ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DESINFETANTES UTILIZADOS NA SANITIZAÇÃO DE ALFACE

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1 Nuria Fontana ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DESINFETANTES UTILIZADOS NA SANITIZAÇÃO DE ALFACE Santa Maria, RS 2006

2 1 Nuria Fontana ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DESINFETANTES UTILIZADOS NA SANITIZAÇÃO DE ALFACE Trabalho Final de Graduação apresentado ao curso de Nutrição - Área de Ciências da Saúde, do Centro Universitário Franciscano, como requisito parcial para obtenção do grau de Nutricionista Bacharel em Nutrição. Orientadora: Viviani Ruffo de Oliveira Co-orientador: Roberto Christ Vianna dos Santos Santa Maria, RS 2006

3 2 Nuria Fontana ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DESINFETANTES UTILIZADOS NA SANITIZAÇÃO DE ALFACE Trabalho Final de Graduação apresentado ao Curso de Nutrição Área de Ciências da Saúde, do Centro Universitário Franciscano, como requisito parcial para obtenção do grau de Nutricionista Bacharel em Nutrição. Viviani Ruffo de Oliveira Orientadora (Unifra) Roberto Christ Vianna dos Santos - Co-orientador (Unifra) Claudia Severo da Rosa (Unifra) Aprovado em de de.

4 3 RESUMO Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de diferentes desinfetantes na sanitização de alface, utilizando diferentes concentrações de vinagres de maçã, de álcool, de vinho tinto, vinho branco e hipoclorito. As amostras de alfaces foram obtidas em três estabelecimentos comerciais da cidade de Santa Maria - RS. Foram utilizadas duas técnicas, a técnica 1 para teste presuntivo para avaliação de coliformes totais e teste confirmatório de coliformes totais e fecais para determinação do NMP/g utilizando a alface não higienizada e higienizada. Na técnica 2 foi feito uma suspensão de bactérias, preparação das soluções de vinagres e hipoclorito em diferentes concentrações e estas soluções ficaram em repouso durante 15 minutos, para verificar a eficácia dos agentes sanitizantes. Nas amostras sem tratamento (não higienizadas) a determinação do NMP/g de coliformes totais e fecais, mostrou que todas as amostras encontravam-se acima do permitido pela legislação. Já nas amostras que foram higienizadas, os coliformes fecais encontravam-se dentro do permitido pela legislação e para coliformes totais, como não há uma padronização pela legislação para alface se observou que com a utilização da água reduziu de forma mínima a contaminação da amostra. Demonstrou-se que o vinagre que melhor atuou na inibição do crescimento de coliformes fecais, foi o vinagre de maçã, com utilização da segunda concentração, 125ml, assim como o hipoclorito também se mostrou eficaz na segunda concentração, 4ml, por um tempo de 15 minutos. Palavras-chave: Alface. Sanitizantes. Vinagre. Hipoclorito. ABSTRACT The objective of this work was to evaluate the bactericidal agent of different disinfectants in the sanitization of lettuce. It was used different concentrations of alcohol, apple vinegars, white and red wine vinegar and hipochlorite. The samples of lettuces were gotten from three commercial establishments of the city of Santa Maria - RS. Two techniques, were used, technique 1 - presumptive test for evaluation of total coliformes had been used and confirmatory test for total and fecal coliforms to of the NMP/g using the cleaned and not cleaned lettuce. In technique 2 it was made a suspension of bacteria, preparation of the solutions of vinegars and hipochlorite in different concentrations and these solutions had been in rest during 15 minutes, to verify the effectiveness of the sanitizants agents. In the samples without treatment (not cleaned) the determination of the NMP/g of total and fecal coliforms, showed that all the samples were above the allowed in legislation. In the samples that were cleaned, the fecal coliforms were according to the allowed in legislation and total coliforms, as it does not have a legislation standardization for lettuce it was observed that with the use of the water it reduced the minimum form the contamination of the sample. It was demonstrated that the best vinegar for fecal coliforms, was the apple one, with the use of the second concentration, 125ml, the hipochlorite also revealed efficiency in the second concentration (4ml), for a time of 15 minutes. Keywords : Lettuce. Sanitizants. Vinegar. Hipochlorite.

5 4 AGRADECIMENTOS A minha mãe Leonir, que me apoiou em todos os momentos. Ao meu noivo Cezinha, que sempre esteve ao meu lado. A Viviani Ruffo de Oliveira, que nas horas difíceis me auxiliou. A Roberto Christ Vianna dos Santos e Cláudia Severo da Rosa, que ajudaram neste estudo. Aos alunos do curso de farmácia Isabel Roggia e Éder Saucedo, que ajudaram a superar determinados obstáculos, tornando possível a realização deste trabalho. Minha eterna gratidão.

6 5 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO A ALFACE SANITIZAÇÃO AGENTES SANITIZANTES MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS MATERIAL E MÉTODOS AMOSTRA DE ALFACE ANÁLISE MICROBIOLÓGICA Técnica de número mais provável para coliformes totais Técnica do número mais provável para coliformes fecais ANÁLISES DAS CONDIÇÕES SENSORIAIS DA ALFACE RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES...22 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...23

7 6 LISTA DE TABELAS TABELA 1. Coliformes totais e fecais (NMP/g) em amostras de 3 estabelecimentos comerciais analisados sem tratamento (não higienizada) Santa Maria, RS, TABELA 2. Coliformes totais e fecais (NMP/g) em amostras de 3 estabelecimentos comerciais analisados com tratamento (higienizadas) Santa Maria, RS, TABELA 3. Presença ou ausência de coliformes fecais nos diferentes tipos de vinagres e suas concentrações com exposição por 15 minutos Santa Maria, RS, TABELA 4. Presença ou ausência de coliformes fecais com uso de hipoclorito e suas concentrações com exposição por 15 minutos Santa Maria, RS,

8 7 1 INTRODUÇÃO Embora um grande número de publicações demonstre que o uso de desinfetantes nos alimentos age de forma a completar um programa de sanitização, os agentes como vinagres, hipoclorito, ácido peracético, entre outros, freqüentemente são utilizados por serem considerados eficazes na sanitização de hortaliças e frutas. Existe o consenso, entre indústria de alimentos, Unidades de Alimentação e Nutrição (UANs) e donas de casa de que a causa mais comum de uso seja o baixo custo, a baixa toxicidade e a eliminação de forma quase completa de microrganismos patogênicos. Os sanitizantes mais utilizados são os compostos clorados como o hipoclorito (água sanitária), por serem considerados mais baratos e eficazes, todavia pode ser utilizado outro produto desinfetante como o vinagre, mas um dos preconceitos mais comuns ao uso do vinagre é o de ser apenas, um condimento, no entanto, este pode ser utilizado como agente sanitizante. Há muito tempo se vem observando que os vegetais, em especial a alface, são considerados veículos de microrganismos patogênicos, visto que a cada dia, está sendo relacionado a surtos de toxinfecção alimentar (TIAs) por Salmonela, Shigella, Listeria, Escherichia coli, coliformes totais e fecais, além de protozoários e helmintos. Isto é o que desafia buscar responder a questão central da pesquisa como, por exemplo, sobre a importância da escolha do uso dos diferentes tipos de sanitizantes para eliminar de forma completa microrganismos patogênicos. A escolha do tema de estudo parece ser de fundamental importância para as UANs e donas-de-casa, para a eliminação do maior número possível de microrganismos patogênicos, que vem se agravando, buscando meios de reduzir ou minimizar os casos de TIAs através do sanitizante mais eficiente. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de desinfetantes utilizados na sanitização de alface. Foi verificado o tempo necessário e a quantidade de produto para melhor ação do sanitizante, analisando a quantidade de Coliformes Totais e Fecais, através da técnica do Número Mais Provável (NMP) (máximo) antes do tratamento com sanitizante e após tratamento com sanitizante.

9 8 2 REFERENCIAL TEÓRICO Ultimamente tem se observado uma mudança na alimentação da população no que se refere ao aumento do consumo de hortaliças in natura, pois estes alimentos fornecem inúmeros benefícios ao organismo como, por exemplo, o desenvolvimento e regulação orgânica do corpo, devido seu elevado teor de vitaminas e minerais (OLIVEIRA et al., 2006). Cada vez mais a população está consciente da relação entre dieta equilibrada e prevenção de doenças, procurando então por alimentos frescos e saudáveis, com boa qualidade e aparência e de baixa energia (MAISTRO, 2001; RIBEIRO et al., 2005). Vale ressaltar que, os alimentos consumidos in natura, são considerados mais saudáveis e saborosos que os produtos industrializados, como a alface, que dentre as hortaliças, é a mais consumida no Brasil (MAISTRO, 2001). O consumo de hortaliças é fundamental em qualquer cardápio nutricionalmente adequado, devido ao seu teor de vitaminas, minerais, fibras, aporte calórico baixo e por aumentar o resíduo alimentar no trato gastrintestinal (BALIONI et al., 2003; NASCIMENTO et al., 2005). Frutas e hortaliças têm sido veiculadas à contaminação por bactérias de interesse para a Saúde Pública (BERBARI; PASCHOALINO; SILVEIRA, 2001; LAGAGGIO et al., 2002; NASCIMENTO; SILVA; CATANOZI, 2003), podendo transmitir patologias causadas por Salmonela, Shigella, Listeria, E. coli, além de protozoários, helmintos e o vírus da hepatite A (NASCIMENTO et al., 2003). 2.1 A ALFACE A alface é a hortaliça mais vendida para consumo cru, produzida em quase todo território nacional, é rica em minerais principalmente o cálcio, fonte de vitamina A, B 1, B 2 e vitamina C (OLIVEIRA et al., 2006), é utilizada em sanduíches, decoração de pratos, em saladas e Produtos Minimamente Processados (MP) (NASCIMENTO et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2005). Sua contaminação pode ocorrer antes e após a colheita, através do contato com o solo, irrigação com água contaminada, transporte e mão dos manipuladores (NASCIMENTO et al., 2005). Esta é a sexta hortaliça em importância econômica e oitava em termos de produção (OLIVEIRA et al., 2005).

10 9 2.2 SANITIZAÇÃO Uma definição para sanitização encontrada no Food and Drug Administration (FDA) (1998 apud FDA 2001), relacionada aos alimentos como frutas e hortaliças frescas seria o tratamento do produto limpo por um processo eficaz em destruir ou reduzir o número dos microrganismos patogênicos, sem afetar a qualidade ou segurança do produto para o consumidor. As hortaliças comercializadas além de nutritivas e atraentes devem ser limpas e livres de substâncias nocivas capazes de causar intoxicações gastrintestinais caracterizada por vômito e diarréia. A questão higiênico-sanitária abrange não só a manipulação das hortaliças na hora da colheita e embalagem, mas a produção, pois se deve ter o cuidado com os utensílios utilizados no preparo e a forma de servir ao consumidor (OLIVEIRA et al., 2006). Muitas técnicas foram usadas para reduzir a contaminação da alface como a intervenção na irrigação, na colheita, no processamento, contudo às vezes esta contaminação é inevitável. Além disso, a manipulação pode aumentar a carga microbiana, mesmo quando os métodos de lavagem são apropriados (SMITH et al., 2003). A qualidade do alimento é fundamental, sendo assim os atributos microbiológicos, nutricionais, sensoriais e o controle em todas as etapas do processamento objetiva assegurar um alimento que promova saúde ao consumidor (SOUZA; CAMPOS, 2003). Garantir segurança ao consumidor, é o mesmo que fornecer produtos livres de perigos, ou seja, livres de contaminação física, química e biológica, que pode causar dano à saúde. Os perigos físicos seriam fragmentos de metais provenientes de equipamentos ou da própria matéria-prima; os de natureza química estão os resíduos de pesticidas; e perigos biológicos, as bactérias patogênicas (OLIVEIRA et al., 2005). A atenção crescente está sendo dada a melhores métodos de desinfecção de alimentos que contenham microrganismos patogênicos. Os consumidores acreditam que lavar e sanitizar frutas e hortaliças eliminaria esses microrganismos, entretanto, estudos mostram que a eficiência destes métodos convencionais, não é capaz de reduzir mais que 90% da carga microbiana (SAPERS, 2001; NASCIMENTO et al., 2003), porém é necessária uma etapa de desinfecção com agentes antimicrobianos, para manter a contaminação em níveis seguros, ou seja, sem risco de ocorrer surtos de TIAs (NASCIMENTO et al., 2003). Há uma variedade de métodos usados para reduzir microrganismos em alimentos inteiros e MP, e cada método tem vantagens e desvantagens. O melhor método deve impedir a contaminação em primeiro lugar, entretanto, isto nem sempre é possível. A necessidade de

11 10 lavar e sanitizar os produtos é utilizado para impedir doenças. Deve-se notar que a lavagem e a sanitização do produto nem sempre elimina totalmente microrganismos patogênicos depois que o produto foi contaminado, conseqüentemente, é importante a lavagem e a sanitização de forma adequada (FDA, 2001). Deve-se ter em vista que a tecnologia de lavagem convencional tem o propósito de retirar os produtos do solo como grãos de terra, pedras e insetos provenientes do solo encontrados nas hortaliças após a colheita e não de eliminar microrganismos (SAPERS, 2001). Os métodos de sanitização geralmente envolvem a aplicação de água, para remover os produtos químicos, tratamento mecânico com utilização de escovas ou pulverizadores, seguido de enxágüe, sendo que nesta etapa pode ser incluído um tratamento sanitizante (FDA, 2001). É importante que a água utilizada seja limpa para não ser veículo de contaminação ao alimento (FDA, 2001; OLIVEIRA et al., 2005), além disso, a eficiência do método utilizado é geralmente dependente do tipo de tratamento, tipo e fisiologia do microrganismo, característica da superfície do alimento como rachaduras, fendas e textura, tempo de exposição e concentração do sanitizante, assim como ph e temperatura. Deve-se ter cuidado com a concentração de sanitizante, pois pode ter impacto sensorial inaceitável no alimento (FDA, 2001). Os fatores que limitam a eficiência da lavagem dos alimentos contaminados com microrganismos podem ocorrer em algum ponto durante a produção, a colheita, a embalagem, o processamento, a distribuição onde à exposição a fezes humanas e de animais é possível. Geralmente, quanto mais cedo dentro desta seqüência ocorre à contaminação, mais difícil é a desinfecção do alimento, sendo assim, a eficácia da lavagem do produto pode depender do intervalo de tempo entre a contaminação e a lavagem (SAPERS, 2001). 2.3 AGENTES SANITIZANTES O uso de desinfetantes nos alimentos pode não eliminar de forma completa microrganismos patogênicos (MAISTRO, 2001), por isso nessa fase é importante à escolha do sanitizante, pois além de eficaz não pode ser tóxico. Atualmente, um sanitizante permitido pela legislação é o cloro e em outros países utilizam em maior escala agentes como vinagre, ácido peracético, que ganharam aceitação no mercado mundial, por serem considerados tão eficazes quanto o cloro (NASCIMENTO; SILVA; CATANOZI, 2003). Mesmo com a utilização de ozônio, peróxido de hidrogênio e ácido peracético em alimentos MP a utilização de agentes clorados ainda é maior, por ser de fácil utilização e

12 11 menor custo. É de suma importância a escolha do sanitizante e o controle de ph da solução é fundamental na operação. Segundo Lund et al. (2005), na sanitização de frutas e hortaliças as recomendações quanto à concentração, ph e tempo de exposição ao cloro são entre mg/l, ph 5 a 7, 3 a 20 minutos respectivamente, de exposição do produto ao sanitizante. O cloro é o sanitizante mais utilizado em alimentos em suas várias formas. Os compostos clorados são germicidas de grande ação, pois reagem com as proteínas das células microbianas promovendo perda de componentes celulares. São amplamente utilizados nas concentrações de mg. L -1, na desinfecção de frutas, hortaliças e produtos MP, porém concentrações maiores podem ser a causa de descoloração em alguns produtos, além de promover a corrosão de equipamentos (ANTONIOLLI et al., 2005). Nos níveis industriais, de UANs e doméstico, o cloro é utilizado como sanitizante devido seu custo e conveniência. Valores de ph entre 6 e 7,5 são utilizados para evitar a corrosão de equipamentos e devido à aceitabilidade sensorial do alimento (FDA, 2001). O hipoclorito de sódio (água sanitária), sanitizante químico, é talvez o mais utilizado por ter ação rápida, fácil aplicação e completa dissociação na água (FDA, 2001; ANTONIOLLI et al., 2005), mas outros agentes como o vinagre, ácido acético, ácido peracético, começam a despertar interesse das empresas, pois há controvérsias quanto à toxicidade do cloro nos alimentos (NASCIMENTO et al., 2003). O ácido peracético é mais utilizado na indústria de alimentos, devido a sua eficácia a frio, grande diluição dos produtos de degradação e não oferece risco de toxicidade, nem altera sabor e odor dos alimentos (NASCIMENTO et al., 2003). A importância do vinagre na alimentação é devido ao seu uso de várias formas, como: condimento, utilizado em saladas, dando sabor ácido; conservante, evitando o crescimento de fungos em vegetais (GRANADA et al., 2000), devido seu alto conteúdo de ácidos orgânicos com ação antimicrobiana (NASCIMENTO et al., 2003); amaciante de carne; e como agente de limpeza por sua ação antibactericida (GRANADA et al., 2000). Para Florentino et al. (2001), o vinagre no Brasil não tem a merecida importância pela sua qualidade, propriedades organolépticas, nutritivas, sanitizantes e medicinais. Entretanto, o uso do vinagre é indicado para utilização como sanitizante por ser barato, de uso simples em casa, mas uma desvantagem seria o efeito sensorial negativo quando usado no alimento (FDA, 2001). O vinagre é o produto obtido através da fermentação alcoólica seguida de fermentação acética, a partir da oxidação química e biológica (presença de bactérias). Durante a fermentação acética alguns fatores como concentração de carboidrato no suco, concentração

13 12 de leveduras, temperatura que ocorre a fermentação, ph do meio, quantidade de oxigênio, clarificação, envase e a pasteurização, influencia no processo de produção (SILVA; SILVA; SWARNAKAR, 2003). O vinagre de maçã, também conhecido como vinagre de sidra, é obtido através da fermentação do suco da maçã inteira obtendo uma coloração amarelo-dourada devido aos taninos, e contem as qualidades da maçã, como aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais, sendo considerado até mesmo um remédio, prometendo prolongar a vida e a juventude, desde que ingerido diariamente (THACKER, 1990). Como o vinagre de maçã é feito de maçãs frescas e inteiras, o vinagre contém pectina (fibra solúvel encontrado na casca da maçã), por ser fibra solúvel absorve água criando volume, com isso ela tem a função de retardar o esvaziamento gástrico, retardando a absorção dos alimentos e carreando o colesterol para fora do organismo, pois o colesterol se aglutina a fibra (THACKER, 1990). Segundo Rizzon e Miele (2003), o vinagre é o produto obtido exclusivamente da fermentação acética do vinho. Os outros vinagres, denominados fermentados acéticos, são elaborados a partir de mostos açucarados, que primeiro foram submetido à fermentação alcoólica e depois ao processo de acetificação. O vinagre de vinho genuíno deve conter ácido tartárico, compostos fenólicos, relação sódio/potássio elevada, teor de prolina, metanol e de poliálcoois, proporcionais aos encontrados no vinho, além de acetoína (RIZZON; MIELE, 2003). Quando o vinagre é produzido a partir do vinho de um fruto ele se torna de melhor qualidade, mais apreciável e nutritivo do que comparado aquele produzido a partir do etanol, pois de certa forma ele possui as mesmas características do fruto (SILVA; SILVA; SWARNAKAR, 2003). No Hospital de Yale-New Haven a pia onde os cirurgiões lavam as mãos antes da cirurgia são limpas com solução de vinagre a 0,5% e este se revelou mais eficaz que o produto que ele substituiu (THACKER, 1990). 2.4 MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS A denominação de coliformes a 45 C é equivalente a coliformes fecais ou termotolerantes e sua tolerância máxima permitida para hortaliças frescas, in natura, sanificadas, para consumo direto é 2x10 2 NMP/g (ANVISA, 2001).

14 13 As bactérias do grupo coliformes são bastante comuns, pois se originam do solo de cultivo, porém as linhagens de E. coli não devem fazer parte da microbiota normal quando os produtos forem cultivados em solo sem contaminação fecal, com água de boa qualidade e boas práticas de manipulação. Estas bactérias são indicadoras da qualidade higiênico-sanitária dos processos e, se encontradas em altos índices, indicam risco de veiculação para outros patógenos (NASCIMENTO et al., 2003). Coliformes totais e fecais são microrganismos indicadores de contaminação de origem fecal, que implica no contato do alimento com fezes humanas ou de animais, caracterizando as condições inadequadas durante a produção. Estes microrganismos além da contaminação natural também são disseminados através da higiene deficiente no manuseio (OLIVEIRA et al., 2006). A E. coli é um habitante do trato gastrintestinal dos animais, inclusive do homem, com efeito benéfico, suprimindo a multiplicação de bactérias prejudiciais e sintetizando algumas vitaminas, entretanto, algumas cepas de E. coli podem provocar doenças em indivíduos, as chamadas E. coli enteropatogênicas, que ocupam hoje o segundo lugar entre os principais agentes de doenças de origem alimentar nos EUA (SILVA et al., 2003). Os alimentos mais freqüentemente relacionados a surtos de doenças nos EUA, provocados por E. coli enteropatogênicas são a carne (25%) e frutas, hortaliças (20%) (SILVA et al., 2003). Como tem aumentado os surtos de doenças através da contaminação de frutas e hortaliças provocadas por E. coli se levantou a pergunta sobre a eficácia dos produtos destinados a sanitização, sendo realizados estudos para avaliar a resistência das cepas de E. coli (SILVA et al., 2003). Segundo Silva et al. (2003), um grupo de pesquisadores de várias instituições, alerta quanto à padronização dos métodos para determinação da eficácia dos desinfetantes contra microrganismos patogênicos em frutas e hortaliças, outro fator importante também é o fato de desinfetantes com o mesmo princípio ativo apresentar diferença na ação antimicrobiana, por serem de marcas comerciais diferentes, então se torna necessário o monitoramento periódico da qualidade desses produtos. No Brasil, embora raros estudos, têm-se verificado verduras com grandes concentrações de contaminação por coliformes fecais, isto mostra que o cuidado desde a irrigação destas hortaliças é fundamental, pois constitui importante fonte de contaminação. No entanto, também se pode dizer que em algum momento, colheita, produção, transporte,

15 14 armazenagem, manipulação dessas hortaliças, houve contato com fezes humanas e/ou de animais (GUIMARÃES et al., 2003).

16 15 3 MATERIAL E MÉTODOS As amostras de alfaces foram obtidas em três estabelecimentos comerciais localizados na cidade de Santa Maria/RS, no período de agosto a outubro de As análises microbiológicas foram realizadas no Laboratório Escola de Análises Clínicas - Setor de Microbiologia da UNIFRA. 3.1 AMOSTRA DE ALFACE Foram coletadas alfaces do tipo crespa em diferentes estabelecimentos comerciais e acondicionada em sacos plásticos encontrados à disposição no local de coleta. Cada amostra de alface continha aproximadamente 400g. Foi realizada uma análise com a hortaliça sem higienização e outra apenas higienizada em água corrente. 3.2 ANÁLISE MICROBIOLÓGICA Técnica 1: Primeiramente, foram realizados testes preliminares, para avaliar a qualidade do produto e para isso foi utilizada a técnica do NMP (Número Mais Provável), a qual compreende duas etapas, ou seja, a técnica de Número Mais Provável para coliformes totais e a técnica de Número Mais Provável para coliformes fecais Técnica de número mais provável para coliformes totais Essa técnica é dividida em três etapas: etapa de pré-enrequecimento, teste presuntivo para coliformes totais e teste confirmatório para coliformes totais. Etapa de pré-enriquecimento: pesou-se assepticamente 25g de amostra de alface em placa de petri asséptica e posteriormente foi homogeneizada em 225ml de água peptonada em um saco estéril; desta foi transferido 1ml para cada tubo com água peptonada e homogeneizado; realizando-se assim, diluições decimais subseqüentes até uma concentração de Teste presuntivo para coliformes totais: a partir das diluições anteriores, foi transferido 1ml de cada diluição para tubos contendo 10 ml lauryl sulfato de sódio, procedimento realizado em triplicata para cada diluição; foi incubado em estufa a 37ºC por 48h e observado

17 16 os resultados; positivo se ocorreu formação de gás ou turvação do meio e negativo se não houve alteração do meio. Teste confirmatório de coliformes totais: foi utilizado o meio verde brilhante, onde foram transferidas 3 alçadas das amostras positivas em lauryl sulfato de sódio para tubos contendo verde brilhante e incubado em estufa a 37 C por 48h, observando os resultados, turvação do meio e formação de gás e negativo para as amostras sem alteração do meio Técnica do número mais provável para coliformes fecais Foi utilizado caldo EC, onde foi realizado o mesmo procedimento do verde brilhante, porém a incubação foi realizada em banho-maria em 44,5 C. A técnica 1 foi utilizada em alface não higienizada (sem lavagem) e higienizada (lavadas em água corrente) para se obter uma média de coliformes totais e fecais destas amostras e verificar se encontravam-se dentro do permitido pela legislação. Técnica 2: Foi feito uma suspensão de bactérias utilizando a escala de MacFarland segundo Antunes (1995), resumidamente: foi preparada uma solução de ácido sulfúrico a 1% e solução aquosa de cloreto de bário a 1,175% e lentamente sob agitação constante, foram adicionadas as quantidades indicadas a 10 tubos previamente preparados para obter um volume de 10ml/tubo. Foram fechados os tubos hermeticamente, conservando-os a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. O precipitado de sulfato de bário, quando ressuspendido, corresponde à densidade conferida por cultivo de E. coli em meio líquido, obtendo-se uma concentração inicial de bactérias de 1,5x10 8 UFC/ml e dessa, transferiu-se 0,5 ml para cada tubo de Durham contendo uma solução de água peptonada e vinagre, água peptonada e hipoclorito e solução padrão como segue: Preparação das soluções de vinagres (maçã, álcool, vinho branco e tinto): água peptonada (10ml) + vinagre (6,25%, 12,5%, 25% e 50%) + suspensão de bactérias (0,5ml). Preparação das soluções de hipoclorito: água peptonada (10ml) + hipoclorito (50 200ppm) + suspensão de bactérias (0,5ml). Para cada tipo de vinagre e o hipoclorito foi realizada uma solução padrão: água peptonada (10ml) + suspensão de bactérias (0,5ml). Estas soluções ficaram em repouso durante 15 minutos, em seguida foi retirado 1ml de cada tubo e transferidos para tubos de Durham contendo caldo EC, este procedimento foi realizado em triplicata. Os tubos com caldo EC foram colocados em banho-maria durante 48h

18 17 em 44,5 C e observado os resultados; positivo se ocorreu formação de gás ou turvação do meio. A técnica 2 foi utilizada para verificar a eficácia dos agentes sanitizantes. 3.3 ANÁLISES DAS CONDIÇÕES SENSORIAIS DA ALFACE Foram analisadas as condições sensoriais da alface deixando a mesma em repouso em agentes sanitizantes, para isso, utilizou-se diferentes concentrações de agentes sanitizantes, que seguiram a metodologia citada por Silva et al. (2003), Lund et al. (2005), Antoniolli et al. (2005), Nascimento, Silva, Catanozi (2003), fazendo coleta em diferentes tempos préestabelecidos, 5, 10, 15, 20, 30 e 45 minutos, onde se verificou as características organolépticas da alface antes e após cada tempo em imersão aos agentes sanitizantes.

19 18 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos das análises de coliformes totais e fecais nas 3 amostras sem tratamento são apresentados pela tabela 1. TABELA 1. Coliformes totais e fecais (NMP/g) em amostras de 3 estabelecimentos comerciais analisados sem tratamento (não higienizada) Santa Maria, RS AMOSTRAS COLIFORMES TOTAIS (NMP/g) COLIFORMES FECAIS (NMP/g) Estab. I 4,6x10 4 2,3x10 2 Estab. II 1,1x10 5 2,7x10 3 Estab. III >1,1x10 3 >1,1x10 3 A determinação do NMP/g de coliformes totais e fecais (tabela 1), mostrou que todas as amostras apresentaram níveis altos de contaminação. Apesar da legislação não possuir um padrão para coliformes totais em alface, as análises foram efetuadas para um conhecimento do número desses microrganismos, ou seja, saber a respeito da qualidade higiênico-sanitária que chega ao consumidor. Para coliformes fecais, as amostras analisadas estão acima do que a legislação permite, a qual estabelece limite máximo de 2x10 2 NMP/g (ANVISA, 2001). Os resultados obtidos das análises de coliformes totais e fecais nas 3 amostras com tratamento (higienizada), estão apresentados na tabela 2. TABELA 2. Coliformes totais e fecais (NMP/g) em amostras de 3 estabelecimentos comerciais analisados com tratamento (higienizada) Santa Maria, RS AMOSTRAS COLIFORMES TOTAIS (NMP/g) COLIFORMES FECAIS (NMP/g) Estab. I 1,1x10 4 <3x10 1 Estab. II 1,1x10 4 <3x10 1 Estab. III 9,3x10 2 <3x10 1 Já a determinação do NMP/g de coliformes totais e fecais (tabela 2), mostrou que todas as amostras para coliformes totais apresentaram baixos níveis de contaminação, enquanto que para coliformes fecais, as amostras analisadas estão dentro do preconizado pela legislação.

20 19 Nascimento et al. (2002), trabalhando com saladas in natura servidas em restaurantes do tipo self-service, mostrou que todas as amostras apresentaram níveis altos de contaminação para coliformes totais e fecais. Através de uma análise microbiológica em alface de feiras-livres na cidade de Belém - PA, Oliveira et al. (2006), mostraram que todas as amostras colhidas apresentaram os valores máximos de coliformes totais e fecais, não apresentando padrões ideais para consumo humano. Cabrini et al. (2002), em seu estudo também demonstraram que das amostras analisadas aproximadamente 98% apresentavam resultado positivo, ou seja, grande contaminação por coliformes totais. Devido à contaminação da alface não ser proporcional nas semanas em que foi coletada, a técnica 1 não foi utilizada, não podendo verificar a eficiência do sanitizante na alface devido à contaminação de uma semana para outra ser diferente, ou seja, em uma semana a alface apresentava-se com alta contaminação e na outra semana a contaminação era mínima e por si invalidando a técnica. Então foi realizada a técnica 2, não sendo utilizada a alface e sim uma suspensão de bactérias conhecida de acordo com a escala MacFarland. Os resultados apresentados nas tabelas 3 e 4 demonstram o crescimento ou não de bactérias depois de 15 minutos de exposição ao produto sanitizante. TABELA 3. Presença ou ausência de coliformes fecais nos diferentes tipos de vinagres e suas concentrações com exposição por 15 minutos Santa Maria, RS CONCENTRAÇÃO Vinagre de vinho tinto Vinagre de vinho branco Vinagre de maçã Vinagre de álcool Água peptonada + E coli (padrão) 6,25% = 62,5ml vinagre + 937,5ml água 12,5%= 125ml vinagre ml água 25%= 250ml vinagre ml água 50% = 500ml vinagre + 500ml água significa presença de coliformes fecais; e --- significa ausência de coliformes fecais.

21 20 TABELA 4. Presença ou ausência de coliformes fecais com uso de hipoclorito e suas concentrações com exposição por 15 minutos Santa Maria, RS CONCENTRAÇÃO Hipoclorito Água peptonada + E. coli (padrão) +++ 2ml hipoclorito + 998ml água +++ 4ml hipoclorito + 996ml água --- 6ml hipoclorito + 994ml água --- 8ml hipoclorito + 992ml água significa presença de coliformes fecais; e --- significa ausência de coliformes fecais. Notou-se que o vinagre que melhor atuou na inibição do crescimento de coliformes fecais, foi o vinagre de maçã, com utilização da concentração de 12,5%, sendo necessário uma concentração maior para outros vinagres inibindo o crescimento bacteriano. O hipoclorito também se mostrou eficaz na concentração de 4ml. O vinagre que se mostrou menos eficiente foi o vinagre de vinho tinto que só inibiu o crescimento de microrganismos na maior concentração de 50%. Segundo estudo feito por Nascimento et al. (2002), o hipoclorito teve melhor resultado como sanitizante, pois conseguiu no tempo de 10 minutos uma redução do número de coliformes totais e eliminação dos fecais. Já os resultados com os vinagres de ácido e álcool não foram tão satisfatórios, o vinagre de ácido conseguiu uma redução significativa de coliformes totais e fecais, mas não da mesma maneira que o hipoclorito, já o vinagre de álcool continuava muito acima do permitido pela legislação. Lund et al. (2005), também observaram em seu estudo que o hipoclorito se mostrou mais eficiente, reduzindo a contaminação por coliformes fecais, destacando-se assim seu efeito como sanitizante. O estudo de Nascimento et al. (2003), que comparou desinfetantes na sanitização de uvas, mostrou que os melhores resultados foram obtidos utilizando ácido acético para microrganismos aeróbios mesófilos, bolores e leveduras, mas como coliformes totais e fecais tinha uma baixa contaminação inicial, todos os sanitizantes (hipoclorito a 200 ppm, vinagre a 6%, 25% e 50%, ácido peracético a 80 ppm, ácido acético a 2% e 4%, dicloroisocianurato de sódio a 200ppm), apresentaram desempenho semelhante. Os tratamentos a base de ácido acético foram melhor ou semelhante à ação do hipoclorito de sódio, no entanto, comparando os dois compostos clorados utilizados, ambos tiveram ação similar.

22 21 Segundo Santana et al. (2006), quanto maior a contaminação inicial do produto menor a eficiência do processo de sanitização, por exemplo, com imersão em água com 30% de vinagre, não houve redução significativa de coliformes fecais. De acordo com estudo realizado em Pelotas RS, onde foi avaliada a eficácia de diferentes métodos antimicrobianos na alface, para redução de coliformes totais e fecais, utilizando lavagem com água, água e vinagre, água e hipoclorito de sódio, o que se mostrou mais eficaz foi o hipoclorito de sódio (SANTOS et al., 2004). Porém, outros estudos mostraram que a utilização do vinagre a 6% foi o agente de melhor resultado para redução de coliformes totais e fecais e Vibrio cholerae, quando comparado a hipoclorito de sódio a 100mg/l, ácido acético a 0,2% e 0,3%, combinação de hipoclorito de sódio com vinagre (SANTOS et al., 2004). Quanto à relação custo/benefício do vinagre de maçã e hipoclorito observou-se que a quantidade de vinagre utilizada, para surtir o mesmo efeito do hipoclorito, foi superior, pois se utilizou 125ml de vinagre de maçã para 4ml de hipoclorito para se obter o mesmo efeito como sanitizante, desta forma o hipoclorito seria menos oneroso às indústrias de alimentos, UANs e donas de casa.

23 22 5 CONCLUSÕES Nas condições deste experimento pode-se concluir que, as amostras de alfaces analisadas sem tratamento (não higienizada) encontravam-se acima do que é permitido pela legislação para NMP/g, no entanto, as amostras que tiveram tratamento (higienizada), para coliformes fecais encontravam-se dentro da legislação, porém para coliformes totais com utilização da água reduziu de forma mínima a contaminação. No tratamento com agentes sanitizantes, constatou-se maior eficiência do vinagre de maçã e do hipoclorito, com ausência de coliformes fecais, na segunda concentração utilizada, com exposição à solução por 15 minutos. Vale ressaltar que, a quantidade de vinagre utilizada foi superior a de hipoclorito, pois se utiliza 125ml de vinagre diluído em 875ml de água para 4ml de hipoclorito diluído em 996ml de água para se obter o mesmo efeito como sanitizante, então a relação custo/benefício do hipoclorito é melhor. O tempo de exposição ao produto sanitizante por 15 minutos se mostrou eficaz e é o indicado, pois não há padronização na literatura quanto a tempo e concentração, por ser um tempo rápido que visivelmente não altera as características da hortaliça, mas como não foi realizado nenhum tipo de análise sensorial não se sabe se em tempos maiores de exposição ao sanitizante à alface poderia sofrer alguma alteração organoléptica como, por exemplo, alteração no sabor e na textura, assim podendo acontecer sob concentrações maiores. Sendo assim se sugere mais estudos nesta área, pois há poucos relatos sobre a atuação de agentes sanitizantes na descontaminação de alimentos, e se faz necessário uma padronização quanto a tempo de exposição e concentração do produto. Também não se deve esquecer que maiores cuidados, desde o cultivo até a mesa do consumidor sejam realizados, a fim de se obter um produto com qualidade e se assegurar uma população mais consciente e saudável.

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27 26 THACKER, Emily. O vinagre. São Paulo: Pacific Post Comercial Ltda