., (2006) encontrou no município de Paulista os sinais dermatite, alopecia, úlceras cutâneas, conjuntivite e onicogrifose. Em área urbana de Cuiabá Almeida et al., (2010) relatou a alopecia, descamação, onicogrifose e conjuntivite como sendo as manifestações clinicas mais comuns, Barros (2011) identificou em cães infectados no Distrito Federal sinais como linfonodos ativados, alopecia e mucosas pálidas como mais freqüentes e Castro- Junior et al., (2014) descreveu em seu trabalho a onicogrifose como sinal clínico mais prevalente. Assim como em Brumadinho, as manifestações cutâneas (sinais dermatológicos) estiveram presentes na maioria dos animais avaliados nos mais diversos trabalhos, estando entre os sinais mais comuns (Penaforte, 2013; Oliveira, 2015; Castro-junior, 2014; Barros, 2011). A presença deste grande número de sinais clínicos, que se manifestam em freqüências diferentes, reforça a idéia que os testes 43

45 laboratoriais se tornam indispensáveis para a determinação da infecção de cães por LV uma vez que, não existe sinal patognomônico desta doença em cães. Atualmente, diversos trabalhos sobre as leishmanioses têm incorporado ferramentas que contribuem para a análise da identificação, da distribuição e da posterior tomada de decisões referentes ao controle e/ou combate da LV. Dentre essas ferramentas está a utilização de diversas tecnologias que permitem o mapeamento dos casos utilizando um dos tipos de SIG (Sistema de Informações Geográficas), como exemplo o GPS. Muitos autores incluíram em seus trabalhos essas ferramentas que permitem a analise espacial da distribuição da LV, seja canina ou humana (Maia et al., 2014; Matsumoto, 2014; Borges et al., 2014). A análise da distribuição espacial dos casos de LVC na cidade de Brumadinho, auxiliada pela ferramenta densidade de Kernel aponta duas de maior transmissão da LVC no município. A primeira área é composta por setores na área urbanizada da cidade a exemplo do que foi anteriormente demonstrado em outros estudos (Silva, 2001; Monteiro, 2005; Teixeira-Neto, 2014; Brito et al.; 2016). A segunda área de maior transmissão de LVC é a localidade Casa Branca com o maior número de ocorrências de infecção canina no estudo. É importante ressaltar que essas áreas apontadas no mapa, correspondem ao maior número de cães positivos. Quando observadas as prevalências encontradas nos setores, estas se mostram com valores muito próximos com exceção do setor 07 que apresenta uma maior prevalência de 10,1%. Isso demonstra que todos os setores merecem atenção no planejamento das estratégias de controle da LVC no município de Brumadinho. Apesar de este estudo apontar as localidades onde a transmissão de LVC ocorreu com maior intensidade, as informações colhidas não indicam os principais fatores que levam esses cães a contrair os protozoários. Muitos fatores contribuem para que uma área seja mais propensa a transmissão de LV que outra entre estes fatores devem ser destacados as condições ambientais da localidade, das residências, presença de outros animais no intra ou peridomicilio e ainda a presença de animais silvestres que podem ser reservatórios da doença (Oliveira et al., 2005; Melo & Gontijo, 2004). Portanto faz-se necessário um estudo complementar a estes com base nas observações obtidas neste trabalho. 44

46 As informações colhidas na realização do trabalho como a prevalência, a identificação da espécie circulante e os pontos indicados nos mapas tornam-se fundamentais para o direcionamento da estratégia de combate a LVC no município. A partir destas informações, as ações de controle como identificação e eutanásia de cães positivos, bem como a aplicação de inseticidas podem ser direcionadas para estes locais. Isso poderá contribuir com o controle da doença e conseqüentemente a redução do número de infecções por LV humana. 45

47 8 Conclusão A prevalência global identificada em Brumadinho foi de 4,25%. Entre os setores os valores se apresentaram próximos. Em todas as amostras submetidas à técnica de PCR, a espécie identificada foi a Leishmania infantum, o que sugere que esta é a espécie circulante no município. Os cães apresentaram como principais sintomas clínicos alterações dermatológicas, a exemplo do que é amplamente descrito na literatura. A distribuição espacial aliada à ferramenta de Kernel aponta duas áreas com maior número de casos de infecção por LVC. A primeira área no perímetro urbano da cidade e outra em uma área constituída principalmente por condomínios. Em conclusão, nossos resultados permitiram uma melhor compreensão da dinâmica de transmissão da leishmaniose visceral canina no município de Brumadinho. Apesar das limitações impostas por um estudo transversal, foi possível a identificação das áreas que podem ser consideradas de maior relevância na transmissão da leishmaniose. As ações de combate e controle da LVC no município podem ser direcionadas com base nas informações obtidas através deste estudo a fim de tentar diminuir o risco de infecção humana. Por fim, para que os todos os fatores envolvidos no risco de infecção por LV tanto canina quanto humana no município, sejam conhecidos, faz-se necessário a realização de outros estudos. 46

48 9 Anexos Anexo 01 Tabela para cálculo amostral segundo a prevalência e população canina. 47

49 Anexo 02 Tabela de números aleatórios para sorteio de quarteirões. 48