UTILIZAÇÃO DE GRÃOS DE ARROZ COM Metarhizium anisopliae CONTRA LARVAS DE Aedes aegypti EM CONDIÇÃO DE SEMICAMPO

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1 UTILIZAÇÃO DE GRÃOS DE ARROZ COM Metarhizium anisopliae CONTRA LARVAS DE Aedes aegypti EM CONDIÇÃO DE SEMICAMPO Adriano Rodrigues de Paula, Anderson Ribeiro, Cátia Oliveira de Paula Morais, Ruth de Souza Braga Dias, César Ronald Pereira Gomes, Richard Ian Samuels Universidade Estadual do Norte Fluminense/Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias- Laboratório de Entomologia e Fitopatologia, Av. Alberto Lamego, 2000, Campos dos Goytacazes-RJ. biodepaula@yahoo.com.br; anderson.ribeirorj@yahoo.com.br; catiadepaula@gmail.com; ruthdias.psi@gmail.com; cesaronald@bol.com.br, richard@uenf.br Resumo - Estudos de laboratório observaram a virulência do fungo entomopatogênico contra larvas de Aedes aegypti. Esse trabalho propôs um novo método de aplicação de fungo Metarhizium anisopliae aderido em grão de arroz colocado na água contra larvas de A. aegypti em condição de semicampo. Foram feitos testes utilizando 10 ou 20 grãos de arroz colocados na água contra as larvas e também ensaios de persistência observando viabilidade do fungo ao longo do tempo. A aplicação de 20 grãos de arroz com fungo na água reduziu significativamente a taxa de sobrevivência de larvas comparada com a aplicação de 10 grãos de arroz com fungo. Nos testes de persistência as larvas que entraram em contato com 20 grãos de arroz + fungo imediatamente após serem adicionados em água apresentaram 5% de sobrevivência e valor do S 50 de 1 dia. Os demais tempos de permanência dos 20 grãos de arroz + fungo na água (5, 10 e 20 dias) resultaram em 42%, 54% e 58% de sobrevivência larval, respectivamente. Os tratamentos controles apresentaram aproximadamente 100% de larvas vivas. Esse foi um teste preliminar, mais ensaios precisam ser realizados. Palavras-chave: Fungos entomopatogênicos. Larvas. Aedes aegypti. Semicampo. Área do Conhecimento: Ciência Biológica. Introdução A dengue é uma doença virótica febril e aguda transmitida pelo mosquito Aedes aegypti sendo considerado um sério problema de saúde pública em paises tropicais e subtropicais. O controle do mosquito A. aegypti com o uso de inseticidas químicos organofosforados e piretróides têm provocado o surgimento de populações resistentes (GIANNINI, 2001; RANSON et al. 2010). O uso contínuo da bactéria Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) contra larvas de A. aegypti pode resultar na resistência de mosquitos (ALVES, 1998). O controle de larvas do mosquito da dengue no Brasil foi até recentemente feito com aplicação de Bti. Agora o Bti foi substituído por reguladores de crescimento de insetos. Vários estudos de laboratório têm mostrado o potencial do uso de fungos entomopatogênicos contra mosquitos vetores de doenças. Pereira et al., 2009 observaram a suscetibilidade de larvas de A. aegypti ao fungo M. anisopliae em condição de laboratório. A suscetibilidade de larvas do mosquito da malária ao fungo M. anisopliae ou B. bassiana também já foi observado (BukharI et al., 2011). A utilização de fungos para o controle de larvas de mosquitos em condições de campo baseia-se no desenvolvimento de meios eficazes que garantam a virulência e viabilidade do fungo no ambiente natural. O presente estudo foi feito em condição de semicampo utilizando o fungo M. anisopliae aderido em grãos de arroz contra larvas de A. aegypti. Foi avaliado taxa de sobrevivência larval e persistência da virulência do fungo ao longo do tempo. A diminuição de larvas de A. aegypti provavelmente diminuirá a população dos adultos transmissores da doença dengue. Metodologia Este trabalho foi conduzido na varanda do insetário do Laboratório de Entomologia e Fitopatologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos dos Goytacazes - RJ. Os testes ficaram protegidos contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de telha de alvenaria. Os mosquitos A. aegypti foram criados em pote plástico, recoberto com tecido organza e mantido a temperatura de 25ºC, 75% UR 12h fotoperíodo. Um camundongo imobilizado numa malha de arame foi exposto aos mosquitos para a alimentação sanguínea. A oviposição das fêmeas de A. aegypti ocorreu em um copo plástico de 100 ml recoberto com papel-filtro e com 50 ml de água de torneira. A eclosão das larvas foi estimulada por imersão total do papel-filtro com ovos em bandejas com 100 ml de água 24 h antes tratada com 0,05g de ração do camundongo triturado. As 1

2 larvas foram alimentadas diariamente com essa ração. As pupas foram mantidas em copo plástico com água. Os mosquitos adultos foram alimentados com uma solução de sacarose (10%). Larvas de segundo estádio foram utilizadas nos experimentos. As pupas quando formadas foram descartadas. O fungo utilizado nos testes foi o M. anisopliae isolado ESALQ 818 já descrito como de alta virulência contra larvas de A. aegypti (PEREIRA et al., 2009). O fungo foi cultivado em arroz parboilizado (Figura 1) e os grãos de arroz contendo conídios aderidos foram utilizados nos testes. O tratamento controle foi feito somente com grãos de arroz autoclavados. Figura 1 Arroz com conídios do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae. Ensaio 1 Avaliação de taxa de sobrevivência de larvas expostas a 10 ou 20 grãos de arroz com fungo Metarhizium anisopliae Baldes de 8 L foram utilizados nesse teste. Dentro de cada balde foi colocado 1 L de água de torneira com 50 larvas de A. aegypti + os grãos de arroz. Foram feitos experimentos com 10 e depois com 20 grãos de arroz. Os baldes foram cobertos com organza. A concentração final do fungo nos baldes contendo 10 grãos arroz foi de 2,9 x 10 5 e com 20 grãos arroz foi de 5,9 x Os ensaios controles foram feitos com arroz autoclavado. Ensaio 2 Avaliação da persistência do fungo Metarhizium anisopliae aderidos em grãos de arroz contra larvas de Aedes aegypti (tempo zero), 5, 10 e 20 dias pós-adição dos grãos de arroz com ou sem conídios. Foram utilizados 3 baldes para cada período. Cinqüenta larvas foram adicionadas em cada balde. O tratamento controle foi feito com arroz autoclavado. Forma de Análise dos Resultados O teste de sobrevivência larval foi repetido 3 vezes e o de persistência 1 vez. O valor médio de sobrevivência foi calculado pelo método de Kaplan-Meier (BLANFORD et al., 2005). As curvas de sobrevivência foram comparadas usando o Log-Rank Test a 95% de nível de significância. Este método foi conduzido pelo GraphPad Prism 3.0 Software. Primeiramente foram analisadas as repetições de cada tratamento, com o objetivo de verificar se as curvas de sobrevivência entre as repetições foram estatisticamente diferentes. Não ocorrendo diferenças significativas às repetições de cada experimento foram agrupadas ( pooled ), dando-se inicio à análise das curvas de sobrevivência entre os tratamentos. O tempo médio de sobrevivência (S 50 ) das larvas também foi avaliado pelo GraphPad Prism. O grupo controle que não apresentou diferenças significativas em sua curva de sobrevivência foi agrupado aos demais, calculadas as médias, e apresentada somente uma curva de sobrevivência. Resultados Ensaio 1 Avaliação de taxa de sobrevivência de larvas expostas a 10 ou 20 grãos de arroz com fungo Metarhizium anisopliae A Figura 2 mostrou que as larvas que ficaram em contato com água + 10 grãos de arroz com fungo tiveram 52% de sobrevivência e que as larvas colocadas na água com os 20 grãos de arroz com o fungo apresentaram 5% de sobrevivência e valor de S 50 de 1 dia. A aplicação de 20 grãos de arroz com o fungo na água reduziu significativamente a taxa de sobrevivência de larvas comparada com a aplicação de 10 grãos de arroz com o fungo [F (5,17) = ; p<0.01]. Os tratamentos controles apresentaram aproximadamente 100% de larvas vivas. Primeiro foram preparados os baldes (8 L) com 1 L de água de torneira + os 20 grãos de arroz. Os baldes foram cobertos com organza. Quatro tratamentos foram feitos: larvas colocadas em baldes nos seguintes períodos: imediatamente 2

3 %SOBREVIVÊNCIA altas temperaturas e o inevitável contato com a água. Tabela 1 Sobrevivência ± Desvio Padrão (DP) e Tempo Médio de Sobrevivência (S 50 ) das larvas colocadas na água com 20 grãos de arroz. As larvas foram colocadas na água no tempo zero, 5, 10 e 20 dias pós-adição dos 20 grãos de arroz. O tratamento controle foi feito com 20 grãos de arroz autoclavado. Figura 2 - Sobrevivência (%) diária de larvas de A. aegypti colocadas na água com 10 ou 20 grãos de arroz + fungo. Tratamento controle foi feito com arroz autoclavados. (Três repetições foram feitas). Ensaio 2 Avaliação da persistência do fungo Metarhizium anisopliae aderidos em grãos de arroz contra larvas de Aedes aegypti A Figura 3 mostra que as larvas que entraram em contato com os 20 grãos de arroz + fungo imediatamente após sua inoculação em água apresentaram 5% de sobrevivência e valor do S 50 de 1 dia. Os demais tempos de permanência dos 20 grãos de arroz + fungo na água (5, 10 e 20 dias) resultaram em 42%, 54% e 58% de sobrevivência de larvas, respectivamente (Tabela 1). O tratamento controle teve 97% de larvas vivas DIAS TEMPO ZERO 5 DIAS 10 DIAS 20 DIAS CONTROLE Figura 3 Sobrevivência (%) diária de larvas adicionadas na água com 20 grãos de arroz + fungo. As larvas foram adicionadas na água 0, 5, 10, 20 dias após a inoculação do arroz com fungo. (Uma repetição desse experimento foi feito). Discussão Nesse estudo foi observado que os grãos de arroz com conídios do fungo M. anisopliae aderidos foram promissores para o controle de larvas de A. aegypti. O fungo M. anisopliae tem sido considerado virulento contra larvas de A. aegypti em condição de laboratório. No entanto, a utilização destes fungos para o controle de larvas de mosquitos no campo baseia-se no aprimoramento de meios eficazes de aplicação reduzindo a sua sensibilidade à radiação UV, as Tratamentos Sobrevivência (%) S 50 ± DP Tempo zero 5 ± 78, dias 42 ± 28, dias 54 ± 26,61 ND 20 dias 58 ± 19,35 ND Controle 97 ± 19,35 ND ND = Dados não determinados. A aplicação de 20 grãos de arroz com fungo na água reduziu significativamente a taxa de sobrevivência das larvas comparada com testes feitos com 10 grãos de arroz + fungo (P<0,01). No teste de persistencia foi observado que as larvas adicionadas na água imediatamente pós a adição dos 20 grãos de arroz apresentaram menor taxa de sobrevivência (Tabela 1), comparado com os outros tratamentos. Mesmo assim as taxas de sobrevivência dos demais tratamentos foram menores comparado com os resultados observados no tratamento controle (97% de sobrevivência larval) e mais testes serão realizados para confirmar esse resultado. Outros ensaios também podem ser feitos com o intuito de ter uma forma de liberação lenta dos conídios, similar ao processo de encapsulação usado na formulação de fungos entomopatogênicos (FENG et al. 1994). BukharI et al., 2011 observaram que o fungo M. anisopliae ou Beauveria bassiana formulados em um óleo sintético (Shellsol T) foram fáceis de serem aplicados e misturados na água, comparado com formulações feitas com baixa dosagem de Tween 80, esporo seco ou formulações a base de óleo mineral. Além disso, essa formulação foi eficaz reduzindo a sobrevivência de larvas de Anopheles gambiae e Anopheles stephensi. Óleo sintético Shellsol T pode ser formulado com conídios de fungo e utilizado contra larvas de mosquitos em condições de laboratório e de semicampo. Em condições de laboratório Pereira et al., 2009 observaram que o isolado ESALQ 818 formulado com 0,05% de Tween 80 reduziu significativamente a sobrevivência de larvas de A. aegypti (12%), comparado com o controle (90%). As larvas foram expostas imediatamente à água com o fungo e testes de persistência não foram realizados. Um isolado de M. anisopliae usado por Alves et al. (2002) contra larvas de Culex quinquefasciatus causou 50% de mortalidade em 24 horas quando 3

4 aplicado sobre a superfície de água. Entretanto, esse fungo perdeu rapidamente à viabilidade dois dias depois da aplicação. Na literatura foi registrado que as larvas que sobreviveram à infecção do fungo podem sofrer efeitos tardios do entomopatógeno. Pereira et al., 2009 observaram que as larvas que sobreviveram a infecção fungica resultaram em pupas que não concluiriam o seu ciclo, ou seja, as pupas não se desenvolveram em adultos. Mesmo assim preconiza-se a utilização de fungos virulentos que reduzam em poucos dias a sobrevivência de larvas de mosquitos. Futuros ensaios podem avaliar a viabilidade do fungo aderido em grãos de arroz para matar larvas por mais de 20 dias. Pode-se também investigar outras formulações que reduzam a sobrevivência larval. Os efeitos prejudiciais do UV sobre o fungo (MORLEY-DAVIS et al., 1995) devem ser levados em consideração em condição de semicampo. Os efeitos deletérios da luz solar sobre o BTi já foi demonstrado por Vilarinhos et al. (1998). Talvez a radiação UV prejudicou o fungo no teste de persistência, mesmo o ensaio sendo realizado numa varanda protegida contra radiação solar direta. Os estudos da persistência do fungo são considerados importantes por darem subsídios para o desenvolvimento de programas utilizando fungo no manejo integrado de vetores. Inyang et al. (2000) estudaram a persistência de M. anisopliae formulados com água ou óleo. A aplicação dos conídios na água contra larvas deve garantir a viabiliadade do fungo. Formulações em óleo propiciam um micro-ambiente que protege o fungo contra raios ultravioletas (PRIOR et al., 1988). Atualmente a viabilidade, infectividade e persistência dos conídios em condições de campo são inadequadas, exigindo o desenvolvimento de formulações de longa duração (KNOLS et al., 2010) matando as larvas. Também deve ser levada em consideração a possibilidade da reaplicação do fungo na água. Os agentes de saúde poderão facilmente distribuir os grãos de arroz com fungo em recipientes contendo água contra larvas dos mosquitos A. aegypti. Ainda não foram observados efeitos prejudiciais do fungo entomopatogênico na saúde humana. Os resultados obtidos confirmam que o fungo entomopatogênico M. anisopliae é um bom candidato para ser usado em programas de controle do mosquito A. aegypti. Pretendemos melhorar técnicas de aplicação e aumentar a eficiência e a persistência dos conídios para serem utilizados em condições de campo. Conclusão O fungo entomopatogênico M. anisopliae foi virulento contra larvas de A. aegypti. Grãos de arroz com o fungo colocados em água reduziram as taxas sobrevivência de larvas de A. aegypti, comparado com grãos de arroz autoclavado (controle). Provavelmente grãos de arroz com fungo poderão ser utilizados no contra larvas de A. aegypti, reduzindo à população desse vetor e consequentemente a doença dengue. Agradecimentos À UENF e FAPERJ projetos: E-26/ /2008, E-26/ /2010 e E-26/ /2011. Referências - ALVES, S.B., ALVES, L.F.A., LOPES, R.B., PEREIRA, R.M., AND VIEIRA, S.A. Potential of Some Metarhizium anisopliae Isolates for Control of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae), Journal of Entomology, V.126, p , ALVES, S. B. Controle Microbiano de Insetos. 2º ed. Piracicaba. p.1163, BLANFORD, S., CHAN, B.H.K., JENKINS, N. SIM, D. TURNER, R.J., READ, A.F. THOMAS, M.B. Fungal pathogen reduces potential for malaria transmission. Science. V.308, p , BUKHARI, T., TAKKEN, W., KOENRAADT, C.J.M. Development of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana formulations for control of malaria mosquito larvae. Parasites & Vectors. V.4, p.23-27, FENG, M.G., POPRAWSKI, T.J., KHACHATOURIANS, G.G. Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassinia for insect control: current status. Biocont. Sci. Tech. V.4, p.3-34, GIANNINI, M. L. Dengue hemorragica. 2º ed. Editora Santos. 84p

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