Revista Iberoamericana de Tecnología Postcosecha ISSN: Asociación Iberoamericana de Tecnología Postcosecha, S.C.

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1 Revista Iberoamericana de Tecnología Postcosecha ISSN: Asociación Iberoamericana de Tecnología Postcosecha, S.C. México Silva, Josenilda Maria da; Graças Ongarelli, Maria das; Saavedra del Aguila, Juan; Fumi Sasaki, Fabiana; Kluge, Ricardo Alfredo Métodos de determinação de clorofila em alface e cebolinha minimamente processadas Revista Iberoamericana de Tecnología Postcosecha, vol. 8, núm. 2, 27, pp Asociación Iberoamericana de Tecnología Postcosecha, S.C. Hermosillo, México Disponível em: Como citar este artigo Número completo Mais artigos Home da revista no Redalyc Sistema de Informação Científica Rede de Revistas Científicas da América Latina, Caribe, Espanha e Portugal Projeto acadêmico sem fins lucrativos desenvolvido no âmbito da iniciativa Acesso Aberto

2 MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE CLOROFILA EM ALFACE E CEBOLINHA MINIMAMENTE PROCESSADAS Josenilda Maria da Silva 1, Maria das Graças Ongarelli 2, Juan Saavedra del Aguila 3, Fabiana Fumi Sasaki 4, Ricardo Alfredo Kluge 5 1 Programa de Pós-graduação em Ciências Agrárias Laboratório de Irradiação de Alimentos - Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA), Universidade de São Paulo (USP), Avenida Centenário, 33 Cx. Postal 96, , Piracicaba-SP, Brasil. jmnilda@cena.usp.br; 2 Departamento de Ciências Biológicas, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ)/USP, Piracicaba, SP, Brasil. mgong@carpa.ciagri.usp.br 3 Engenheiro Agrônomo, MSc, Estudante de Doutorado do Programa de Pós-graduação em Fitotecnia, ESALQ, USP, Piracicaba, SP, Brasil. jsaguila@esalq.usp.br; 4 Engenheiro Agrônomo, MSc, Estudante de Doutorado do Programa de Pós-graduação em Fisiologia e Bioquímica de Plantas, ESALQ, USP, Piracicaba, SP, Brasil. fsasaki@esalq.usp.br; 5 Professor Associado do Departamento de Ciências Biológicas, ESALQ, USP, Piracicaba, SP, Brasil. rakluge@esalq.usp.br Palavras-chave: Lactuca sativa L., Allium schoenoprasum, processamento mínimo, pós-colheita. RESUMO Folhas de alface América e cebolinha Paulista foram colhidas e submetidas às etapas de seleção, sanitização e secagem. As duas espécies foram acondicionadas em sacos de polietileno e armazenadas sob temperatura de 5ºC e 9%UR, durante sete dias. As folhas de alface apresentaram menores valores das clorofilas e também apresentaram maior perda após sete dias de armazenamento. Comportamentos semelhantes dos valores da clorofila foram encontrados entre os diferentes métodos de análises estudados: Clorofilometria (unidade SPAD), Colorimetria (ângulo hue hº ) e Espectrometria (mg g -1 de folha fresca). METHODS OF DETERMINATION OF CHLOROPHYLL IN FRESH-CUT LETTUCE AND CHIVE Key words: Lactuca sativa L., Allium schoenoprasum, minimally processed, postharvest. ABSTRACT Leaves of America lettuce and Paulista chive were harvested and submitted to selection, sanitization and drying stages. The two species were conditioned in polyethylene bags and stored under 5ºC and 9%HR, during seven days. Lettuce leaf presented lower levels of chlorophylls and also showed higher losses of them after the sevenday storage period. Similar behavior chlorophyll was found among different methods of analysis: Chlorophylometry (unit SPAD), Colorimetric ( hº angle hue) and Spectrometry (mg g -1 fresh leaves). INTRODUÇÃO Na busca de obter uma vida saudável, as pessoas estão mudando seus hábitos alimentícios, acrescentando, ao seu dia a dia, o consumo de vegetais de diferentes espécies e com propriedades nutricionais complementares. Assim mesmo, o ritmo de vida atual obriga a destinar cada vez menor tempo às atividades de refeição, pelo qual o processamento mínimo de vegetais surge como uma resposta tecnológica a esta nova necessidade de um setor da sociedade (Saavedra del Aguila, J., 24). Do ponto de vista técnico, os produtos minimamente processados podem ser definidos como qualquer fruta ou hortaliça, ou combinação destas, que tenha sido fisicamente alterada, mas que permaneça no estado fresco. A idéia central é assegurar ao consumidor um produto sensorialmente ótimo, Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol 8(2):

3 conveniente, livre de micróbios e com seu valor nutricional similar ao produto intacto. Nos últimos anos vêm crescendo o interesse dos consumidores pelos produtos minimamente processados, esse aumento torna necessária a ampliação dos conhecimentos quanto às mudanças sofridas por esse tipo de produtos altamente perecível, sendo importante qualquer colaboração no sentido de oferecer ao consumidor um produto muito parecido ao fresco. As mudanças de pigmentação são muito importantes para a qualidade. As perdas da clorofila em folhosa constituem um fator de grande importância na qualidade dos produtos minimamente processados durante o período em que estão expostos na prateleira. De um modo geral, a modificação da cor está associada com o amadurecimento e é considerado um atributo chave juntamente com a textura, para determinar a qualidade comestível das folhosas. A modificação da cor pode ocorrer devido à degradação da clorofila, que por sua vez, desmascara pigmentos que já estão presentes. Esse processo de desverdecimento é também acompanhado pela síntese de novos pigmentos. As clorofilas exercem importantes funções além de captar luz na fotossíntese. Em alguns frutos a cor compõe um dos parâmetros mais importante na avaliação da qualidade pós-colheita, fornecendo informações como grau de amadurecimento, estado de conservação e nutrição mineral. Os principais fatores que afetam o grau de modificação dos pigmentos são luz e temperatura, a qual vai influenciar no processo de degradação das mesmas. Em muitos tecidos, a perda da clorofila é parte da transição dos cloroplastos, que contêm pigmentos carotenóides amarelos e vermelhos. Na natureza existem duas formas predominantes de clorofilas a e b, que diferem ligeiramente em estrutura e são encontradas na proporção de 2,5 a 3,5:1. São estruturas hidrofóbicas, portanto insolúveis em água, e sua principal função é converter energia luminosa em energia química, processo que ocorre nos cloroplastos (Eskin, 199; Streit et al., 25). Na determinação da clorofila pelos métodos convencionais existe o inconveniente dos tecidos vegetais serem destruídos, utilização de reagentes, além de requerer mãode-obra e tempo desde o preparo das amostras até as análises, necessitando em torno de quatro horas para determinar 2 amostras (Rodriguez et al., 1998). Ultimamente vem sendo utilizada uma nova técnica em que se pode determinar o teor de clorofila com o uso de equipamento não destrutivo (Clorofilômetro) e o tempo gasto fica em torno de 1 min para determinar as mesmas 2 amostras. O Minolta Chlorophyll meter RS-232, apresenta os resultados na unidade SPAD (Silicon Photo Diode), podendo ser correlacionado os valores encontrados com os valores da clorofila extraída pelos métodos convencionais (Reeves et al., 1993; Turne & Jund, 1991). Segundo esses autores, existe uma alta correlação entre os valores encontrados. Marquard & Tipton (1987), quando trabalharam com hortaliças, leguminosas, flores e frutas encontraram correlação de até,97 para r estatístico. Em seu trabalho com tomate, Rodriguez et al. (1998), utilizando o equipamento SAPD-51, relataram que foi encontrada uma alta correlação entre as unidades SPAD e a concentração da clorofila extraída. Concluíram então, que existe uma grande facilidade na utilização deste equipamento quanto ao tempo de determinação, recomendando este novo método. Este equipamento medidor de clorofila possui diodos que emitem luz a 65nm (vermehlo) e a 94nm (infravermelho). A luz em 65nm situa-se próxima dos dois comprimentos primários de ondas associados à atividade da clorofila (645 e 663nm). O comprimento de onda de 94nm serve como referência interna para compensar diferenças na espessura ou no conteúdo de água da folha ou que sejam devidas a outros fatores (Waskom et al., 1996). O princípio desse equipamento se baseia no fato de que parte da luz que chega na folha é absorvida pela clorofila e a outra parte entra em contato com a célula detectora do equipamento, onde é convertida em um sinal elétrico. A quantidade de luz captada pela célula é inversamente proporcional à quantidade de luz utilizada pela clorofila. Na célula, a quantidade captada pelo aparelho é processada e a absorbância é 54 Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol 8(2):53-59

4 quantificada em valores dimensionais que vão de a 199, na unidade SPAD, que será maior quanto mais verde for a folha (Krugh et al., 1994; Argenta et al., 21). O objetivo do presente trabalho foi avaliar o comportamento da mudança da cor e o teor de clorofila em folhas de alface e cebolinha minimamente processadas, armazenadas durante sete dias sob temperatura de 5ºC e 9%UR utilizando três diferentes métodos: Espectrometria, Clorofilometria e Colorimetria. MATERIAL E MÉTODOS Local, Material Vegetal e Processamento Mínimo. Folhas de alface do cultivar Americana e cebolinha do cultivar Paulista, procedentes da horta do Departamento de Produção Vegetal da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz ESALQ/USP, foram colhidas e conduzidas imediatamente ao Laboratório de Pós-colheita de Frutas e Hortaliças, onde foram selecionados quanto à ausência de danos mecânicos e infecções visíveis. As etapas de processamento mínimo foram realizadas a uma temperatura de 18ºC, tendo sido utilizados equipamentos de proteção individual (EPI), como luvas, gorros, máscaras, aventais e botas, para sua perfeita realização. A lavagem inicial foi realizada com água corrente, destacando cada folha para retirada da sujidade provinda do campo. A desinfecção foi realizada com o produto Suma- D29/Diversey-Lever, produto líquido à base de sabões e óleo vegetal, próprio para folhosa. Foi usada uma concentração de 5 ppm, durante 1 minutos para retirada e/ou diminuição de microrganismos patogênicos provindos do campo. O enxágüe foi com a passagem das folhas em duas bandejas com água limpa. Em seguida as folhas ficaram em escorredor para a saída do excesso de água. As folhas de alface foram acondicionadas inteiras em sacos de polietileno e as de cebolinhas retiradas as duas extremidades, em seguida armazenadas em câmara sob temperatura de 5ºC±1ºC e 9±5%UR, durante sete dias, sendo analisadas nos períodos zero, 2, 5, e 7 dias. Cada espécie foi representada por quatro repetições com cinco folhas. Determinação da clorofila métodos utilizados Espectrometria. O teor de clorofila foi determinado mediante metodologia convencional com uso de Espectrofotômetro de Fluorescência, segundo método descrito por Arnon (1949), usando como extrator acetona a 8%, com leitura direta a 645 e 663nm e os resultados expressos em µg g -1 de folha fresca. Clorofilometria. Foi utilizado o Minolta Chlorophyll meter modelo RS-232 e os resultados expressos na unidade SPAD (Silicon Photo Diode). Colorimetria. Foi utilizado o Minolta Chroma meter modelo CR-3 e os resultados expressos em ângulo h, onde h o = 18 o + tag -1 (b * /a * ), de acordo com McGuirre (1992). Para folhas de alface as leituras foram realizadas na parte da frente e porção mediana oposta e para folhas de cebolinha as leituras foram nas duas extremidades deixando-se ± 4 cm de cada extremidade. Análise Estatística. O delineamento experimental empregado foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 3x4, no qual os fatores estudados foram três metodologias de medir as clorofilas e quatro tempos de armazenamento, incluindo o tempo zero com quatro repetições ou saquinhos por tratamento. Os resultados das análises foram submetidas à análise da diferença mínima significativa (d.m.s.) em teste de comparações múltiplas em que as diferenças entre dois tratamentos maiores que a soma de dois desvios padrões foram consideradas significativas a 5% de probabilidade. RESULTADOS E DISCUSSÃO A Figura 1 revela os teores das clorofilas a, b e total quando determinados pelo Espectrofotômetro de Florescências. Observa-se ocorrência da degradação destas durante o armazenamento para as duas espécies em estudo, com perda maior para folhas de alface após sete dias de Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol 8(2):

5 armazenamento. As perdas observadas podem ser consideradas pequenas, podendo ser atribuídas principalmente à temperatura de armazenamento utilizada neste experimento, visto ser este um dos fatores mais importante na degradação destes pigmentos (Eskin, 199; Lisiewska et al., 1997). Clorofila (µg g -1 de folha fresca) Dias de armazenamento Clorofila (µg g -1 de folha fresca) Dias de armazenamento Clorofila a Clorofila b Clorofila Total Figura 1. Teores de clorofila a, b e total, determinados no Espectrofotômetro, em folhas de (A) alface e (B) cebolinha minimamente processadas e armazenadas a 5ºC e 9%UR. Barras verticais representam o desvio padrão da média (n=4). Foi encontrado um comportamento semelhante para as clorofilas a, b e total durante todo experimento. Observa-se que para todos os métodos estudados ocorreu um pequeno aumento das clorofilas entre o 5 o e 7 o dia, o que pode ser justificado por uma desuniformidade de algumas folhas no ponto de colheita (Figuras 1, 2 e 3). Os valores mínimos encontrados para as folhas de alface e cebolinha minimamente 56 Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol 8(2):53-59

6 processadas com o uso do Clorofilômetro foram de aproximadamente 16 e 45 e máximo de 2 e 49 (unidade SPAD), respectivamente. Nas três metodologias analisadas, as folhas de alface apresentaram menores valores de clorofila, revelando maior taxa de degradação nos primeiros dois dias de armazenamento. Clorofila (Unidades SPAD Dias de armazenamento Cor (Ângulo hue - hº Dias de Armazenamento Alface Cebolinha Figura 2. Valor de clorofila determinada (A) no clorofilômetro (Unidades SPAD) e Cor da folha determinada (B) no colorímetro (ângulo hue hº); de folhas de alface e cebolinha minimamente processados e armazenados a 5ºC e 9%UR. Barras verticais representam o desvio padrão da média Uma correlação entre os diferentes métodos utilizados pode ser observada na Figura 3. Rodriguez et al. (1993), em seu trabalho com folha de tomate encontrou uma alta correlação entre os valores da unidade SPAD e clorofila extraída, recomendando o uso do clorofilômetro para este fruto. No presente trabalho foi encontrada uma correlação maior para cebolinha (Tabela 1). Para as duas espécies uma maior correlação foi encontrada Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol 8(2):

7 quando comparado os valores entre o uso dos equipamentos Minolta Chlorophyll meter RS- 232 (unidade SPAD) e Minolta Chroma meter CR-3 (ângulo hº ). Esses resultados podem ser considerados vantajosos tendo em vista a diferença de preço dos referidos aparelhos. Clorofila Tempo de armazenamento (dias) 2 15 Clorofila 1 5 Dias de armazenamento Clorofilômetro Colorímetro Espectrofotômetro Figura 3. Comportamento da degradação da clorofila em folha de: (A) alface e (B) cebolinha, minimamente processado, avaliados por três métodos diferentes (Clorofilômetro= Unidade SPAD; Colorímetro= ângulo hº; Espectrofotômetro= µg 1mg -1 ). A pequena perda das clorofilas verificadas pode ser atribuída à baixa temperatura e umidade relativa alta de armazenamento utilizada (5ºC e 9%UR), estas condições de armazenamento utilizadas no presente experimento são as indicadas para comercialização destas folhosas. CONCLUSÕES Foi encontrado um comportamento semelhante entre os valores das clorofilas medidos nos diferentes métodos estudados. As folhas de alface minimamente processadas apresentaram menores valores de clorofila. 58 Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol 8(2):53-59

8 AGRADECIMENTO Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São (FAPESP) pelas bolsas de estudo ao nível de Doutorado do terceiro e quarto autor, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa de produtividade em Pesquisa do último autor. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Argenta, G. et al. Relação da leitura do clorofilômetro com os teores de clorofila extraível e de nitrogênio na folha de milho. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal. v.13, n.2, p , 21. Arnon, D.I. Copper enzimes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology, v.24, p.1-15, Eskin, N.A.M. Biochemistry of Foods. 2 nd ed.california, 199, 557p. Krugh, B.; bichham, L.; miles, D. The solidstate chlorophyll meter, a novel instrument for rapidly and accurately determining the chlorophyll concentrations in seedling leaves. Maize Genetics Cooperation Newsletter, v.68, p.25-27, Lisiewska, Z. et al. Effect of conditions and time of storage on technological quality changes of parsley leaves. Folia Horticulturae, v.9, n.2, p.21-29, Marquard, D.R; tipton, J.L. Relationship between extractable chlorophyll and on in situ method to estimate leaf greenness. HortScience, v.22, p , McGuirre, R.G. Reporting of objective color measurents. HortScience, v.27, p , Reeves, W.D. et al. Determination of wheat nitrogen status with a handheld chlorophyll meter. Influence of management practices. Journal of Plant Nutrition, v.16, n.5, p , Rodriguez, M.N.R. et al. Estimación de la concentración de nitrogenio y clorofila en tomate mediante un medidor portátil de clorofila. Revista Terra, v.16, n.2, p , Saavedra del Aguila, J. Processamento mínimo de rabanete: estudos físico-químicos, fisiológicos e microbiológicos p. Dissertação(Mestrado em Fitotecnia) ESALQ/USP. Streit. N.M. et al. As Clorofilas. Ciência Rural, Santa Maria, v.35, n.3, p , 25. Turner, F.T.; jund, M.F. Chlorophyll meter to predict nitrogen topdress requirement for semiwardf rice. Agronomy Journal, v.83, p , Waskom, R.M. et al. Monitoring nitrogen status of corn with a portable chlorophyll meter. Communications in Soil Science and Plant Analysis. v.27, p , Rev. Iber. Tecnología Postcosecha Vol 8(2):