Patogenicidade de Beauveria sp. e Metarhizium anisopliae sobre formigas cortadeiras

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1 Patogenicidade de Beauveria sp. e Metarhizium anisopliae sobre formigas cortadeiras Aline Busetti, Janaine Kátia Cavazzola, Edegar Fronza, Neiva Monteiro de Barros, Margarete Luisa Arbugeri Menegotto Resumo As formigas cortadeiras dos gêneros Atta e Acromyrmex (Hymenoptera: Formicidae), são insetos frequentemente encontrados na região serrana e sul do Rio Grande do Sul. As colônias de formigas foram coletadas em meio às videiras e no seu entorno e mantidas em laboratório. Os testes de patogenicidade foram realizados com fungos entomopatogênicos Beauveria sp. e Metarhizium anisopliae, utilizando-se doses de 10 4 e 10 5 conídios/5μl/ inseto e o grupo testemunha recebeu 5 μl da solução Tween 80 a 0,1%. Foram utilizados 50 indivíduos para cada tratamento, acondicionados em frascos Erlenmeyer, com tampa telada, mantidos com um chumaço de algodão embebido em solução de açúcar 10% e em estufa B.O.D. Observações foram feitas a cada 24 horas, para registrar a mortalidade. Para confirmação da mortalidade pelo fungo, os cadáveres foram colocados em câmara úmida. Os resultados mostraram que as doses testadas foram efetivamente significativas na mortalidade dos insetos. Os tempos letais médios (TL 50 ) variaram de 100,32 a 139,40 horas para o gênero Atta exposta a Beauveria sp. nas doses 10 5 e 10 4, respectivamente, já para o gênero Acromyrmex o menor tempo letal foi de 125,74 horas para Beauveria sp. na dose 10 4 e o maior foi 150,91 para M. anisopliae na dose Palavras-chaves: formiga cortadeira, Atta, Acromyrmex, controle biológico e fungos entomopatogenicos. 1 Introdução As formigas cortadeiras dos gêneros Atta Fabricius, 1804 (saúvas) e Acromyrmex Mayr, 1865 (quenquéns) (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini), são insetos dominantes em muitos ecossistemas terrestres. Na agricultura brasileira, estes insetos são responsáveis por elevados prejuízos econômicos, atacando as plantas durante todo ano. Além disso, em razão do controle muitas vezes difícil e oneroso, as formigas cortadeiras representam a primeira preocupação do agricultor por exigirem gastos consideráveis com formicidas, equipamentos e mãos de obra (LOECK & GRÜTZMACHER, 2001). No estado do Rio Grande do Sul, concentram-se as maiores populações de formigas saúvas e quenquéns, principalmente nas regiões Serrana e Sul. Na cultura da videira, as formigas causam elevados danos econômicos devido ao corte de folhas, brotos e cachos. O ataque é prejudicial em qualquer fase do ciclo, porém, o dano é maior na fase de formação da planta, quando paralisa o crescimento (BOTTON et al. 2003). Segundo ZANETTI et al. (2002), os ataques realizados pelas formigas dos gêneros Atta e

2 Acromyrmex são intensos e constantes, demandando tempo e recursos financeiros que elevam consideravelmente os custos de produção (BOARETTO & FORTI, 1997). O controle biológico é uma alternativa ao uso de produtos químicos e pesquisas nesta área vêm sendo desenvolvidas com fungos entomopatogênicos e nematóides. Desta forma, a utilização de fungos entomopatogênicos para o controle de formigas é específica e econômica (DEBACH, 1968), pois em geral, os gastos com a utilização de produtos biológicos são menores. De acordo com SILVA & DIEHL-FLEIG (1988), os fungos entomopatogênicos das espécies Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, 1883 e Beauveria bassiana (Bals.) Vuilllemin, 1912, têm demonstrado eficiência no controle biológico das formigas cortadeiras e outras vantagens sobre os formicidas químicos, por apresentarem grande variabilidade genética, diferenças de patogenicidade e virulência (SANTOS et al. 2007). Neste contexto o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de Beauveria sp. e Metarhizium anisopliae no controle de formigas cortadeiras. 2 Material e métodos 2.1 Procedência dos insetos e instalação das colônias em laboratório Duas espécies de formigas cortadeiras (uma do gênero Atta e outra de Acromyrmex) foram coletadas tanto em meio às videiras como no entorno das mesmas. As colônias de formigas foram transportadas para o laboratório de Controle de Pragas da Universidade de Caxias do Sul - UCS, onde foram mantidas sob condições controladas (25ºC, 70% UR e fotofase 12 horas) em caixas de PVC de 25L, com duas conexões, uma para o alimento e outra para o descarte, imitando os ninhos naturais. Folhas de roseira (Rosa sp.) e de videiras (Vitis labrusca) foram disponibilizadas como substrato para o fungo, cultivado pelas formigas (Leucocoprinus sp). 2.2 Fungos entomopatogênicos Para os bioensaios, foram utilizadas uma linhagem de Beauveria sp. (UCSB06, isolada de solo de videira sob manejo orgânico, em Bento Gonçalves, RS - Brasil) e uma de Metarhizium anisopliae (E6, isolada de Deois flavopicta (Homoptera: Cercopidae), proveniente do Espírito Santo - Brasil) disponíveis na coleção de fungos entomopatogênicos da Universidade de Caxias do Sul.

3 2.3 Produção e viabilidade dos conídios dos fungos A produção de conídios dos fungos foi realizada em meio semi-sólido, utilizando-se 250g arroz + 87 ml de água destilada, de acordo com a metodologia descrita por ALVES & FARIA (2010), estimando-se o número de conídios/grama de peso seco. A viabilidade dos conídios foi determinada pela estimativa do percentual de conídios germinados em função do tempo, seguindo metodologia adaptada de NEVES et al. (2001) e ANDALÓ et al. (2004), utilizando-se meio líquido (batata e dextrose), ao qual foi inoculada uma suspensão de conídios de cada fungo, com os frascos mantidos em agitador orbital por 72h, a 26ºC ± 1. Após 12 horas, contou-se 400 conídios (germinados e não germinados) para determinação do percentual de germinação. 2.4 Testes de patogenicidade Para cada tratamento utilizou-se 50 indivíduos, separados em grupos de 10, ao quais foram acondicionados em frascos Erlenmeyers de 250ml, com um chumaço de algodão embebido em solução de sacarose 10% para alimentação dos insetos e com tampa telada, os quais foram mantidos em estufa B.O.D sob temperatura de 26 C. A patogenicidade de ambos isolados foi avaliada por meio de bioensaios utilizando-se doses de 10 4 e 10 5 conídios/5 μl/inseto correspondendo respectivamente a e conídios/alíquota, aplicadas no dorso das formigas cortadeiras individualmente. O grupo testemunha recebeu 5 μl de solução aquosa de Tween 80 a 0,1%. Observações foram realizadas a cada 24 horas, por 10 dias, para registrar a mortalidade dos indivíduos. Para confirmação de morte pelo fungo, os cadáveres dos insetos foram colocados em câmara úmida e mantidos em estufa B.O.D a C, 70% de UR para verificar a extrusão do fungo. A análise estatística dos resultados dos bioensaios foi realizada pelo método de Probit (FINNEY, 1971) para obtenção dos valores da TL50 e seus respectivos intervalos de confiança 95% (IC-95%). Quando os dados não foram adequados para o modelo de Probit, foi utilizado o método estatístico de Trimmed Spearman-Karber (HAMILTON et al. 1977). Nos casos de mortalidade natural ocorrida no controle, antes do cálculo da TL50 os valores da mortalidade, nos tratamentos, foram corrigidos segundo a fórmula de Abbott (1925), a seguir: Mc(%) = %Mo - %Mt x 100, onde %Mt

4 Mc = Mortalidade corrigida Mo = Mortalidade observada Mt = Mortalidade na testemunha 3 Resultados e discussão 3.1 Criação e manutenção das colônias em laboratório A metodologia empregada na manutenção laboratorial das colônias de ambas as espécies formigas cortadeiras (Atta e Acromyrmex) mostrou-se satisfatória uma vez que possibilitou a manutenção das populações por tempo indeterminado. A simulação das características naturais facilitou a adaptação dos insetos à condição laboratorial, sendo esta etapa uma das dificuldades nos trabalhos com insetos e outros organismos em condições de laboratório (PARRA, 2001). Os estudos relacionados à biologia de insetos são fundamentais para fornecer subsídios à programas de Manejo Integrado de Pragas, no entanto, para tal é de fundamental importância manter colônias em laboratório, para que possam ser realizados continuamente, sem a dependência da sua ocorrência natural no campo (PARRA, 2000). O material vegetal utilizado foi bem aceito por ambas as espécies de formigas, possibilitando o desenvolvimento da cultura do fungo e a vitalidade da colônia. Segundo DELLA-LÚCIA (1993) o suprimento diversificado promove maior disponibilidade de nutrientes essenciais para o bom crescimento do fungo e consequentemente o desenvolvimento da colônia. 3.2 Produção e viabilidade dos conídios dos fungos A produção de conídios apresentou bom rendimento (1.07 x 10 9 conídios/g para M. anisopliae e 8.2 x 10 9 conídios/g para Beauveria sp.). A superioridade do meio de arroz em relação a outros meios, na frutificação e desenvolvimento do fungo em menor espaço de tempo, já foi demonstrado por outros autores (AQUINO, 1974), sendo também mais viável economicamente (ALVES & FARIA, 2010). Segundo LONSANE et al. (1985), a utilização de um substrato fibroso favorece a aeração, causa menores problemas de compactação e maior superfície de crescimento durante um cultivo em substrato sólido. Os conídios das duas espécies de entomopatógenos apresentaram taxa de germinação superior a 90% em 12 horas. Após 24 horas, a formação de hifas e micélio impediu a

5 visualização dos conídios, considerando-se neste caso viabilidade de 100%. Os resultados obtidos neste estudo, com o uso de conídios frescos (sem período de armazenagem) corroboram com o preconizado em ALVES et al. (1996), que menciona que conídios recémproduzidos germinam em apenas 12 horas, apresentando 100% de viabilidade, enquanto os que são armazenados à 4 C atingiram 100% da germinação porém após horas. A percentagem de germinação de esporos, o seu tamanho relativo e a sua habilidade de penetrar no hospedeiro são determinantes e estão associados à virulência de isolados (VU et al. 2007). 3.3 Teste de patogenicidade A mortalidade das formigas cortadeiras dos gêneros Atta e Acromyrmex iniciou em 72 horas, após aplicação de ambos os fungos entomopatogênicos (Metarhizium anisopliae e Beauveria sp.), nas doses 10 4 e 10 5 respectivamente (Figura 01). De modo geral, para todas as doses houve diminuição do tempo médio de sobrevivência dos insetos testados, especialmente em Atta tratada com Beauveria sp. na dose 10 5 que apresentou TL( 50 ) 100,32 horas, enquanto que na dose 10 4 a TL( 50 ) foi observada 139,40 horas, corroborando com dados de ALVES et al. (1985) com Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera: Crambidae) e VILAS BOAS & ALVES (1988), com Castnia licus (Drury) (Lepidoptera: Castniidae), que utilizaram este mesmo patógeno. Já para Acromyrmex constatou-se que não houve diferença entre as doses 10 5 e 10 4, apresentando TL( 50 ) de 128,65 e 125,74 horas, respectivamente (Tabela 1). No entanto, quando comparado ao fungo entomopatogênico M. anisopliae, a TL( 50 ) foi de 143,73 e 150,91 horas para gênero Acromyrmex, nas doses 10 5 e 10 4, respectivamente, enquanto que para Atta a TL( 50 ) foi de 117, 97 e 117,90 horas para ambas as doses testadas, não apresentando diferenças significativas (Tabela 1). MALAGUIDO et al. (2000) também avaliaram, em laboratório, a infectividade de um isolado de M. anisopliae sobre o percevejo castanho, com aplicação tópica de conídios/inseto, obtendo mortalidade de 31%, o que difere deste trabalho que obteve 100% de mortalidade. A patogenicidade de Beauveria sp. e Metahrizium anisopliae, isolados de rainhas de A. sexdens rubropilosa, foi avaliada sobre soldados e cortadeiras dessa mesma espécie, constatando-se que ambos os fungos foram patogênicos à formiga (ALVES & SOSA- GOMEZ, 1983).

6 O tempo médio de sobrevivência entre os insetos controles e os dos tratamentos, para ambos os patógenos, nas duas espécies de formigas mostraram diferenças estatisticamente significativas (Figuras 2). Em relação ao controle pode-se observar sobrevivência média variando de 8,76 a 8,62 dias para os gêneros Atta e Acromyrmex, respectivamente, em relação ao fungo M. anisopliae. Enquanto que para o gênero Beauveria sp. foi de 8,64 a 8,76 dias para Atta e Acromyrmex, respectivamente. Percentuais de mortalidade de 100% dos insetos foram obtidos entre o 8 e 9 dia. A mortalidade total é uma característica importante, pois a capacidade de produzir propágulos do patógeno pode levar ao desencadeamento de epizootias em campo, através de disseminação dos mesmos no ambiente (ALVES & LECUONA, 1998). Além disso, a mortalidade confirmada pode ser escolhida como parâmetro para se estudar o comportamento da melhor dose, pois os fungos, como agente de controle biológico, diferem fundamentalmente dos produtos químicos, pela capacidade de aumento da densidade do patógeno por meio da dispersão do inoculo (HAJEK & ST. LEGAR, 1994). Os fungos foram capazes de crescer sobre os cadáveres dos insetos testados, após serem colocados em câmara úmida, colonizando o corpo do inseto entre o 3 ao 4 dia. SUN et al. (2002) também verificaram a presença de micélio dois dias após a morte dos insetos. A esporulação em cadáveres de seus hospedeiros é uma prova da capacidade do fungo em penetrar e colonizar, causando-lhes, então, a morte (DIEHL-FLEIG et al, 1988). Com a utilização do fungo Beauveria sp. observou-se que não há diferenças significativas entre as doses testadas para Acromyrmex, porém para Atta na dose 10 5 observou-se diferenças significativas quanto à sobrevivência. O tempo médio de sobrevivência para Atta foi de 4,78 a 5,84 dias e para Acromyrmex foi 5,84 a 5,78 dias, nas doses 10 5 e 10 4, respectivamente. No entanto pode-se observar que entre as espécies houve diferença apenas na dose 10 5 (Figura 1), esse resultado concorda com os obtidos por BITTENCOURT et al. (1995) que verificou aumento na mortalidade de larvas de Boophilus microplus devido à ação do fungo B. bassiana e PAIÃO et al. (2001) que constataram aumento da mortalidade de larvas proporcional ao aumento das concentrações de esporos. Em relação ao fungo M. anisopliae, verificou-se que não houve diferenças significativas entre as doses testadas para a mesma espécie, porém quando comparadas Atta e

7 Acromyrmex, houve diferenças significativas entre as doses. O tempo médio de sobrevivência de 5,30 a 5,22 dias para Atta e 6,32 a 6,72 dias para Acromyrmex, nas doses10 5 e 10 4 respectivamente (Figura 2). O tempo médio de médio de sobrevivência, ao final dos 10 dias de avaliação, foram estatisticamente diferentes, variando de 5,2 a 6,7 dias para M. anisopliae e 4,7 a 5,8 dias para Beauveria sp.. 4 Conclusão As formigas cortadeiras dos gêneros Atta e Acromyrmex mostraram-se susceptíveis à ação patogênica dos fungos Beauveria sp. e Metarhizium anisopliae. A mortalidade confirmada foi observada em cadáveres inoculados com ambas as doses dos fungos entomopatogênicos. A dose 10 5 provocou o menor tempo letal para o gênero Atta, com TL( 50 ) de 100,32 horas, quando tratadas com Beauveria sp.. As formigas cortadeiras do gênero Atta, submetidas à bioensaios com os fungos Beauveria sp. e Metarhizum anisopliae apresentaram tempo letal mediano TL( 50 ) inferior ao do gênero Acromyrmex. Ambos os patógenos tem potencialidade de serem selecionados para o controle de formigas cortadeiras, principalmente as do gênero Atta. Referências ALVES, R.T.; FARIA, M. Pequeno Manual sobre Fungos Entomopatogênicos. Embrapa Cerrados, Planaltina DF, p.47, ALVES, S.B.; LECUONA, R.E. Epizootiologia aplicada ao controle microbiano de insetos. In: ALVES, S.B.(Ed) Controle microbiano de insetos. Fealq, Piracicaba, p , ALVES, S.B. et al. Controle da broca da cana-de-açúcar pelo uso de Beauveria bassiana. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.20, p , ALVES, S.B. et al. Delayed germination of Beauveria bassiana conidia after prolonged storage at low, above-freezing temperatures. Biocontrol Science and Technology, v.6, p , 1996.

8 ALVES, S.B.; SOSA GÓMEZ, D.R. Virulência do Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok e Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. para duas castas de Atta sexdens rubropilosa (Forel, 1968). Poliagro, v.5, n.1, p.1-9, AQUINO, M.L.N. O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin, no Estado de Pernambuco. Boletim Técnico do Instituto de Pesquisas Agronômicas, v.72, p.1-26, ANDALÓ, V. et al. Compatibility of Beauveria bassiana with chemical pesticides for the control of the coffee root mealybug Dysmicoccus texensis (Tinsley) (Hemiptera: Pseudococcidae). Neotropical Entomology, v.33, p , BITTENCOURT, V.R.E.P. et al. Eficácia in vitro dos isolados 747 e 986 do fungo Beauveria bassiana no carrapato Boophilus microplus. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, Rio de Janeiro, v.4, p.86, BOTTON, M. et al. Viníferas para Processamento em Regiões de Clima Temperado. Sistema de Produção, 4 ISSN Versão eletrônica, Jun/2003. Disponível em: < atemperado/pragas.htm#formigas>. Acesso em: 22 maio de DEBACH, P. Control biologico de las plagas de insetos y malas hierbas. Editora Continental, S.A., México. p. 927,1968. DELLA LÚCIA, T.M.C. As formigas cortadeiras. Viçosa, p. 262, DIEHL-FLEIG, E. et al. Testes de patogenicidade dos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em Atta sexdens piriventris (Santschi, 1919) em diferentes temperaturas. Ciência e Cultura, v.40, n.11, p , FINNEY, D.J. Probit analysis. 3th ed. London: Cambridge University Press. p.25, HAJEK, A.E.; ST. LEGER, R.J. Interactions between fungal pathogens and insect hosts. Annual Review of Entomology 39, p , HAMILTON, M.A. et al. Trimmed spearman karber method for stimating median lethal concentration in toxicity biossays. Environ. Sci. Technol. 11: , LOECK, A.E.; GRUTZMACHER, D.D. Ocorrência de formigas cortadeiras nas principais regiões agropecuárias do Estado do Rio Grande do Sul. Pelotas: Ed. Universitária/UFPel, p.147, 2001.

9 LONSANE, B.K. et al. Engineering aspects of solidstate fermentation. Enzyme and Microbial Technology, v.7, n.6, p , MALAGUIDO, A.B. et al. Efeito de fungos entomopatogênicos sobre o percevejo-castanhoda-raiz. In: OLIVEIRA, L.J. (Org.). Efeito de inseticidas químicos e de fungos entomopatogênicos sobre o percevejo-castanho-da-raiz: resultados da safra 1999/2000. Londrina : Embrapa: Soja, p.32-36, NEVES, P.M.O.J. et al. Compatibility of entomopathogenic fungi with neonicotinoids insecticides. Neotropical Entomology, v.30, n.2, p , PARRA, J.R.P. A Biologia de insetos e o manejo de pragas: da criação em laboratório à aplicação em campo. In: GUEDES, J.V.VC.; COSTA, I.D.da; castiglioni, E. (Eds.). Base e Técnicas do Manejo de Insetos. Santa Mari: UFSM/CCR/DFS, p. 1-29, PARRA, J.R.P. Técnica de criação de insetos para programas de controle biológico. 6 ed. Piracicaba: ESALQ/FEALQ, p.134, PAIÃO, J.C.V. et al. Susceptibility of the cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) to isolates of the fungus Beauveria bassiana. World Journal of Microbiology & Biotechnology, Dordrecht, v.17, n.3, p , SANTOS, A.V. et al. Selection of entomopathogenic fungi for use in combination with sublethal doses of imidacloprid: perspectives for the control of the leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae). Mycopathologia, Netherlands, v.163, n.4, p , Disponível em: < Acesso em: 08 jun SILVA, M.E.; DIEHL-FLEIG, E. Avaliação de diferentes linhagens de fungos entomopatogênicos para controle da formiga Atta sexdens piriventris (Santschi, 1919) (Hymenoptera: Formicidae). Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, Londrina, v.17, n.2, p , SUN, J. et al. Sporulation of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana on Coptotermes formosanus in vivo and in vitro. J. Invertebr. Pathol. p.78-85, VU, V.H. et al. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. J. Biosci. Bioeng. 104: p , 2007.

10 VILAS BÔAS, A.M.; ALVES, S.B. Patogenicidade de Beauveria bassiana e seu efeito associado ao inseticida monocrotofós sobre Castnia licus (Drury, 1770) (Lepidoptera: Castniidae). Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, v.17, p , ZANETTI, R. et al. Manejo integrado de formigas cortadeiras. Lavras: UFLA, Figura 1: Curva de mortalidade dos gêneros Atta e Acromyrmex expostas as doses 10 4 e 10 5 dos fungo entomopatogênicos Beauveria sp e Metarhizium anisopliae.

11 Figura 2: Sobrevivência média de formigas cortadeiras (Acromyrmex sp e Atta sp) tratadas com Beauveria sp e Metarhizium anisopliae. Barras com letras diferentes apresentam diferenças estatisticamente significativas entre si, entre os tratamentos e entre as espécies (Tukey, p>0,05).

12 Tabela 1: Tempo médio de sobrevivência (TL 50 ) dos gêneros Atta e Acromyrmex expostos a Fungos entomopatogênicos.

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