INTERAÇÃO DO LARVICIDA DIFLUBENZURON COM O FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO Metarhizium anisopliae PARA CONTROLE Aedes aegypti

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1 INTERAÇÃO DO LARVICIDA DIFLUBENZURON COM O FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO Metarhizium anisopliae PARA CONTROLE Aedes aegypti Cátia Oliveira de Paula, Mariana Borges Cerqueira Cipriano, Adriano Rodrigues de Paula, Aline Teixeira Carolino, Simone Azevedo Gomes, Richard Ian Samuels Universidade Estadual do Norte Fluminense/Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias- Laboratório de Entomologia e Fitopatologia, Av. Alberto Lamego, 2000, Campos dos Goytacazes-RJ, catiadepaula@gmail.com, marianaborgesbji@hotmail.com, biodepaula@yahoo.com.br, teixeira_a@yahoo.com.br, simoneazgomes@yahoo.com.br, richard@uenf.br Resumo- O mosquito Aedes aegypti é o principal vetor da dengue. Vários trabalhos têm mostrado a resistência de mosquitos a inseticidas químicos, portanto novas alternativas de controle devem ser investigadas. O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae tem sido considerado potencial candidato para o controle de mosquitos. No presente trabalho, investigou a suscetibilidade de larvas de A. aegypti a combinação de M. anisopliae com o larvicida diflubenzuron. Foi avaliado também o percentual de germinação dos conídios na presença do larvicida. O diflubenzuron não comprometeu a germinação dos conídios. As concentrações de diflubenzuron (denominadas sub-letais) usadas foram 0,25 ppb e 2 ppb. As larvas expostas ao fungo combinado com essas concentrações do inseticida tiveram menor percentual de sobrevivência do que as tratadas com fungo sozinho, indicando um efeito sinérgico dos agentes. Palavras-chave: Metarhizium anisopliae, diflubenzuron, Aedes aegypti, dengue Área do Conhecimento: Agronomia Introdução Considerada a mais importante arbovirose que infecta o homem, o vírus da Dengue, é vista atualmente como um dos principais desafios da saúde pública mundial, com mais de um terço da população localizada em áreas de risco a infecção. Endêmica na Ásia, nas Américas, no Mediterrâneo e no Pacifico Ocidental, a doença tem infectado cerca de 100 milhões de pessoas por ano segundo a organização Mundial de Saúde (OMS), chegando a 20 mil óbitos (WHO, 2008). A Dengue tem como seu principal vetor o mosquito Aedes aegypti, espécie de hábitos essencialmente domésticos, as fêmeas são hematófaga, dotada de grande antropofilia, que devido à inexistência de uma vacina tetravalente eficaz e de tratamentos etiológicos efetivos tornase o alvo do combate à doença (WHO 2009). Como forma de eliminação do mosquito transmissor, produtos químicos vêm sendo amplamente utilizados, apresentando importante papel no controle ao vetor devido principalmente à facilidade de aplicação e rapidez com que atuam. Dentre os produtos indicados pelo Ministério da Saúde destaca-se o larvicida diflubenzuron (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). A eficácia do diflubenzuron foi comprovada em testes com larvas de A. aegypti de terceiro estádio, onde Borges et al. (2004) demonstraram que quando tratadas nas concentrações de 0,1 e 1 ppm a mortalidade chegou a 100% em menos de 7 dias. As constantes dificuldades enfrentadas no controle de mosquitos com inseticidas químicos devido ao desenvolvimento de resistência têm sido dada uma crescente importância aos agentes de controle biológico (WHO, 2009) por serem específicos e reduzirem os impactos ambientais (ALVES, 1998). O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae tem sido considerado potencial candidato para os programas de controle de vetores. Paula et al. (2008) demonstraram o efeito patogênico e virulento de isolados de M. anisopliae sobre adultos do mosquito A. aegypti e Pereira et al. (2009) obtiveram 90% de mortalidade em larvas usando M. anisopliae. Vieira et al. (2013) observaram através de microscopia eletrônica de varredura o estágio inicial de infecção do M. anisopliae em larvas e adultos de A. aegypti. Mnyone et al. (2009) demonstraram mortalidade de 90% das fêmeas de Anopheles gambiae e A. arabiensis quando expostas ao fungo. Trabalhos têm mostrado aumento na eficiência dos fungos M. anisopliae e Beauveria bassiana quando combinados com inseticidas (FURLONG; GRODEN, 2001; HIROMORI; NISHIGAKI, 2001; PAULA et al., 2011). A interação entre fungos e doses subletais de inseticidas pode ser uma alternativa para melhorar a eficácia do entomopatógeno (PACHAMUTHU; KAMBLE, 2000), reduzindo a quantidade de inseticida utilizado (Borges e Nova, 2011) que combinado 1

2 com fungo entomopatogênico parecem ser promissores para uso no manejo integrado de vetores. O presente estudo teve o objetivo de avaliar a suscetibilidade das larvas de A. aegypti a formulação do fungo M. anisopliae combinado com inseticida diflubenzuron. Metodologia Os biensaios foram realizados no Laboratório de Entomologia e Fitopatologia e no Insetário da UENF. As larvas de A. aegypti (linhagem Rockefeller) foram criadas em sala climatizada à temperatura de 26 ± 2 C, umidade relativa 80±10% e fotofase de 12h. Para estimular a eclosão, papeis filtro com os ovos foram submersos em bandejas plásticas (10 cm x 30 cm x 20 cm) que continham água potável e ração comercial para gato (0,1g/bandeja). As larvas foram mantidas nas bandejas até o estádio de L3 tardio/l4 inicial e nesse estádio foram usadas nos biensaios. Para análise do efeito do inseticida na germinação do fungo, foi adicionado ao meio de cultivo Sabouraud Dextrose Agar (SDA), diflubenzuron (produto comercial PM25%) previamente diluído, resultando na concentração de 10ppb. SDA foi vertido em placas de Petri e após a solidificação, foram inoculados em cada placa dez µl de suspensão de conídios (5x10 6 ml - 1 ). Essas placas foram mantidas em BOD durante 24h e a germinação foi observada num microscópio. No grupo controle não foi acrescentado o inseticida. Na investigação da suscetibilidade das larvas, o diflubenzuron foi utilizado na concentração de 0,25 e 2 ppb, a concentração fúngica foi de 10 7 conídios ml -1 diluída em Tween 80 (0,05%) e no grupo controle foi utilizado água destilada com Tween 80. No tratamento do fungo combinado com diflubenzuron, o inseticida foi previamente preparado e em seguida foram adicionados 2 ml de suspensão fúngica resultando na concentração final de 2x10 5 conídios ml -1. Em cada tratamento, foram utilizadas três grupos com dez larvas distribuídas em copos plásticos de 250mL com 100 ml dos agentes a serem testados. Foram realizadas três repetições e a mortalidade foi observada diariamente durante sete dias. Os dados foram submetidos à ANOVA e as médias foram comparadas usando teste de Tukey, admitindo-se α = 0,05. Para tanto, foi utilizado o programa SPSS for Windows (versão 11.0). As curvas de sobrevivência e o tempo médio de sobrevivência (S 50 ) foram comparados usando o teste de Log Rank em 95% de nível de significância. Este método foi conduzido pelo GraphPad Prism 4.0 Sofware (MOTULSKY, 2003). Resultados Pela análise de variância a germinação dos conídios não foi comprometida com a presença do diflubenzuron, sendo a taxa média de germinação do fungo no meio SDA com diflubenzuron (79%) significativamente igual à porcentagem de germinação do tratamento controle (85%) (F 4,5 = 0,336; P> 0,05). Foi constatada diferença significativa nos bioensaios de suscetibilidade, pelo teste de Tukey, ao nível de 5% (F 12, 17 = 37, 226). Os tratamentos F+D proporcionaram menor porcentagem de larvas sobreviventes quando comparado com F, porém o controle foi estatisticamente igual aos tratamentos com apenas inseticida (Tabela 1). Tabela 1 Sobrevivência ± Desvio Padrão (DP) e Tempo Médio de Sobrevivência (S 50 ) das larvas de A. aegypti tratadas com Fungo (F), Diflubenzuron (D1-0,25 ppb e D2= 2 ppb) e combinação de ambos (F+D). N= 30 larvas/ repetição Tratamentos Sobrevivência (%) S 50 Controle 88,9 ± 0,08 a ND D1 77,8 ± 0,05 ab ND D2 72,2 ± 0,05 ab ND F 57,8 ± 0,07 b ND F + D1 28,9 ± 0,07 c 4 F + D2 22,3 ± 0,08 c 3 Valores seguidos de mesma letra não apresentam diferença estatística pelo teste de Tukey (5% probabilidade). Dados não determinados (ND) A Figura 1 mostra que as curvas de sobrevivência das larvas tratadas com fungo, diflubenzuron e combinação de ambos foram estatisticamente diferentes pelo teste de Log Rank (P<0.0001). A sobrevivência das larvas caiu drasticamente nos tratamentos F+D, após 4 dias de tratamento havia 30% de larvas sobreviventes no F+D1 e 44% no tratamento F+D2. No tratamento F no quarto dia de tratamento havia 74% de larvas sobreviventes. Os tratamentos D1, D2 e o controle ocasionaram pequeno decréscimo na sobrevivência das larvas, no terceiro dia de avaliação havia mais que 80% de larvas sobreviventes. 2

3 Sobrevivência (%) Dias Figura 1 Sobrevivência de larvas de A. aegypti tratadas com Diflubenzuron (D1-0,25 ppb e D2= 2 ppb); Fungo (F) e combinação de ambos (F+D1; F+D2). N= 30 larvas/ repetição. Discussão Controle D1 D2 F F + D1 F + D2 Diferentes classes de inseticidas podem causar uma variedade de efeitos sobre fungos entomopatogênicos, tais como a inibição da germinação, desenvolvimento do tubo germinativo e até mesmo mutações que podem alterar a patogenicidade e/ou virulência do fungo (ALVES; LEUCONA, 1998), entretanto Mohamed et al. (1987) observaram que piretrina, permetrina e resmetrina e os reguladores de crescimento de insetos diflubenzuron e methoprene não foram inibitórios para as várias fases de desenvolvimento do M. anisopliae. O diflubenzuron atua interrompendo a formação e deposição de quitina, danificando a cutícula e prejudicando o processo de muda (MULLA, 1995), essa ação do inseticida pode ter facilitado à infecção do M. anisopliae, visto que, seu processo infeccioso inicia-se a partir da adesão e germinação dos conídios na cutícula do inseto (CASTRILHO et al., 2005). Corroborando, Furlong e Groden (2001) sugerem que o mecanismo de sinergismo entre fungos entomopatogênicos e inseticidas envolvam mudanças na fisiologia nos insetos, que influencia penetração cuticular ou a proliferação inicial dos conídios dentro da hemocele do hospedeiro. Interação sinérgica entre M.anisopliae e diferentes inseticidas tem sido demonstrado na literatura. Neves e Alves (1999) reportaram que os fungos M. anisopliae e Beauveria bassiana quando aplicados em associação com concentrações subletais de imidacloprid promoveram uma ação sinérgica eliminando colônias de cupins Cornitermes cumulans comparado com o fungo sozinho. A elevada taxa de mortalidade e taxa reduzida de alimentação das larvas Agriotes lineatus e A. obscurus tratadas com Spinosad combinado com M. anisopliae indicam que esses agentes de controle interagem sinergicamente sendo uma possibilidade de controle dessas pragas no campo (ERICSSON et al., 2007). Paula et al. (2011) observaram que o fungo M. anisopliae combinado com baixas dosagens do inseticida Imidacloprid reduziu significativamente a sobrevivência de adultos de A. aegypti, comparado com tratamentos feitos somente com o fungo. Formulações de fungos entomopatogênicos tem grande importância para o controle microbiano (ALVES, 1998). O larvicida diflubenzuron apresentou características desejáveis para o uso combinado com M. anisopliae, além de ser biodegradável, não sistêmico, de baixo impacto ambiental e praticamente atóxico para mamíferos (FOURNET et al., 1993), pois atua apenas na síntese de quitina, durante o processo de muda e essa é uma substância restrita aos artrópodes (MULLA, 1995). Conclusão O diflubenzuron não afetou a germinação do M. anisopliae e as larvas de A. aegypti foram mais suscetíveis ao fungo combinado com diflubenzuron do que ao fungo sozinho. A combinação de F+D parece ser promissora contra larvas de A. aegypti e testes de semicampo devem ser investigados. Referências - ALVES, S.B. Fungos Entomopatogênicos. In: ALVES, S.B. Controle microbiano de insetos. 2.ed. Piracicaba: Ed. Fealq, ALVES, S.B; LEUCONA, R.E. Epizootiologia aplicada ao controle microbiano de insetos. In: ALVES, S.B. Controle microbiano de insetos. 2.ed. Piracicaba: Ed. Fealq, BORGES, R.A; CAVASIN, G.M; SILVA, I.G; ARRUDA, W; OLIVEIRA, E.S.F; SILVA, H.H.G; MARTINS, F. Mortalidade e alterações morfológicas provocadas pela ação inibidora do diflubenzuron na ecdise da larvas de Aedes aegypti (Diptera, Culicidadae). Revista de Patologia Tropical. V.33, n.1, p , BORGES, L.R; NOVA, M.X.V. Associação de inseticidas químicos e fungos entomopatogênicos 3

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