Aspectos relacionados a bemestar e métodos alternativos. Vera Lúcia de Castro Embrapa Meio Ambiente

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1 Aspectos relacionados a bemestar e métodos alternativos Vera Lúcia de Castro Embrapa Meio Ambiente

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3 Diversidade de linhas filosóficas Os animais merecem ser respeitados? Por quê? Senciência - É a capacidade de sentir, vivenciar emoções Conceito fundamental para os estudos em bem-estar animal Podemos usar um ser senciente para expandir nosso conhecimento e melhorar o destino dos seres humanos e dos animais? Correntes de pensamento diversas não, sim, desde que... Quais animais?

4 O que nos leva a crer que os animais são sencientes? 1.Senso comum 2. Evidências farmacológicas 3. Grau de complexidade e similaridades entre anatomia e fisiologia humana e animal 4. Evidências evolutivas: formas de vida mais complexas evoluíram a partir de formas de vida mais simples 5. Evidências comportamentais Fonte: WSPA Molento, C.F.M. Senciência Animal. Artigo da revista do Conselho Regional de Medicina Veterinária do PR

5 The Cambridge Declaration on Consciousness (07/07/2012) A declaração apresenta a conclusão de um grupo de neurocientistas de que os humanos não são os únicos animais com as estruturas neurológicas que geram consciência. Admite-se que muitos animais, incluindo o polvo, apresentam substrato neurológico para tanto.

6 DBCA- CONCEA (2013) DIRETRIZ BRASILEIRA DE PRÁTICA PARA O CUIDADO E UTILIZAÇÃO DE ANIMAIS PARA FINS CIENTÍFICOS E DIDÁTICOS- Fornece orientações para o cumprimento das normas estabelecidas pelo CONCEA para o uso ético de animais Bem-estar animal: Estado de equilíbrio físico e mental do animal em seu ambiente. O bemestar não é um estado absoluto, mas sim relativo e pode variar segundo mudanças ambientais. Distresse: estado de desconforto no qual o animal não é capaz de se adaptar completamente aos fatores estressores e manifesta respostas comportamentais ou fisiológicas anormais. Dor: experiência sensorial e emocional desagradável associada a uma lesão real ou potencial. Fonte: III Congresso Brasileiro de Bioética e Bem-estar Animal

7 Estratégias de melhoria para a condução ética da experimentação animal Controle pela legislação ou diretrizes Princípio dos 3 Rs

8 DBCA- CONCEA Esta Diretriz ressalta as responsabilidades de todos que utilizam animais para: (a) (b) (c) (d) (e) garantir que a utilização de animais seja justificada, levando em consideração os benefícios científicos ou educacionais e os potenciais efeitos sobre o bem-estar dos animais garantir que o bem-estar dos animais seja sempre considerado promover o desenvolvimento e uso de técnicas que substituam o uso de animais em atividades científicas ou didáticas minimizar o número de animais utilizados em projetos ou protocolos refinar métodos e procedimentos a fim de evitar a dor ou a distresse de animais utilizados em atividades científicas ou didáticas

9 Princípio dos 3 Rs Reduction Refinement Replacement redução do número de animais utilizados no experimento refinamento das técnicas visando evitar a dor e o sofrimento desnecessários substituição dos testes com animais por métodos alternativos Refinamento de tecnologias e de modelos experimentais também pode ser relacionado à redução da variabilidade da resposta. Leva a diminuição do número de animais utilizados nos grupos experimentais

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11 Diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) Desenvolvidas como parte de uma iniciativa do NC3Rs para - melhorar o desenho, a análise e o manuscrito de pesquisa com animais - maximizar a informação publicada e minimizar estudos desnecessários. As diretrizes foram publicadas na revista PLOS Biology (Public Library of Science) em Junho 2010, e fornecem uma lista para quem prepara ou revê um manuscrito para publicação. Elas são endossadas atualmente por revistas científicas, agências de financiamento e sociedades cientificas.

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13 Cubo de decisão de Bateson Importância da pesquisa Probabilidade de benefício alto baixo baixo alto baixo Sofrimento animal alto O cubo tem três eixos de medição - sofrimento animal, - certeza do benefício e, - qualidade da investigação. Pesquisa de alta qualidade: 1. será benéfica e não vai causar sofrimento, 2. irá ficar na seção da parte superior frontal, e deve prosseguir. Pesquisa de baixa qualidade 1. terá menor probabilidade de sucesso 2. irá ficar na parte inferior sólida e não deve continuar. Contudo, muitas das pesquisas não serão claramente definidas. Bateson, P., Ethics and Behavioral Biology. Advances in the Study of Behavior, 35, , 2005

14 Biotério: (CONCEA) Local onde são criados ou mantidos animais para serem usados em ensino ou pesquisa científica, que possua controle das condições ambientais, nutricionais e sanitárias. Uso consciente gera confiabilidade nos resultados

15 Tipos de biotério Biotério de criação Biotério de manutenção Biotério de experimentação local destinado à reprodução e manutenção de animais para fins de ensino ou pesquisa científica local destinado à manutenção de animais para fins de ensino ou pesquisa científica local destinado à manutenção de animais em experimentação por tempo superior a 12 horas

16 Bem-estar - princípios UK Farm Animal Welfare Council Conselho Britânico de Bem-estar de Animais Domésticos 5 liberdades desenvolvidos inicialmente para aves e mamíferos. Diminuição de condições que produzam sofrimento mental e físico ansiedade, medo, angústia, doença, dor, sede, fome. Alimentação - acesso à dieta apropriada em quantidade suficiente (manutenção saúde e vigor). Ambiente - ambiente satisfatório, incluindo abrigo e local para descanso. Comportamento e interação social - instalações adequadas e, quando apropriado, companhia da mesma espécie. Prevenção de doença, dano e prejuízo funcional tratamento rápido de doenças.

17 Funcionamento orgânico Experiências mentais (consciência, cognição, dor, etc.) Comportamento natural e sua relação com a saúde

18 Bem-estar em peixes O conceito de bem-estar animal tem sido aplicado a peixes Existe ainda alguma controvérsia quanto à sua capacidade de sofrimento Já foi descrita em peixes a formação de representações mentais em contextos de interação social, memória espacial e aprendizagem Peixes possuem características neuroanatômicas, fisiológicas e comportamentais compatíveis com estas estruturas pré-requisito para a existência de senciência (consciência de sensações e sentimentos) Brow, Fish intelligence, sentience and ethics, Anim Cogn, 2014

19 Bem-estar em peixes Deve ser avaliado por mais de um teste. Indicadores de bem-estar passíveis de uso: avaliação das preferências avaliação da motivação dos animais parâmetros fisiológicos (crescimento, reprodução) parâmetros comportamentais (natação, apetite)

20 Estudos sobre o bem-estar em peixes testes de preferência Volpato, G., Considerações metodológicas sobre os testes de preferência na avaliação do bem-estar em peixes, R. Bras. Zootec., v.36, p.53-61, 2007 Avaliam comportamentos (brincadeiras, dança nupcial e exploração de novo ambiente) Consideram condições ecológicas, ritmos biológicos, sociabilidade, etc Procuram minimizar distorções que poderiam afetar interpretações sobre o bem-estar dos peixes

21 Teste de preferência avaliação de coloração ambiental, tipo de sedimentos, etc Freitas e Volpato, 2011, Avaliação do bem-estar da tilápia-do-nilo a partir do esforço para obtenção de condições de preferência, Unesp, tese de doutorado Outros estudos enriquecimento ambiental

22 Métodos alternativos O modelo animal é uma ferramenta amplamente utilizada para a avaliação de toxicidade de uma substância. Desenvolvimento e implantação de metodologias alternativas Processo complexo que abrange - o desenvolvimento - a avaliação da relevância e - a avaliação da confiabilidade até a aceitação e adoção por organizações regulatórias e Comitês Internacionais Estados Unidos (Comitê Organizador Inter-Agências para Validação de Métodos Alternativos - Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods -ICCVAM) Europa (Centro Europeu para Validação de Métodos Alternativos - European Centre for the Validation of Alternative Methods - ECVAM).

23 Europa (Centro Europeu para Validação de Métodos Alternativos - European Centre for the Validation of Alternative Methods - ECVAM) Foi originalmente fundada em 1991 Possui papel atuante na legislação da EU através da Directive 2010/63/EU que trata da proteção dos animais usados para fins científicos.

24 European Commission Joint Research Centre EU Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL ECVAM) Recommendation on the Zebrafish Embryo Acute Toxicity Test Method (ZFET) for Acute Aquatic Toxicity Testing eur% _eurl%20ecvam%20zfet%20recommendation online.pdf Julho de 2014 proposta para uso em regulamentação e em substituição ao teste de toxicidade aguda

25 Métodos alternativos - Brasil CONCEA Resolução Normativa nº 17 (03/07/2014) dispõe sobre o reconhecimento no país de métodos alternativos validados que tenham por finalidade a redução, a substituição ou o refinamento do uso de animais em atividades de pesquisa

26 Métodos alternativos

27 Métodos alternativos - CONCEA Reconhecimento do método alternativo validado será por deliberação plenária do CONCEA, considerando o parecer da Câmara de Métodos Alternativos, ouvidos os órgãos oficiais pertinentes. 5 anos - período para que a infraestrutura laboratorial e os recursos humanos estejam adequados e capacitados para a realização dos ensaios substitutivos. proibição da utilização de animais, após cinco anos de aprovação

28 Renama - Rede Nacional de Métodos Alternativos criada pela Portaria nº 491, 03/07/2012, do Ministério de Ciência, Tecnologia e Inovação (MCTI). Três laboratórios fazem parte do núcleo central da Renama - Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), em Campinas. - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS), vinculado à Fundação Oswaldo Cruz. - Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (Inmetro) lançado o primeiro Edital do MCTI/CNPq exclusivamente destinado aos métodos alternativos, dividido em 2 linhas: 1) implantação de métodos já validados, onde foram contemplados 8 laboratórios e; 2) desenvolvimento de modelo de pele, na qual 1 laboratório foi contemplado fomento de R$ 1,58 milhão, serão publicadas 3 chamadas - validação do método Het-Cam (irritação ocular) - produção de linhagem geneticamente modificada para o desenvolvimento de ensaios in vivo, a fim de reduzir ou substituir o uso de animais em experimentos científicos - cultivo de células e tecidos humanos para testes farmacológicos e toxicológicos

29 BraCVAM - Centro Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos - criado como parte do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) - visa identificar os laboratórios e as necessidades de validação, bem como, organizar os estudos e viabilizar a execução dos mesmos - valida tanto os métodos oriundos do exterior como os produzidos internamente Parecer nº 195/2014/CONCEA (21/08/2014) Reconhecimento de Métodos Alternativos Resolução Normativa nº 18, de 24 de setembro de 2014 A Câmara Permanente de Métodos Alternativos do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal - CONCEA, reconhece os métodos alternativos listados no parecer devido a: - informações oriundas de Centros de Validação que validam os referidos métodos, os quais são aceitos por Agencias regulatórias internacionais, - recomendação do BraCVAM

30 Para avaliação do potencial de irritação e corrosão da pele Método OECD TG 430 Corrosão dérmica in vitro: Teste de Resistência Elétrica Transcutânea. Método OECD TG 431 Corrosão dérmica in vitro: teste da Epiderme Humana Reconstituída. Método OECD TG 435 Teste de Barreira de Membrana in vitro Método OECD TG 439 Teste de irritação Cutânea in vitro Para avaliação do potencial de irritação e corrosão ocular Método OECD TG 437 Teste de Permeabilidade e Opacidade de Córnea Bovina Método OECD TG 438 Teste de Olho Isolado de Galinha Método OECD TG 460 Teste de Permeação de Fluoresceína Para avaliação do potencial de fototoxicidade Método OECD TG 432 Teste de Fototoxicidade in vitro 3T3 NRU Para avaliação da absorção cutânea Método OECD TG 428 Absorção Cutânea método in vitro Para avaliação do potencial de sensibilização cutânea Método OECD TG 429 Sensibilização Cutânea: Ensaio do Linfonodo Local Método OECD TG 442A e 442B Versões não radioativas do Ensaio do Linfonodo Local Para avaliação de toxicidade aguda Método OECD TG 420 Toxicidade Aguda Oral Procedimento de Doses Fixas Método OECD TG 423 Toxicidade Aguda Oral Classe Tóxica Aguda Método OECD TG 425 Toxicidade Aguda Oral procedimento Up and Down Método OECD TG 129 Estimativa da dose inicial para teste de toxicidade aguda oral sistêmica (*) Para avaliação de genotoxicidade Método OECD TG 487 Teste do Micronúcleo em Célula de Mamífero in vitro.

31 OECD no. 129 ( ) Guidance document on using cytotoxicity tests to estimate starting doses for acute oral systemic toxicity tests Baseada no conceito do uso de dados de citotoxicidade para determinar a dose inicial em ensaios de toxicidade oral em roedores Simulações mostraram que o uso de ensaios de citotoxicidade in vitro para estimar a LD 50 para uso como dose inicial no método Up-and-Down-UDP potencialmente reduz o uso de animais em 25-40%. Spielmann, H., Genschow, E., Liebsch, M., and Halle, W. (1999), Determination of the starting dose for acute oral toxicity (LD50) testing in the up and down procedure (UDP) from cytotoxicity data. Altern. Lab. Anim. 27: OECD. 2008, Acute Oral Toxicity Up-and-Down Procedure. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 425, Paris, France. Available at: [

32 Métodos alternativos - Fish Embryo Toxicity, FET abordagem biomédica e ecotoxicológica OECD publicação de 2013 (Test Guideline - 236). Resultados apresentam correlação com testes de toxicidade aguda de peixes adultos. Critério alimentação ativa Directive animal welfare 2010/63/EU No Brasil, o FET ainda não faz parte das normativas (Danio rerio) Strähle et al., Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations, Reproductive Toxicology, 33, , 2012

33 Vantagens do uso do zebrafish Ciclo de vida curto Tamanho reduzido Rápido desenvolvimento embrionário Ovos transparentes e não aderentes Boa capacidade reprodutiva Genoma sequenciado Baixo custo de manutenção 70% ~ DNA humano (alto grau de homologia entre peixe-zebra e genomas humanos)

34 Ciclo de vida

35 Colheita dos ovos com a ajuda de um coador plástico: - despejar a água contendo os ovos, de modo lento. - verter os ovos em um recipiente com água reconstituída. Aquário para acasalamento Fertilização externa

36 Fish Embryo Test Permite a análise de múltiplos objetivos desde a toxicidade aguda até o desenvolvimento de toxicidade genética e análise fisiológica 5 concentrações, controle positivo (4 mg/l 3,4-dichloroanilina) e negativo, solvente ovo vivo (1h) ovo morto / coagulado

37 Rack para manutenção e sistema de coleta de ovos

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39 D. rerio Ensaio de toxicidade em embriões de Danio rerio Embrião 1h pós-fertilização - incubação a 0, 1, 10 e 100 mg/l, sem e com UV - fotoperíodo 16/8h, 96h Medida de comprimento total das larvas, sobrevivência, malformação, eclosão e equilíbrio Biomarcadores bioquímicos: - Catalase - Glutationa S-transferase - Fosfatase ácida

40 Ensaios com zebrafish Ovo - Sobrevivência, teratologia Larva Sobrevivência, comportamento, bioquímica Adulto Sobrevivência, bioquímica comportamento, genotoxicidade

41 Sugestões outras Formação de recursos humanos para validação de metodologias alternativas Treinamento de recursos humanos para as diversas áreas de bioterismo (animais de qualidade) Melhoria de processos de manutenção e de geração de resíduos do biotério

42 Obrigada