INTERAÇÃO ENTRE Metarhizium anisopliae E Bacillus thuringiensis israelensis PARA O CONTROLE DE LARVAS DE Aedes aegypti

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1 INTERAÇÃO ENTRE Metarhizium anisopliae E Bacillus thuringiensis israelensis PARA O CONTROLE DE LARVAS DE Aedes aegypti Mariana Borges Cerqueira Cypriano, Cátia Oliveira de Paula, Adriano Rodrigues de Paula, Richard Ian Samuels Universidade Estadual do Norte Fluminense-RJ, Laboratório de Entomologia e Fitopatologia marianaborgesbji@hotmail.com; catiadepaula@gmail.com; biodepaula@yahoo.com.br; richard@uenf.br Resumo- O uso excessivo de produtos químicos como forma de controle de insetos vetores contribuiu para o desenvolvimento de resistência destes, tornando-se necessária a busca por meios alternativos de combate. O controle biológico tem sido utilizado como alternativa ao controle químico, sendo o Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) e o fungo Metarhizium anisopliae os agentes entomopatogênicos frequentemente utilizados. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a interação entre o Bti e o M. anisopliae contra larvas de A. aegypti. Testes comprovaram que o Bti não influenciou na germinação do fungo. As larvas foram submetidas a diferentes concentrações de Bti e doses subletais foram estipuladas. Três repetições foram realizadas submetendo as larvas às doses subletais de Bti e a concentrações de 1 7 e 1 8 conídios ml-1 do fungo separadamente e em combinação. Diferenças significativas foram encontradas entre os tratamentos de combinações de Bti, fungos e o tratamento controle. Porém, diferenças significativas não foram encontradas entre os tratamentos de fungo individualmente e fungo combinado ao Bti. Sendo assim, o Bti não apresentou ação aditiva nem antagonística sobre a virulência do fungo. Palavras-chave: Dengue, Aedes aegypti, Metarhizium anisopliae, Bti Área do Conhecimento: Ciências Biológicas Introdução O principal vetor da Dengue e da febre Amarela, no Brasil e no mundo, é o mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762), uma espécie predominantemente doméstica, antropofílica e hematófaga, que faz de depósitos artificiais de água limpa os locais preferenciais para a postura de seus ovos (TAUIL, 22). A aplicação contínua e indiscriminada de produtos químicos no combate a insetos vetores vem acarretando desequilíbrios ambientais (PAUMGARTTEN, 1993), além de acelerar o desenvolvimento de resistência dos vetores aos químicos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 29). Como alternativa, tem sido aplicado o controle biológico, baseado no emprego de inimigos naturais ou toxinas por estes liberados tendo como objetivo a supressão da população de mosquitos (OMS, 1984). Dentre os organismos patogênicos aplicados ao controle biológico destacam-se a bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis var israelensis, utilizada mundialmente no combate aos mosquitos (NEVES et al., 25), e o fungo filamentoso Metarhizium anisopliae, considerado um dos agentes mais promissores no controle de pragas (FRANCESCHINi et al., 21). O objetivo do presente estudo foi avaliar a interação entre o Bacillus thuringiensis var israelensis e o fungo entomopatogênico M. anisopliae sobre larvas de A. aegypti, verificando a suscetibilidade das larvas a diferentes concentrações de Bti e a combinações de diferentes concentrações de Bti e M. anisopliae. Foi avaliado também o efeito do Bti sobre a germinação e crescimento vegetativo de M. anisopliae em meio líquido e sólido. Metodologia O trabalho foi conduzido na Universidade Estadual do Norte Fluminense, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias, Laboratório de Entomologia e Fitopatologia (UENF/CCTA/LEF), localizada na cidade de Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro. Ovos de A. aegypti, linhagem Rockefeller, foram submersos em bandejas plásticas com água e ração comercial para gato triturada para a eclosão das larvas. As pupas originadas foram transferidas para gaiolas de criação. Os mosquitos adultos foram alimentados com solução de sacarose (1%) e após três dias foram expostos a um camundongo para a alimentação sanguínea. A oviposição das fêmeas ocorreu em um copo plástico com água recoberto com papel-filtro. Foi utilizado o isolado de M. anisopliae (ESALQ 818) cuja patogenicidade foi previamente comprovada aos adultos e às larvas de A. aegypti 1

2 (PAULA et al., 28; PEREIRA et al., 29). Os conídios do fungo foram semeados em placas de Petri esterilizadas contendo meio de cultura sólido (SDA) previamente autoclavado. Após a inoculação, as placas foram mantidas em câmara climatizada do tipo B.O.D durante quinze dias para crescimento e esporulação do fungo. Após este período os conídios foram retirados da placa e misturados em Erlemeyers de 5mL contendo 15g de arroz parboilizado e 9mL de água destilada, previamente autoclavados. Os Erlemeyers foram mantidos em B.O.D por quinze dias sob as condições descritas anteriormente. Na câmara de fluxo laminar os grãos de arroz contendo os conídios foram retirados dos Erlemeyers, misturados com o dispersante Tween 8. A concentração dos conídios foi determinada em câmara de Neubauer e diluições foram realizadas até serem obtidas concentrações de 1 7 e 1 8 conídios ml -1. O isolado M. anisopliae ESALQ 818 foi testado contra larvas de A. aegypti, linhagem Rockefeller. Foram adicionados suspensões fúngicas em copos plásticos contendo 1 ml de água destilada com 1 larvas em cada copo. O experimento foi realizado três vezes. Cada copo foi inoculado com 2 ml de suspensão fúngica com 1 7 ou 1 8 conídios ml -1 (Tween 8,5%) resultando na concentração final de 2 x 1 5 ou 2 x 1 6 conídios ml-1, respectivamente. No tratamento controle foi utilizada somente água destilada. A mortalidade larval foi avaliada diariamente por sete dias. Para a avaliação dos efeitos do larvicida sobre a germinação de M. Anisopliae em meio sólido o inseticida biológico VectoBac WG (Bacillus thuringiensis sorotipo H-14), formulação granulada e fornecido pela Valent BioSciences Corporation, foi dissolvido em água destilada estéril, formando uma suspensão estoque de partes por bilhão (ppb) de Bti. A suspensão foi adicionada ao meio SDA estéril ainda em fase liquida, resultando na concentração de 1mg/L de Bti. O meio foi vertido em placas de Petri e após a solidificação foram inoculados em cada placa 1 µl de suspensão de conídios (5x1 6 ml -1 ). As placas foram mantidas em câmara climatizada (B.O.D) a 26 C, durante 24 horas. A observação dos conídios foi realizada utilizando microscópio óptico. Em cada placa cem conídios foram contados de forma aleatória. O critério para a germinação de conídios foi a presença de tubo germinativo, com comprimento maior ou igual ao tamanho do próprio conídio. O tratamento foi constituído de seis placas de Petri inoculadas com fungo, sendo três placas como controle, sem adição de Bti. Para a mesma avaliação em meio líquido o Bti foi suspensa em água destilada estéril, formando uma suspensão estoque. A suspensão foi adicionada ao meio SDA líquido estéril em frascos contendo 1 ml de meio, obtendo as concentrações de 25, 5, 1 e 2 ppb. Os frascos foram mantidos por 24h numa incubadora shaker a 27 C e 14 rpm. Após este período foram retirados alíquotas de 1mL de cada concentração e centrifugadas por 1 minutos a 12. rpm. A solução sobrenadante foi retirada e filtrada utilizando o Acrodisc PF,2µ (Gelman Sciences) e nos poços da placa de Elisa foram colocadas 27 µl do meio com Bti das diferentes concentrações e adicionados 3µL do fungo na concentração de 1 6 conídios ml -1, obtendo a concentração final de 1 5 conídios ml -1. Em seguida foram levados para BOD por 24 horas para a germinação. A contagem dos conídios foi realizada utilizando o microscópio óptico invertido.. Larvas de A. aegypti, linhagem Rockefeller, foram expostas a concentrações de 6, 3, 15, 7,5 e 3,75 ppb de Bti. Em cada tratamento foram utilizadas dez larvas distribuídas em cinco copos plásticos com 1 ml de solução. O grupo controle foi tratado com água destilada. Foram realizadas três repetições e a mortalidade foi observada diariamente durante sete dias. A suspensão de fungo foi preparada conforme descrito anteriormente. Nos tratamentos de Fungo e Bti foram inoculados 2 ml de suspensão fúngica com 1 7 e 1 8 conídios ml -1 em diluições previamente preparadas de Bti em suas concentrações subletais (3,75, 7,5 e 15 ppb). Em cada tratamento foram utilizados dez larvas distribuídas em cinco copos plásticos com 1 ml de solução. O grupo controle foi tratado com água destilada. Foram realizadas três repetições e a mortalidade foi observada diariamente durante sete dias. As curvas de sobrevivência e o tempo médio de sobrevivência (S 5 ) foram comparados usando o teste de Log Rank em 95% de nível de significância. Este método foi conduzido pelo GraphPad Prism 4. Sofware (Motulsky, 23). Os dados foram submetidos a ANOVA e as médias foram comparadas usando teste post hoc de Duncan, admitindo-se α =,5. Para tanto, utilizou-se o programa SPSS for Windows (versão 11.). Resultados Os resultados obtidos nos tratamentos de germinação foram semelhantes, tendo 1% de germinação dos conídios em meio sólido e líquido nas concentrações de 25, 5, 1 e 2 ppb de Bti, após as 24 horas de incubação. Nos tratamentos com Bti foi possível notar o crescimento da bactéria concomitante com o 2

3 Sobrevivência (%) fungo. No tratamento controle, com apenas a solução de M. anisopliae, também foi obtido 1% de germinação. A Figura 1 compara as curvas de sobrevivência das larvas de A. aegypti expostas a diferentes concentrações de Bti durante sete dias. As curvas mostraram-se estaticamente diferentes pelo Logrank Test (P<.1). As duas maiores concentrações, 6 e 3 ppb, tiveram o valor de S 5 de 1 dia. Em 24h de exposição na dose de 6 ppb não havia larvas sobreviventes e 3 ppb nesse mesmo período apresentou média de sobrevivência de 17,5%. As três menores concentrações (15, 7,5 e 3,75 ppb) apresentaram curvas de sobrevivência semelhantes ao controle, com índice de sobrevivência maior que 8%. O valor S 5 não foi atingido durante o período experimental com essas concentrações. Sobrevivência (%) Figura 1 - Sobrevivência de larvas de Aedes aegypti expostas a diferentes concentrações de Bti durante sete dias. (n=4 larvas por repetição). As curvas de sobrevivência das larvas de A. aegypti tratadas com isolado ESALQ 818 (M. anisopliae) na concentração 1 7 conídios ml -1 e a combinação com diferentes concentrações de Bti mostraram-se estaticamente diferentes do controle (P<,1), porém não houve diferença entre as formulações com fungo, tendo valor de S 5 de 5 dias e média de sobrevivência menor que 45% (Figura 2) Fungo ppb ,5 ppb ,75 ppb ppb 3 ppb 15 ppb 7,5 ppb 3,75 ppb Sobrevivência (%) Figura 2 - Sobrevivência de larvas de A. aegypti expostas a Metarhizium anisopliae isolado ESALQ 818 na concentração 1 7 conídios ml -1 e em combinação com as concentrações de 15, 7,5 e 3,75 ppb de Bti (n=4 larvas por repetição). As larvas expostas à formulação do fungo na concentração de 1 8 conídios ml -1 apresentaram S 5 de 1 dia. No 3º dia de exposição havia menos de 18% de larvas sobreviventes e no 7º dia a média de sobrevivência foi menor que 1%. As curvas de sobrevivência apresentaram estaticamente diferentes do controle (P<,1) (Figura 3). Sobrevivência (%) Fungo ppb ,5 ppb ,75 ppb Figura 3 - Sobrevivência de larvas de A. aegypti expostas a somente Metarhizium anisopliae isolado ESALQ 818 na concentração 1 8 conídios ml -1 e em combinação com diferentes concentrações de Bti (n=4 larvas por repetição). No experimento com o fungo na concentração de 1 7 conídios ml -1, apresentou mais que 7% de larvas sobreviventes no 3º dia de exposição, No último dia de avaliação havia 36% de larvas sobreviventes e quando essa formulação foi combinada com a dose subletal de Bti de 7,5 ppb esse índice caiu para 31%. Com o aumento da concentração do fungo para 1 8 conídios ml -1 a média de sobrevivência no 3º dia foi menor que 6% e no último dia do período experimental havia 2% de larvas sobreviventes na formulação com fungo sozinho e 7% na formulação com fungo combinado com Bti (Figura 4) Fungo 1 7 Bti (7,5ppb) + Fungo (1 7 ) fungo (1 8 ) Bti (7,5ppb) + Fungo (1 8 ) Bti 7,5 ppb 3

4 Figura 4 - Sobrevivência de larvas de A. aegypti expostas a somente Metarhizium anisopliae isolado ESALQ 818 na concentração 1 7 e 1 8 conídios ml -1 e em combinação com dose subletal de Bti (n=4 larvas por repetição). Discussão O presente estudo mostra a suscetibilidade de larvas de A. aegypti a diferentes concentrações do fungo M. anisopliae e da bactéria B. thuringiensis var israelensis, de modo individual e combinado, e como estas concentrações podem influenciar na taxa de mortalidade destas larvas. Devido as dificuldades enfrentadas atualmente em função do surgimento de resistência de insetos aos produtos químicos, cresce o interesse pelo desenvolvimento de agentes de controle biológico com o objetivo de encontrar alternativas ao combate de mosquitos vetores de doenças (WHO, 29). Dentre os potenciais agentes para o controle do A. aegypti destacam-se a bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) e o fungo filamentoso M. anisopliae. Deste modo, o presente estudo analisou as respostas das larvas de A. aegypti linhagem Rockefeller a combinações de doses subletais de Bti com duas concentrações do isolado de M. anisopliae (ESALQ 818). Alguns inseticidas podem interferir nos processos infecciosos e viabilidade de microorganismos, portanto, para utilização conjuntas de agentes de controle, como bactérias e fungos, torna-se necessária a investigação do efeito das toxinas da bactéria sobre a germinação e o crescimento vegetativo do fungo. Na atual pesquisa a presença de Bti no meio não influenciou na germinação e no crescimento vegetativo do M. anisopliae. Bactérias entomopatogênicas aplicadas ao controle microbiano de insetos destacam-se por apresentarem alta virulência, elevada capacidade invasora e pela produção de toxinas que debilitam e levam os insetos alvos à morte. Devido a sua característica de resistência diante de condições ambientais adversas, são consideradas viáveis a produção de agentes microbianos em escala comercial (COSTA et al., 21). O potencial de Bti como larvicida biológico foi testado por Kroeger et al. (1995) contra larvas de Anopheles, comprovando a ação entomopatogênica da bactéria e reduzindo a população do mosquito em 1% um dia após a aplicação do produto. No mesmo intuito, Espíndola et al. (28) avaliaram a eficácia do larvicida no controle de formas imaturas de A. aegypti em laboratório, em que foi obtida mortalidade de 98% para larvas de terceiro estádio. Os resultados obtidos neste estudo comprovam a eficácia de Bti como bioinseticida, causando a mortalidade de 1% das larvas de A. aegypti quando submetidas às concentrações de 6 e 3 ppb, apresentando o valor de S 5 de 1 dia. Nos tratamentos onde foram aplicadas as concentrações de 1 7 e 1 8 conídios ml -1 do fungo M. anisopliae, a taxa de mortalidade atingida assemelha-se aos resultados obtidos por Pereira et al. (29), demonstrando a patogenicidade do fungo filamentoso contras as larvas do A. aegypti. A capacidade entomopatogênica de M. anisopliae tem sido comprovada também contra adultos de A. aegypti (Scholte et al., 27; Paula et al., 211) e contra os mosquitos transmissores da malária e filariose, Anopheles gabiae e Culex quinquefasciatus (ALVES et al., 22; SCHOLTE et al., 23; SCHOLTE et al., 25; BUKHARI et al., 21). Mecanismos de ação integrada utilizando produtos de origem química e biológica tornaramse foco de pesquisas voltadas ao combate de insetos vetores. Larvas de A. aegypti foram submetidas a combinações do larvicida biológico Bti com o inseticida temephos por Andrade & Modolo (1991), e demonstraram que o uso integrado dos inseticidas reduziu o tempo de sobrevivências das larvas quando comparado aos tratamentos utilizando os produtos individualmente. Efeitos da combinação entre fungos entomopatogênicos e o inseticida permetrina foram recentemente pesquisados para o controle dos mosquitos transmissores da malária Anopheles funestus, A. arabiensis e A. gambiae. Os insetos previamente infectados com Beauveria bassiana ou M. anisopliae e logo após expostos à permetrina apresentaram taxas de mortalidade significativas quando comparados aos expostos somente à permetrina (FARENHORST et al., 29), enquanto a mortalidade dos mosquitos expostos somente ao fungo não foi observada. Em outro estudo, foram avaliados os efeitos do fungo impregnado em telas de janelas em conjunto com mosquiteiras tratadas com permetrina contra o mosquito Culex quinquefasciatus. Nesta pesquisa foi observada somente uma mudança de comportamento, tendo o mosquito reduzido significativamente a alimentação sanguínea (HOWARD et al., 21). Nos tratamentos utilizando a combinação de M. anisopliae e o inseticida biológico à base de Bti, foram identificadas concentrações subletais de Bti que não alteraram significativamente as taxas de sobrevivência das larvas, sendo estabelecidas as concentrações de 15, 7,5 e 3,75 ppb. 4

5 A combinação entre inseticida e entomopatógeno foi testada por Paula et al. (211) contra adultos de A. aegypti, evidenciando a redução de sobrevivência dos mosquitos após sua exposição a combinações de M. anisopliae e concentrações subletais do inseticida químico Imidacloprid, comprovando o efeito sinérgico entre os agentes testados. Pelizza et al. (21) demonstraram aumento da virulência do fungo entomopatogênico Leptolegnia chapmanii quando combinado com larvicida temefós e o Bti, tendo um aumento na taxa de mortalidade. Entretanto, no presente estudo não foi observado o aumento da taxa de mortalidade das larvas, já que os tratamentos utilizando o fungo M. anisopliae e Bti em combinação não apresentaram diferenças significativas quando comparada aos tratamentos com o fungo sozinho. Os resultados obtidos nos testes demonstram, portanto, que o Bti não apresentou ação aditiva nem antagonística sobre a virulência do fungo M. anisopliae. Tais resultados podem estar relacionados ao modo de ação dos dois agentes microbianos, já que o Bti atua na região intestinal da larva, havendo necessidade de sua ingestão para o início do processo infeccioso, e o fungo tem seu modo de ação iniciado no tegumento da larva. Deste modo, os resultados alcançados remetem a necessidade de trabalhos complementares em que os fatores responsáveis pela interação entre patógenos possam ser determinados para contribuir na eficiência do controle associado. E assim, com o intuito de aumentar a virulência do fungo a insetos vetores são necessárias pesquisas utilizando outras formulações do Bti disponíveis ou até mesmo o substrato da bactéria. Conclusão O Bti não afetou a germinação do M. anisopliae em meio líquido ou sólido. As larvas de A. aegypti foram suscetíveis ao Bti nas concentrações de 6 e 3 ppb. No entanto, as concentrações 15. 7,5 e 3,75 ppb foram subletais. A combinação do Bti com M. anisopliae causou mortalidade significativamente igual à formulação com fungo sozinho a larvas de A. aegypti. Estudos complementares devem ser realizados para melhoria da interação entre o Bti e o fungo visando aumentar a eficiência dos agente biológicos para o controle de culicídeos vetores de doenças. Referências - ALVES, S. B., ALVES, L. F. A., LOPES, R. B., PEREIRA, R. M., VIEIRA, S. A. (22) Potential of some Metarhizium anisopliae isolates for control of Culex quinquefasciatus (Dipt. Culicidae). Journal Entomology, 126: ANDRADE, C.F.S. & MODOLO, M. (1991) Susceptibility of Aedes aegypti larvae to temephos and Bacillus thuringiensis var. israelensis in integrated control. Rev. Saúde Pública 1991;25: BUKHARI, T., MIDDELMAN, A., KOENRAADT, C. J. M., TAKKEN, W. KNOLS, B. G. L. (21) Factors affecting fungus-induced larval mortality in Anopheles gambiae and Anopheles stephensi. Malaria Journal. 9 (22) COSTA, E. L. N., LUCHO, A. P. R., FRITZ, L. L., FIUZA, L. M. (21). Artrópodes e Bactérias entomopatogênicas. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento. 38: ESPINDOLA, C. B., GUEDES, R. N., SOUZA, R. C. P. (28) Avaliação da eficácia do Bacillus thuringiensis var. israelensis no controle de formas imaturas do Aedes (stegomyia) aegypti (linnaeus, 1762) em ambiente de laboratório. EntomoBrasilis. 1 (1): FARENHORST, M., FARINA, D., SCHOLTE, E. J., TAKKEN, W., HUNT, R. H., COETZEN, M., KNOLS, B. G. J. (28) African Water Storage Pots for the Delivery of the Entomopathogenic Fungus Metarhizium anisopliae to the Malaria Vectors Anopheles gambiae s.s. and Anopheles funestus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (6): FRANCESCHINI, M., GUIMARÃES, A. P., CAMASSOLA, M., FRAZZON, A. P., BARATTO, C. M., KOGLER, V., SILVA, M. V., DUTRA, V., NAKAZATO, L., CASTRO, L., SANTI, L., VAINSTEIN, M. H., SCHRANK, A. (21) Biotecnologia aplicada ao controle biológico. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, 23: HOWARD, A. F.V., N GUESSAN, R., KOENRAADT, C. J. M., ASIDI, A., FARENHORST, M., AKOGBÉTO, M., THOMAS, M. B., KNOLS, B. G. J., TAKKEN, W. (21) The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana reduces instantaneous blood feeding in wild multiinsecticide-resistant Culex quinquefasciatus mosquitoes in Benin, West Africa. Parasites & Vectors. 3 (87) KROEGER, A., HORSTICK, O., RIEDL, C., KAISER, A., BECKER, N. (1995) The potential for malaria control with the biological larvicide Bacillus 5

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