Curso: Medicina Veterinária Disciplina: Virologia III. Prof. a Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia. Retroviridae. Transcriptase reversa (RT)

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1 Curso: Medicina Veterinária Disciplina: Virologia III Prof. a Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia Retroviridae Transcriptase reversa (RT)

2 RETROVÍRUS Infectam mamíferos e aves causando: doenças malignas : leucemia, linfomas, sarcomas doenças neurológicas : encefalites, paralisia doenças hematológicas : anemias imunodeficiência 1ª Classificação: PATOGENIA ONCOVÍRUS: Vírus da leucose Aviária (ALV) SPUMAVÍRUS Vírus da leucose bovina (BLV) Vírus da leucemia de Felinos (FeLV) Vírus linfotrópico T humano (HTLV-I e II) LENTIVÍRUS: Vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) Vírus Maedi Visna dos ovinos (MVV) Vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) Vírus da imunodeficiência felina (FIV) Vírus da imunodeficiência bovina (BIV) Vírus da imunodeficiência de símios (SIV) Vírus da imunodeficiência humana (HIV- I e II)

3 Vírus da família RETROVIRIDAE de importância em medicina veterinária Sub-família Gênero Espécie Orthoretrovirinae Alpharetrovirus Vírus da leucose aviária Betaretrovirus Deltaretrovirus Vírus da adenomatose pulmonar dos ovinos (Jaagsiekte JSRV) Vírus da leucemia bovina (BLV) Epsilonretrovirus Gammaretrovirus Lentivirus Vírus da leucemia felina (FeLV) Vírus da anemia infecciosa de equina (AIE) Vírus da imunodeficiência bovina (BIV) Vírus da imunodeficiência felina (FIV) Vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) Vírus Maedi Visna dos ovinos (MVV) Spumaretrovirinae Spumavirus

4 FAMÍLIA: RETROVIRIDAE Diâmetro: nm protease (PRO) transcripase reversa (TR) integrase (IN) gp 70 (SU) p15e (TM) superfície transmembrana p15 (MA) p27 (CA) p10 (NC) + RNA genome proteína da matriz proteína de capsídeo proteína de ligação ao ácido nucleico (NC) genoma diplóide: 2 moléculas de RNA ss (+) Estrutura da partícula de FIV Lecollinet & Richardson Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 31( 2 3): , 2008.

5 Ag grupoespecífico GAG POL proteínas do envelope ENV Pr55 enzimas gp160 p16 p25 p14 gp135 gp45 p12 p29 Organização genômica dos retrovírus Proteínas acessórias: vif - fator de infectividade viral rev regulador da expressão viral Orf-A Viruses, 2011, 3: Organização genômica do Virus da imunodeficiência Felina

6 Vírus maduro Vírus imaturo Replicação dos Retrovírus Nature Reviews Microbiology 10, (June 2012) doi: /nrmicro2783

7 Adsorção do vírus à célula Penetração do vírus na célula CD134 gp70 FIV TM SU CD134 CD134 linfócitos Th ativados de felinos Monócitos/macrófagos Células dendríticas CXCR4 receptor de quimiocina linfócitos T ativados linfócitos B monócitos CXCR4 Receptores de quimiocionas funcionam como co-receptores para a adsorção do vírus

8 Retrovírus Persistência da infecção em seus hospedeiros: Integração do DNA proviral ao genoma celular vírus escapa dos mecanismos de defesa do hospedeiro e preserva o seu genoma Vírus acumulam alta taxa de mutação durante o processo de replicação devido a falhas da transcriptase reversa em corrigir as novas sequências de nucleotídeos variabilidade genética e antigênica permitindo ao vírus escapar do sistema imunológico do hospedeiro Mutação no genoma Variabilidade genética: aparecimento de variantes replicação de variantes antigênicas na presença de anticorpos neutralizantes V1 Ac-V1 Ac tipo-específicos neutralizantes V2 Ac-V2

9 Vírus da leucose bovina (bovine leukemia virus - BLV) Deltaretrovírus Agente da LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA infecta LINFÓCITOS B CD5 + Mais comum em gado leiteiro do que em animais de corte faz parte da lisa de doenças da Organização Mundial de Sanidade Animal OIE sendo importante no comércio de animais entre países. Aumento de linfonodo mandibular Aumento de linfonodo mandibular célula com provírus tumores na região retrobulbar Curso clínico da infecção pelo BLV Viruses 2014, 6, ; doi: /v Linfocitose persistente (expansão clonal de linfócitos B) 30% Linfossarcoma animais soropositivos que desenvolvem tumores neoplásicos malignos (4 e 8 anos de idade) 1 5%

10 região X,: localizada entre o envelope e a extremidade 3 da repetição terminal (LTR long terminal repeat) Regulação pós-transcricional e transformação celular Estrutura básica de um provírus do VLB sendo representados os genes estruturais Gag, Pol e Env, RNA transcritos e proteínas codificadas. Fonte: GILLET et al. (Retrovirology, 4(18): 4, 2007). Parece existir uma relação entre o MHC bovino (BoLA) e a infecção pelo BVL: bovinos da raça holandesa com variações de alelos que podem determinar diferentes padrões de suscetibilidade

11 Transmissão ocorre principalmente entre animais do mesmo rebanho: é necessário um contato mais próximo entre os animais. Transmissão: 1µL de sangue de um animal com linfocitose persistente Para evitar a possibilidade de transmissão para o neonato através do colostro ou leite de vacas infectadas preconiza-se o aquecimento desta secreção láctea a 56ºC por 30 minutos, ou a utilização de um banco de colostro proveniente de vacas negativas, conservado a 20ºC. A pasteurização inativa o vírus.

12 Leucose Bovina - Diagnóstico laboratorial Detecção de Ac no soro: - Identificação de portador - Triagem de rebanhos Animais (+) >6 meses: portadores e potenciais fontes de infecção Teste de Imunodifusão em Gel de Ágar (IDGA) p24 + gp51 (OFICIAL) ELISA (aceito para trânsito de animais entre países) (+) (-) (+) (+) (-) (+) PCR: detecção do DNA proviral amostra de sangue com anticoagulante DNA extraído de leucócitos não é muito usado na rotina Confirmação do status de bezerros nascidos de mães positivas Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. vol.40 no.5, 2003

13 Vírus da Leucemia Felina (FeLV) Gammaretrovírus 4 subgrupos: FeLV-A, FeLV-B, FeLV-C e FelV-T que diferem: sequência do gene env (proteína SU) usam diferentes receptores celulares tropismo celular FelV-A: transmissão do vírus entre animais (100% gatos infectados) Pode causar linfomas (células T), mas geralmente promove lesões moderadas na ausência de outros subgrupos FeLV-B: associado a linfomas FelV-C: causa anemia aplástica FelV-T: associado com imunossupressão Linfoma: inserção do genoma do FeLV próximo ao oncogene celular (myc) ativação do gene

14 Vírus da Leucemia Felina (FeLV) Transmissão: Horizontal: Mordedura (saliva 10 6 partículas virais / ml ) urina, fezes menos provável ambiente social: superpopulação, utilização conjunta de bebedouros e comedouros Iatrogênica: transfusão de sangue, seringas e agulhas, instrumentos cirúrgicos, Vertical: transplacentária, leite O contato permanente com gatos de rua ou a introdução de animais de grupamentos infectados pelo FeLV facilita a disseminação do vírus Fatores de risco: macho, idade, acesso a rua

15 Vírus da Leucemia Felina (FeLV) - Patogenia Infecção Via oronasal Replicação no tecido linfóide da orofaringe Viremia linfócitos, monócitos Glândulas salivares 3 semanas Medula óssea nódulos linfáticos baço timo 10 6 partículas virais / ml Resposta imune elimina o vírus não há disseminação do vírus Infecção regressiva Infecção progressiva Infecção RNA viral (RT-qPCR) replicação ativa DNA proviral (PCR) p27 (Elisa - soro) Antigenemia Isolamento viral CC Abortiva negativo negativo negativo negativo Regressiva nível baixo ou não detectável positivo (medula óssea/soro) negativo após 16 semanas de infecção Progressiva níveis elevados níveis elevados positivo negativo Não há transmissão do vírus viremia persistente transmissão do vírus doença 85% dos gatos que se recuperam da infecção natural tem vírus na medula óssea latência??? Hartmann K. Viruses 2 012, 4:

16 Vírus da Leucemia Felina (FeLV) Diagnóstico laboratorial: Teste de triagem: Elisa para detecção da proteína de capsídeo viral p27 a partir de soro ou plasma- antigenemia positivo a partir da 4ª semana pós-infecção Detecção do genoma viral: RNA (RT-qPCR) DNA proviral (PCR) qpcr = PCR em tempo real (quantitativo)

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18 Feline Lymphoma and a High Correlation with Feline Leukaemia Virus Infection in Brazil T. G. Cristo et al J. Comp. Path. 2019, Vol. 166, Lymphoma is the most important haemopoietic tumour in cats and has been associated with feline leukaemia virus (FeLV) infection. In Brazil, no studies have established a correlation between FeLV infection and lymphoma. The aim of this study was to characterize lymphomas arising in cats in Brazil anatomically and microscopically, and to correlate these data with FeLV infection as determined by immunohistochemistry for the FeLV gp70 antigen. Fifty-three cats with lymphoma were evaluated. The mean age of junior, prime, mature, senior and geriatric cats was 1.65 years, 4.34 years, 8 years, years and 15.5 years, respectively. The anatomical types of lymphoma were multicentric (43.4%, 23/53), mediastinal (33.96%, 18/53), renal (11.32%, 6/53), hepatic (5.66%, 3/53), nodal (3.77%, 2/53) and alimentary (1.89 %, 1/53). The histological types were small noncleaved-cell (33.96%, 18/53), mixed diffuse (22.64%, 12/53), immunoblastic (15.11%, 8/53), lymphoblastic (11, 32%, 6/53), small lymphocytic (9.43%, 5/53), small cleaved-cell (3.77%, 2/53) and large cell lymphomas (3.77%, 2/3). Immunopositivity for FeLV was observed in 56.6% (30/53) of the samples. FeLV positivity was equally distributed between the genders, but predominated in junior and prime cats. The degree of association between lymphoma and FeLV infection in Brazil was higher than that found in other countries, demonstrating the need to prevent and control the factors associated with infection.

19 Vírus da Leucemia Felina (FeLV) Prevenção: Identificação e isolamento de felinos contaminados Vacina (inativada) LEUKOCELL 2 possui licença vigente para ser comercializada no Brasil (COORDENAÇÃO DE FISCALIZAÇÃO DE PRODUTOS VETERINÁRIOS, 2011) Animais vacinados: Vacinação previne o desenvolvimento de antigenemia persistente não há transmissão do vírus Animais vacinados são menos propensos a desenvolver doenças associadas ao FeLV e têm maior sobrevida Vacina não impede a mínima replicação viral que resulta na integração do provirus animais vacinados apresentam DNA proviral e RNA após desafio.

20 Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV) Lentivirus Prevalência no Brasil: 11,7% a 37,5% idade, gênero, moradia, acesso a rua Tropismo: Linf T CD4, Linf T CD8, Linf B, células dendríticas, monócitos, macrófagos, astrócitos Transmissão: mordedura (saliva 10 6 partículas virais / ml) sangue, seringas e agulhas, instrumentos cirúrgicos, vertical e sexual: não é comum na natureza Reservatório gato assintomático virêmico

21 Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV) 7 subtipos (gene gag e regiões V3-V5 do gene env) Phylodynamics of the Brazilian feline immunodeficiency virus Cano-Ortiz et al Infection, Genetics and Evolution 55 (2017) Árvore filogenética de 73 sequências de FIV subtipo B do Brasil Árvore filogenética de sequências de FIV (subtipos A, B, C, D, E, F) A e B: prevalentes mundialmente FIV-B: divididas em 5 clados distintos sugerindo diferentes entradas do FIV no Brasil entre 1981 e 1991

22 Blood samples were collected from nine domestic cats (Felis catus domesticus) from the city of São Luís, Maranhão State, Brazil. All samples were positive in a rapid immunochromatographic test (SNAP Combo FeLV Ag/FIV Antibody Test) and in a polymerase chain reaction (PCR) assay. Phylogenetic analysis showed that six samples clustered within subtype B, one within subtype A, and two did not cluster with any known subtype. This is the first report on the genetic diversity of FIV in the city of São Luís and the first report of subtype A in Brazil.

23 Estágios clínicos da infecção pelo FIV: Fase aguda: 4 6 semanas pós infecção Febre, Leucopenia ou não apresentam sintomas Portador assintomático Linfoadenopatia generalizada persistente Complexo relacionado à AIDS: gengivites,estomatites, periodontites Inf. respiratórias, doenças entéricas Síndrome da imunodeficiência adquirida : depleção linfoide generalizada Inf. de natureza oportunista ou neoplasia maligna

24 TCD4+ < 200 células/ L AIDS (normal / L) Curso clínico da infecção por FIV Lecollinet & Richardson Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 31( 2 3): , 2008.

25 Mais efetivo no controle de infecções secundárias Zidovudina (AZT) Lamivudina (3TC)

26 Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV) Diagnóstico laboratorial: Detecção de anticorpos: Elisa A maioria dos felinos FIV infectados desenvolvem anticorpos anti-fiv 60 dias após a infecção Cerca de 15% dos animais infectados podem ser soronegativos Detecção do DNA proviral PCR (leucócitos) Detecção do RNA viral RT-PCR (plasma) Prevenção: Identificação e isolamento de felinos contaminados Vacina?

27 Prevalence of and factors associated with feline leukemia virus (FeLV) and feline immunodeficiency virus (FIV) in cats of the state of Santa Catarina, Brazil Biezus et al Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 63 (2019) A cross-sectional study was conducted in 274 cats for determination of FeLV antigenemia and FIV seropositivity and factors associated with those infections in cats presented at the Veterinary Hospital of the Santa Catarina State University - UDESC (Brazil). Apparent prevalence for sick cats at the hospital population was 28.41% (95%CI %) for FeLV, 7.65% (95%CI %) for FIV and 2.18% (95%CI %) for both viruses. For healthy cats, the apparent prevalence was 9.89% (95%CI %) for FeLV, 2.20% (95%CI %) for FIV by immunoassay (ELISA). Average age for FeLV- and FIV-positive individuals was and months, respectively. Behavior such as aggressiveness and sex (male) were both associated with increased odds of result positivity test for FeLV and FIV; older animals were also associated with FIV test results. A very small proportion of the animals were vaccinated against FeLV and none against FIV. Most of the animals were adopted from shelters or rescued from streets, living with multiple cats that had access to outdoors. The high prevalence of FeLV suggests a need for better control strategies against this disease.

28 Vírus da Anemia Infecciosa Equina (EIAV) febre dos pântanos (swamp fever) Transmissão: células sanguíneas infectadas - Picada de insetos hematófagos (até 30 min após alimentação em um cavalo virêmico) mosca-de -estábulo (Stomoxys calcitrans) mosca do cavalo (Tabanus sp) - Artificial: material cirúrgico infectado aparadores de casco, arreio, espora pt.wikipedia.org - Égua potro: intra-uterina Colostro Sintomas: Febre (período de Viremia) - TNF- e IL-1 Anemia (supressão da eritropoese / eritrofagocitose) trombocitopenia: aumento de TNF- que inibe a produção de plaquetas Células alvo: monócitos / macrófagos Não infecta Linfócitos T Doença de notificação obrigatória

29 EIAV Infecção recorrente: Variação antigência nos epítopos neutralizantes das glicoproteínas de superfície do vírion Replicação destas variantes antes do desenvolvimento da resposta imune Persistência Viral: Controle da viremia não é acompanhado da eliminação das células persistentemente infectadas V1 V2 Ac-V1 Ac-V2 Ac tipo-específicos neutralizantes Isel et al Vet Clin Equine 30:

30 Controle: Identificação dos cavalos infectados : - Segregação: uma barreira espacial em torno de 200 metros entre os animais positivos e os negativos pode reduzir a probabilidade de transmissão - Sacrifício Transmissão materno fetal Controle de vetores Diagnóstico laboratorial : Detecção de Ac: Teste de Imunodifusão em Gel de Ágar (IGDA) ou Teste de Coggins PCR: detecção do DNA proviral amostra de sangue com anticoagulante DNA extraído de leucócitos SC = Soro Controle Positivo Ag = Antígeno (p26) 1 e 4 Animais Positivos 2 e 3 Animais Negativo Confirmar infecções recentes antes da soroconversão Confirmação do status de potros nascidos de mães positivas Dong et al Arch Virol 157:

31 Spatial distribution and risk factors for equine infectious anaemia in the state of Mato Grosso, Brazil Barros et al 2019 Rev Sci Tech. 2018;37(3): doi: / The prevalence of equine infectious anaemia (EIA) in the three biomes of the state of Mato Grosso (Amazon, Cerrado and Pantanal) was estimated. Serum samples were collected from 3,858 equines in 1,067 herds between September and December The agar gel immunodiffusion (AGID) assay was used to detect EIA virus antibodies, and if a herd contained a seropositive animal it was classified as a focus. The prevalence rates were 17.2% (95% confidence interval [CI]: %) for herds and 6.6% (95% CI: %) for animals. The Pantanal region showed the highest prevalence rates: 36.1% (95% CI: %) for herds and 17.0% (95% CI: %) for animals. The spatial distribution of relative risk was calculated according to the kernel density, which revealed three major clusters with the highest prevalence rates occurring in the north-western(amazon biome), north-eastern (Cerrado biome) and southern (Pantanal biome)regions. A high spatial correlation was found among ranches, with high intra-herd prevalence rates located in the Amazon and Cerrado biomes, but the highest spatial correlation with EIA foci was found in the Pantanal biome. Variables related to ranch management, reflecting human influence, were associated with positive equines. Based on the results, it can be concluded that EIA is present in all biomes of the state, and that the risk factors are associated with human interference in the transmission process. Given this situation, the EIA control programme should be re-evaluated and more prophylactic measures should be adopted to control the disease.

32 Lentivírus de pequenos ruminantes (SRLV small ruminant lentivirus): Vírus da Artrite-Encefalite caprina (CAEV) animais adultos artrite progressiva (complexos imunes) cabritos < 6 meses encefalomielite desmielinizante Maedi Visna (MVV) pneumonia progressiva de ovinos Maedi significa dispneia caracterizada por pneumonia intersticial progressiva crônica Visna significa desorientação, caracterizada por encefalite degenerativa causam doenças degenerativas progressivas, lentas em caprinos e ovinos tropismo por células da linhagem monocítica-fagocitária Reservatório e fonte de infecção: animais contaminados Caprinos: transmissão ocorre geralmente por via digestiva ingestão de colostro e leite contaminados Ovinos: transmissão por via digestiva ingestão de colostro e leite contaminados via respiratória mais frequentemente nos períodos de confinamento

33 Lentivírus de pequenos ruminantes (SRLV): Perdas econômicas: diminuição da vida produtiva e da produção leiteira retardo no crescimento das crias desvalorização comercial dos produtos de criatórios com animais positivos despesas com programas de controle Diagnóstico laboratorial Detecção de Anticorpos: teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA)