Key words: otitis externa, otic gel, florfenicol, terbinafine, bethametasone, dog, acute.

Transcrição

1 Eficácia do uso de um gel ótico contendo florfenicol, terbinafina e acetato de betametasona (Osurnia ) pela via tópica em cães com otite externa aguda ou exacerbação aguda da otite externa recorrente no Brasil: um estudo multicêntrico. Lucas R 1, Tadini BS 2, Doucette KP 3, Balda AC 4, Castro RCC 5, Carvalho FCG 6, Farias MR 7, Fernandes JI 8, Gerardi DG 9, Larsson Jr CE 10, Lima RKR 11, Lucarts LEB 12, Martins GC 13, Maruyama S 14, Ramadinha RHR 15, Salzo PS 16, Seixas G 17, Yazbek AVB 18, Shigemoto T 2, Recupero C Dermatoclínica, São Paulo, SP/Brasil, 2. Elanco Saúde Animal, São Paulo, SP/Brasil, 3. Elanco Saúde Animal, Greenfield, IN/EUA, 4. Faculdades Metropolitanas Unidas, São Paulo, SP/Brasil, 5. Provet Medicina Veterinária Diagnóstica, São Paulo, SP/Brasil, 6. Universidade de Vassouras, Vassouras, RJ/Brasil, 7. Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, PR, Brasil, 8. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ/Brasil, 9. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS/Brasil, 10. Universidade de São Paulo, São Paulo, SP/Brasil, 11. Canis e Catus Especialidades, Natal, RN/Brasil, 12. Hospital Veterinário Pet Care, São Paulo, SP/Brasil, 13. CentroVet, Belo Horizeonte, MG/Brasil, 14. Clin Dog Clínica Veterinária, Cuiabá, MT/Brasil, 15. Animália Clínica Veterinária, Rio de Janeiro, RJ/Brasil, 16. Universidade Metodista de São Paulo, São Bernardo do Campo, SP/Brasil, 17. Dermatopet, Brasília, DF/Brasil, 18. Centro Veterinário Alpha Conde, Barueri, SP/Brasil. Resumo Introdução A otite externa é uma das doenças mais comuns na rotina clínica de cães, porém, seu tratamento com os protocolos convencionais na mão dos tutores nem sempre é fácil, o que impacta no seu sucesso. Objetivos Observar a eficácia de florfenicol, terbinafina e acetato de betametasona (Osurnia ) em cães com otite externa ou exacerbação aguda de otite externa recorrente da rotina clínica dermatológica em todo o território brasileiro e avaliar a experiência dos tutores e médicos veterinários com uma nova maneira de tratamento. Animais 69 cães de tutores, pacientes de 16 médicos veterinários formadores de opinião em dermatologia, foram tratados e acompanhados durante 28±2 dias. Métodos Todos os cães foram tratados pelo médico veterinário investigador com Osurnia, duas aplicações com uma semana de intervalo. A otite externa foi avaliada por um escore citológico qualitativo e quantitativo nos dias 0 e 28±2 e por um Escore Clínico Total (ECT) nos dias 0, 7±2 e 28±2. Experiência dos tutores e dos médicos veterinários foi avaliada por um questionário de satisfação. Um total de 59 cães foram incluídos nas análises estatísticas, todos de acordo com os critérios de inclusão e exclusão. Resultados A presença e contagem de microrganismos e neutrófilos reduziram consideravelmente na citologia do dia 28±2 em comparação ao dia 0. Todos os parâmetros clínicos individualmente melhoraram significativamente (p<0,05) nos dias 7±2 e 28±2 em relação ao D0, assim como o ECT e a dor. Os tutores e médicos veterinários investigadores consideraram a facilidade de uso e a melhora da sintomatologia como fatores principais de sucesso do tratamento. Conclusões Osurnia, um gel ótico adaptável, aplicado duas vezes com intervalo de uma semana, é uma valiosa opção para o tratamento da otite externa aguda e a exacerbação aguda da recorrente em cães no Brasil, assim como já comprovado no mundo. A facilidade de uso e sua praticidade oferecidas pela formulação em gel exclusivo, que permanece no local da aplicação, são dois fatores importantes que auxiliam na melhor adesão e sucesso do tratamento, inclusive como primeira escolha terapêutica nos casos agudos. Palavras chave: otite externa, aguda, gel ótico, florfenicol, terbinafina, betametasona, cão. Abstract Background Otitis externa, a common general practice condition diagnosed in canines, can be difficult to treat with conventional owner-administered otic products thereby influencing overall treatment success. Objectives To evaluate efficacy of an adaptable otic gel, containing florfenicol, terbinafine and betamethasone acetate (Osurnia ) for the treatment of acute or recrudescence otitis externa cases in dermatology practices in Brazil including the veterinary and pet owner experience. Animals Sixty-nine client-owned dogs were treated twice, one week apart, after a thorough ear canal cleaning only before the first application. Dogs were monitored for 28±2 days. Methods Otitis externa was evaluated by veterinarians on Days 0 and 28±2 with a qualitative and quantitative cytology score, and a total clinical score (TCS) comprised of four otic clinical signs on Days 0, 7±2 and 28±2. A satisfaction questionnaire evaluating veterinarian and pet owner experience was completed. Fifty-nine cases were included in the efficacy dataset which were compliant with inclusion and exclusion criteria. Results Cytological presence and enumeration of microorganism and neutrophils decreased at the Day 28±2 assessment when compared with Day 0. All individual clinical parameters and the TCS significantly decreased (p<0.05) at Days 7±2 and 28±2 compared with Day 0. Veterinarians and pet owners recognized improvement of clinical signs and its superiority in ease of treatment compared to previous products. Conclusions Osurnia, a two dose adaptable otic gel is a valuable option for treatment of canine acute or recrudescent otitis in Brazil, which may improve owner compliance, including first line therapeutic option in acute cases. Key words: otitis externa, otic gel, florfenicol, terbinafine, bethametasone, dog, acute.

2 1. Introdução As otopatias são uma das doenças mais comuns na rotina clínica de cães com prevalência de 10 a 20% em todo o mundo, incluindo o Brasil 1-4. A otite externa (OE) é a manifestação mais frequente e se apresenta clinicamente como uma síndrome originária da inflamação do conduto auditivo externo devido a uma causa primária, como as dermatopatias alérgicas e os distúrbios de queratinização, dentre outros. A complexidade da doença está associada a presença de fatores predisponentes (ex.: conformação do conduto, umidade) e perpetuantes, agentes ou elementos que contribuem para a doença, como a proliferação de microrganismos e o desenvolvimento de hiperplasia da pele que reveste o conduto 5,6. Dessa forma, os pontos chave para uma terapia de sucesso são o diagnóstico e o manejo da dermatopatia primária, identificação e tratamento das infecções secundárias e o manejo dos fatores predisponentes e perpetuantes para prevenir a recorrência da otite 7. Os patógenos secundários mais comumente envolvidos são aqueles da microbiota, como a bactéria Staphylococcus pseudointermedius e leveduras como Malassezia pachydermatis, mas também bactérias contaminantes como Pseudomonas aeruginosa e Proteus mirabilis 8,9. Durante os estágios iniciais da OE aguda, a inflamação resulta em eritema de intensidade variada, prurido, exsudato, escoriações e ulcerações, mau odor, edema e dor. Nos casos recorrentes e crônicos esses sinais evoluem incluindo alterações proliferativas que resultam em hiperplasia e estenose, maior susceptibilidade de ruptura da membrana timpânica (MT) e a instalação de otite média 8. Já foi demonstrado que a OE impacta negativamente a qualidade de vida dos cães e seus tutores, devido ao estresse e incômodo relacionados à doença e ao seu tratamento 10. Apesar de não haver uma diretriz definida para o tratamento da OE, o protocolo adotado comumente é baseado no uso de ceruminolíticos, com o objetivo de eliminar o excesso de restos celulares e exsudato, seguido da administração de uma solução ótica contendo um antibacteriano, um antifúngico e um corticosteróide, para reduzir a inflamação e aliviar rapidamente o desconforto e a dor. Porém, o tratamento normalmente consiste na administração em média por 2 a 3 semanas, uma a duas vezes ao dia, realizada em casa pelos tutores. A adesão ao tratamento é fator crucial para o seu sucesso, porém sua administração nem sempre é fácil, levando ao estresse dos cães e seus tutores, com impacto nessa relação e consequente fracasso da terapia 11. Osurnia (Elanco Saúde Animal, EUA) é uma nova opção terapêutica formulada em tubos flexíveis pré mensurados (1mL) de ponta macia, fáceis de usar, contendo florfenicol 1%, terbinafina 1 % e acetato de betametasona 0,1% em um veículo gel adaptável desenvolvido para se distribuir em todo o conduto auditivo. Osurnia é indicado para o tratamento da otite externa aguda e exacerbação aguda da otite externa recorrente em cães, causadas pelas bactérias Staphylococcus pseudointermedius, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus canis e Proteus mirabilis e pelos fungos (leveduras) Malassezia pachydermatis e Candidas albicans. O fabricante recomenda duas aplicações com intervalo semanal entre elas e uma limpeza do conduto auditivo antes da primeira aplicação. A limpeza só é recomendada novamente duas semanas após a segunda aplicação (21 dias de tratamento). Após administrado, o líquido se transforma em gel, após entrar em contato com o conduto auditivo, dissolve por entre o cerúmen se distribuindo por todo o canal e garante a concentração terapêutica dos princípio ativos por pelo menos 5 semanas 12. O protocolo permite que o tratamento seja feito pelo médico veterinário, garante a adesão e aumenta as chances de sucesso. A eficácia e segurança de Osurnia no tratamento da OE canina foram demonstradas em ensaios clínicos randomizados com grupo controle negativo (placebo) e positivo (comercial) nos Estados Unidos da América e Europa respectivamente 13,14. Adicionalmente, foi demonstrada eficácia equivalente a um controle positivo (comercial) no tratamento da OE canina, porém Osurnia proveu maior qualidade de vida aos cães e seus tutores 15. O presente estudo apresentou dois objetivos (i) observar a eficácia de Osurnia em cães com OE da rotina clínica de formadores de opinião em dermatologia em todo o território brasileiro, avaliando a evolução da presença e contagem de microrganismos e células inflamatórias no exame citológico, e a evolução de um Escore Clínico Total (ECT) e seus parâmetros clínicos individualmente (eritema, edema, presença de erosão/ulceração e quantidade de exsudato); (ii) avaliar a experiência de tutores e médicos veterinários com uma nova maneira de tratar a OE aguda canina e sua exacerbação aguda recorrente. 2. Materiais e Métodos 2.1. Critérios de Inclusão O estudo foi realizado de acordo com as diretrizes globais para Estudos de Marketing da Elanco Animal Health. O protocolo foi revisado e aprovado pelo diretor global de terapêuticos, pela técnica global da categoria dermatologia e pelo responsável pela farmacovigilância da Elanco Animal Health (ELA ). Adicionalmente o protocolo foi revisado e aprovado pela líder de regulatório e pela líder de qualidade da afiliada brasileira. O protocolo foi submetido e aprovado pelo comitê de bioética e bem estar animal (IACUC) da Elanco Animal Health. Os cães foram incluídos no estudo após a confirmação de sua elegibilidade (de acordo com os critérios e inclusão e de exclusão ) e do consentimento do responsável pelo animal. Os dados clínicos foram registrados no formulários de reporte animal (FRA). Os médicos veterinários investigadores assinaram consentimento de participação no estudo e foram responsáveis pela avaliação dos critérios de inclusão e de exclusão, cumprimento de todas as atividades descritas no cronograma e preenchimento do FRA de cada paciente. Cães de tutores com OE aguda ou exacerbação aguda da recorrente complicadas pelo crescimento de leveduras e/ou bactérias, com ou sem a presença de neutrófilos, foram incluídos por 16 investigadores. Cães de tutores de qualquer raça e sexo, com pelo menos quatro meses de idade, com OE aguda ou exacerbação aguda de OE recorrente bilateral foram considerados para participação no estudo. OE foi diagnosticada pela observação de lesões dermatológicas (eritema, edema, erosão/ulceração, quantidade e aspecto do exsudato), além de avaliação citológica. Para inclusão no estudo a presença de OE foi determinada pelo ECT de no mínimo 5 baseado no exame físico (incluindo otoscopia) e levando em conta os seguintes sintomas: eritema, edema, erosão/ ulceração e quantidade de exsudato. Avaliação da dor foi opcional. A sintomatologia podia ter início e estar presente no máximo três meses antes da primeira visita (D0). As amostras para citologia foram coradas com corante rápido de preferência do investigador e observadas por microscopia no aumento de 1000X (com óleo de imersão) para a confirmação da presença e contagem de microrganismos e células inflamatórias. Os seguintes tratamentos concomitantes foram permitidos durante o estudo: profilaxia para o verme do coração (Dirofilaria immitis), ecto e/ou endoparasiticidas, imunoterapia alérgeno-específica, imunoterapia sistêmica (ciclosporina e oclacitinib) e outros medicamentos necessários para a manutenção da saúde do cão (ex.: insulina, levotiroxina, cardiológicos etc.).

3 2.2. Critérios de exclusão 2.4. Avaliação dos animais As seguintes condições foram consideradas critérios de exclusão: OE unilateral, presença de otite média e/ou interna, otite crônica (conforme definição detalhada na seção avaliação dos animais), tratamento nos últimos 14 dias prévios ao D0 com antimicrobianos (antibióticos ou antifúngicos), tópicos ou sistêmicos, anti-inflamatórios corticosteróides de curta ou longa duração, tópicos ou sistêmicos e anti-histamínicos sistêmicos, tratamento nos últimos 7 dias prévios ao D0 com qualquer medicamento de limpeza ótica e com agentes analgésicos sistêmicos, presença de ruptura da MT ou não possibilidade de sua visualização mesmo após limpeza do conduto auditivo, presença de otite parasitária concomitante por Otodectes cynotis e/ ou Demodex spp., presença de corpo estranho no conduto auditivo, presença concomitante de qualquer doença que pudesse interferir na avaliação da eficácia clínica do tratamento (ex.: piodermite de face) ou que necessitasse de tratamento concomitante não permitido (ex.: estágios avançados de otite proliferativa ou oclusiva que necessitem de medicamento de ação sistêmica), cães em risco de emprenhar ou amamentar ou cujos tutores tinham a intenção de os reproduzir, cães com sensibilidade conhecida a qualquer um dos componentes da fórmula do produto investigado (florfenicol, terbinafina e acetato de betametasona) e cães de funcionários da Elanco Saúde Animal ou que tenham participado de algum estudo nos últimos três meses Tratamento Uma representação gráfica das intervenções e avaliações dos animais incluídos no estudo é demonstrada na figura 1. Após a inclusão no estudo, os condutos auditivos foram limpos pelo médico veterinário investigador com solução salina ou um produto comercial ceruminolítico de ph neutro (Surosolve, Elanco Saúde Animal, EUA). Após a limpeza os cães foram tratados com a administração de Osurnia, com a aplicação de um tubo de 1mL em cada uma das orelhas afetadas, nos D0 e D7±2, de acordo com as orientações de bula do fabricante. Não foi permitida a limpeza das orelhas nos 28±2 dias de estudo. Nenhum tratamento foi realizado pelo tutor em casa. Os cães mantiveram suas rotinas de moradia e manejo como de costume, com alimentação sem restrição, de acordo com as orientações do médico veterinário investigador. Foi orientado, dentro do possível, que houvesse a manutenção do mesmo regime alimentar durante o período do estudo, preferencialmente continuidade do regime prévio estabelecido. Figura 1. Intervenções e avaliações realizadas nos cães participantes do estudo distribuidos em uma linha do tempo. ECT Escore Clínico Total Cada cão foi examinado nos dias 0, 7±2 e 28±2 e os dados foram registrados nos FRA. A cada visita os cães foram submetidos à exame físico ótico, incluindo otoscopia para avaliação da MT e das lesões dermatológicas. A OE foi caracterizada como aguda se o histórico sugerisse sinais clínicos consistentes com início há no máximo três meses antes da primeira visita (D0) e que não tenha sido tratada ou que o tratamento não tenha apresentado sucesso (resolução parcial dos sintomas), como exacerbação aguda recorrente nos casos de episódios anteriores com sucesso no tratamento (resolução completa dos sintomas) e novo episódio (recidiva), mormente relacionados à persistência de causa primária, com evolução menor do que três meses antes da primeira visita (D0) e crônica nos casos de sinais clínicos presentes por mais de três meses antes da primeira visita (D0), tratada ou não, mas com resolução incompleta dos sinais. Só foram incluídos no estudo cães enquadrados nos casos de OE ou exacerbação aguda da OE recorrente. O tipo de exsudato foi classificado em supurativo na presença de pus, ceruminoso na presença de excesso de cerúmen, ceruminoso e eritematoso na presença de excesso de cerúmen acompanhado de eritema e exsudato ausente quando da presença de cerúmen em quantidade fisiológica. O exsudato foi coletado por swab para a realização de parasitológico no D0 e citologia nos D0 e 28±2. A otite foi então classificada de acordo com o envolvimento qualitativo de agentes infecciosos secundários para cada orelha em ausência de infecção nos casos de ausência de leveduras e bactérias, apenas fúngica nos casos de presença de apenas leveduras, apenas bacteriana nos casos de presença de apenas bactérias (cocos e/ou bacilos) e mista nos casos de presença de leveduras e bactérias (cocos e/ou bacilos). Cães com ausência de infecção não foram incluídos no estudo. Adicionalmente avaliação quantitativa de cada orelha foi realizada com a contagem média (10 campos) de neutrófilos, leveduras, bactérias cocos e bactérias bacilos/ campo de microscopia em aumento 1000X (com óleo de imersão). A sintomatologia de otite foi quantificada com base em um ECT, adaptado de Nuttal e Bensignor, 2014, que acessou quatro manifestações clínicas (eritema, edema, erosão/ulceração e quantidade de exsudato) em uma escala de quatro pontos (0=ausente, 1=leve, 2=moderado e 3=intenso; soma 0-12) 15,16. Cada cão foi avaliado com o ECT levando em conta as duas orelhas afetadas em conjunto. Para inclusão no estudo o cão deveria apresentar ECT mínimo de 5. Adicionalmente em cada visita a dor podia ser avaliada de forma opcional (0=ausente, 1=leve, 2=moderada e 3=intensa), porém não foi contabilizada para a soma do ECT (Tabela 1). Tabela 1. Escore Clínico Total e escore de dor. Sinal clínico Escore "0" Escore "1" Escore "2" Escore "3" Conduto auditivo Conduto auditivo Conduto auditivo Conduto auditivo Eritema e/ou pavilhão cor e/ou pavilhão e/ou pavilhão e/ou pavilhão rosa rosa claro vermelho claro vermelho escuro Edema Erosão/ ulceração Quantidade de exsudato Dor (opcional) MT Membrana Timpânica Conduto auditivo e/ou pavilhão sem edema Conduto auditivo e/ou pavilhão sem erosão e ulceração Sem a presença de exsudato Sem dor ao exame físico e ausência de sinais clínicos de dor Sem oclusão do conduto auditivo, porém hiperplasia das glândulas ceruminosas Abrasões leves no conduto auditivo e/ou pavilhão Pequena quantidade de exsudato visível em conduto auditivo e/ou pavilhão Sem dor à palpação da base da orelha, mas meneios cefálicos espontâneos Leve edema do conduto auditivo e/ou pavilhão Extensas erosões no conduto auditivo e/ou pavilhão Moderada quantidade de exsudato em conduto auditivo ramo horizontal e/ou MT Sem dor à manipulação da pina, mas presente quando a base da orelha é palpada Edema importante do conduto auditivo e/ou pavilhão Ulcerações com exsudato sanguíneo no conduto auditivo e/ou pavilhão Grande quantidade de exsudato preenchendo todo o conduto auditivo e também o pavilhão. Dor presente com a manipulação da pina

4 Ao final do estudo (D28±2), tutores avaliaram a eficácia e a satisfação com o tratamento. Os médicos veterinários investigadores avaliaram a eficácia e a satisfação geral ao final de todos os tratamentos. O critério primário de avaliação foi a evolução da presença e contagem de microrganismos e células inflamatórias, e a evolução clínica de cada uma dos critérios do ECT. O critério secundário foi a avaliação da percepção de eficácia e a satisfação dos tutores e dos médicos veterinários investigadores. Os eventos adversos foram documentados nos FRA Remoção do estudo Após o início do tratamento os cães foram removidos do estudo devido a qualquer uma das seguintes razões: > Ocorrência de um evento adverso (EA) grave; > Falha na eficácia de acordo com o julgamento do médico veterinário investigador; > Desvio importante do protocolo; > Administração de terapia concomitante não permitida (ver seção critérios de exclusão) Análise estatística A unidade avaliada estatisticamente para escore citológico quantitativo foi a média dos valores observados para cada uma das orelhas dos cães. Para o cálculo, foi primeiro determinado a média de cada intervalo para cada um dos tipos celulares e multiplicado o resultado pela frequência absoluta do intervalo. O somatório foi dividido pelo somatório da frequência absoluta, constituindo a média dos valores agrupados em intervalos. No caso do último intervalo para cada tipo celular o valor para o cálculo da média foi considerado como valor teto (ex.: >100 foi considerado como 100). Após o cálculo da média para cada um dos tipos celulares para cada uma das orelhas, foi calculada uma média de ambas, chegando a um valor representativo do grupo de cães. O mesmo cálculo foi realizado para o conjunto de dados do dia 0 e do dia 28±2. Posteriormente, a porcentagem de melhora para cada um dos tipos celulares foi calculada para a evolução do dia 28±2 em relação a D0. Para os escores clínicos, a unidade avaliada foi o escore observado de cada um dos parâmetros para cada cão, assim como a somatória dos mesmos (ECT). A normalidade dos dados foi testada utilizando o teste Shapiro-Wilk W. Para a evolução de cada parâmetro clínico e do ECT, o modelo estatístico utilizado foi o Modelo Linear Generalizado (MLG) com distribuição Poisson, devido as variáveis respostas não possuírem uma distribuição normal. Para verificar a qualidade de ajuste do modelo foi utilizado o Critério de Informação de Akaike (AIC). A diferença foi considerada significativa quando P-valor<0, Resultados 3.1. Animais A fase experimental do estudo decorreu de dezembro de 2017 a abril de cães foram incluídos no estudo pelos investigadores, 16 médicos veterinários formadores de opinião que atuam exclusivamente com dermatologia, provenientes de 10 cidades em 8 estados do Brasil. Dez cães foram removidos do conjunto de dados para a avaliação da eficácia. Dois cães pela não possibilidade de avaliação da MT e seis por não apresentarem consentimento do tutor assinado. Um cão foi removido do estudo pois não compareceu na avaliação do dia 28 e um cão apresentou reação de hipersensibilidade no dia 14. Um total de 59 casos foram, portanto, incluídos no conjunto de dados de eficácia, todos compatíveis com os critérios de inclusão e de exclusão. A distribuição geográfica dos cães está demonstrada na tabela 2. A idade média dos cães foi de 6,13 anos (mínima 4 meses e máxima 15 anos) e o peso de 15,7kg (mínimo 3,3kg e máximo 57,0kg), 30 fêmeas (26 castradas) e 29 machos (18 castrados). As raças mais representadas foram Shih Tzu (10/59, 17%), sem raça definida (9/59, 15%), Golden Retrivier (6/59, 10%) e Maltês (5/59, 8%). 33 (56%) cães tinham exacerbação aguda da OE recorrente e 26 (44%) OE aguda, todas bilaterais conforme critério de inclusão do estudo (tabela 3). Tabela 2. Distribuição geográfica dos cães. Estado Cidade Distrito Federal 4 7% Brasília 4 7% Mato Grosso 4 7% Cuiaba 4 7% Minas Gerais 3 5% Belo Horizonte 3 5% Paraná 5 8% Curitiba 5 8% Rio de Janeiro 11 19% Rio de Janeiro 6 10% Seropédica 5 8% Rio Grande do Norte 3 5% Natal 3 5% Rio Grande do Sul 2 3% Porto Alegre 2 3% São Paulo 27 46% Sao Bernardo do Campo 1 2% São Paulo 26 44% Total % % Tabela 3. Dados demográficos e clínicos dos cães. n=59 Sexo Fêmea = 30 (51%)/Macho = 29 (49%) Idade (anos) média (DP) 6,3 (3,85) Peso (kg) médio (DP) 15,7 (12,33) Otite externa Aguda 26 (44%) Exacerbação aguda da recorrente 33 (56%) DP Desvio Padrão O tipo de exsudato mais frequentemente observado foi o ceruminoso eritematoso (31/59, 52%) e o ceruminoso (17/59, 29%) (tabela 4). Tabela 4. Característica do exsudato no D0 nos cães com otite externa aguda, exacerbação aguda da otite externa recorrente e total dos casos. Característica do exsudato Otite externa aguda n=26 Exacerbação aguda da otite externa recorrente n=33 Total n=59 Ausência de exsudato 0 (0%) 1 (3%) 1 (17%) Ceruminoso 9 (35%) 8 (24%) 17 (29%) Ceruminoso eritematoso 13 (50%) 18 (54%) 31 (52%) Supurativo 3 (11%) 5 (15%) 8 (14%) Misto 1 (38%) 1 (3%) 2 (3%)

5 3.2. Perfil citológico e clínico (ECT) Figura 2. Gráficos de tendência dos parâmetros clínicos nos dias 0, 7±2 e 28±2 a) eritema, b) edema, c) erosão/ulceração, d) quantidade de exsudato, e) Escore Clínico Total e f) dor. Todos os parâmetros apresentaram evolução favorável com diferença estatística pelo Modelo Linear Generalizado (MLG) com distribuição Poisson (p<0,05) das médias dos dias 7±2 e 28±2 em comparação com as médias do dia 0. No dia 0, as avaliações qualitativas das citologias do exsudato revelaram a presença de neutrófilos em 26 de 59 orelhas (44%), leveduras em 48 de 59 (81,3%), cocos em 44 de 59 (75%) e bacilos em 14 de 59 (24%). Perfil citológico misto, com a presença concomitante de leveduras e bactérias, esteve presente em 32 de 59 orelhas (54%). Os perfis mais frequentemente observados no momento do diagnóstico (D0) foram somente leveduras em 25% (15/59) dos casos, infecção mista por leveduras e cocos com neutrófilos em 29% (17/59) e sem neutrófilos em 14% (8/59) (tabela 5). a) Tabela 5. Perfil dos microrganismos presentes no exame citológico no D0 nos cães com otite externa aguda, exacerbação aguda da otite externa recorrente e total dos casos. Perfil microrganismos Otite aguda externa n=26 Exacerbação aguda da otite externa recorrente n=33 Total n= 59 Somente leveduras 6 (23%) 10 (30%) 16 (27%) Somente cocos 0 (0%) 4 (12%) 4 (7%) Leveduras + cocos 15 (58%) 10 (30%) 25 (42%) Cocos + bacilos 3 (11%) 4 (12%) 7 (12%) Leveduras + cocos + bacilos 2 (8%) 5 (15%) 7 (12%) Neutrófilos presentes 13 (50%) 13 (39%) 26 (44%) No exame citológico realizado no dia 28±2, não foram observados microrganismos nem neutrófilos em 20/59 cães (34%), 33/59 cães (56%) apresentaram somente leveduras e/ou cocos e 4/59 cães (8%) ainda apresentaram bacilos. As médias para cada um dos escores de citologia para os tipos celulares nos dias 0 e 28±2, e seu percentual de melhora estão demonstrados na tabela 6. b) Tabela 6. Médias dos escores de citologia para cada um dos tipos celulares nos dias 0 e 28±2. Neutrófilos 2,05 0,22 89% Leveduras 13,34 3,98 70% Cocos 26,37 4,51 83% Bacilos 5,93 0,82 86% A média do ECT para todas as orelhas no D0 foi de 6,69 (DP 1,56). Caso o investigador tenha atribuído valores diferentes para as duas orelhas, foi considerado o valor maior em qualquer um dos dias de avaliação (D0, D7±2 e D28±2). A média de todos os sinais clínicos está reportada na tabela 7. Tabela 7. Evolução das médias dos escores dos sinais clínicos. Escore clínico D0 (DP) D±7 (DP) D±28 (DP) Eritema 2,51 (0,57) 1,10 (0,73) 0,58 (0,79) Edema 1,58 (0,81) 0,47 (0,65) 0,15 (0,52) Erosão/ulceração 0,32 (0,60) 0,05 (0,22) 0,03 (0,26) Exsudato 2,29 (0,65) 1,00 (0,81) 0,59 (0,78) ECT 6,69 (1,56) 2,63 (1,73) 1,34 (1,78) Dor 1,3 (0,97) 0 (0) 0 (0) ECT Escore Clínico Total DP Desvio Padrão c) O modelo para a avaliação do eritema, edema, erosão/ulceração, quantidade de exsudato e ECT apresentou diferença estatística (p<0,0001). Houve melhora significativa de todos esses parâmetros do dia 7 ±2 e do dia 28±2 em relação ao D0 (p<0,0001), mas sem diferença significativa da evolução do D7±2 para o D28±2 (p 0,05). O modelo para a avaliação da dor apresentou diferença estatística (p=0,0002). Houve melhora significativa da dor do dia 7±2 e do dia 28±2 em relação ao D0, mas não houve diferença significativa da evolução do D7±2 para o D28±2 (p=0,9943). Os gráficos de tendência de todos os parâmetros clínicos individuais, do ECT e do escore de dor estão representados na figura 2.

6 d) Cão com otite externa aguda D0, D7 e D28 (Fotos RL). Cão com exacerbação aguda de otite externa recorrente D0, D7 e D28 (Fotos RL). e) Cão com exacerbação aguda de otite externa recorrente D0, D7 e D28 (Fotos SM). f) ECT Escore Clínico Total

7 3.3. Satisfação dos tutores e médicos veterinários Os formulários de satisfação foram preenchidos pelos tutores de cada cão participante do estudo. Os mesmos avaliaram a melhora dos sinais clínicos após o tratamento com Osurnia como excelente ou boa em 85% (50/59) dos casos, e 88% (52/59) se consideraram muito satisfeitos ou satisfeitos. O tratamento foi considerado como muito superior e superior a tratamentos anteriores realizados por 93% dos tutores (55/59), assim como 93% (55/59) recomendaria Osurnia a outros tutores com cães com otite com uma probabilidade muito alta ou alta. Cão com exacerbação aguda de otite externa recorrente D0, D7 e D28 (Fotos LEBL). Os médicos veterinários investigadores responderam os questionários ao final do período do estudo levando em consideração a experiência com todos os pacientes tratados de cada um deles. Os mesmos avaliaram a resposta clínica de seus pacientes após o tratamento com Osurnia como excelente ou boa em 94% (15/16), e 86% (14/16) se consideraram muito satisfeitos ou satisfeitos com o resultado do tratamento em seus pacientes com OE. A praticidade do tratamento foi considerada muito superior ou superior comparada aos outros tratamentos disponíveis no mercado por 100% (16/16). A probabilidade de prescrever Osurnia ao próximo paciente com OE aguda ou exacerbação aguda da OE recorrente foi considerada muito alta ou alta para 75% (12/16), que também consideraram muito alta ou alta a probabilidade de recomendar o tratamento a um colega. Ao considerar todos os cães atendido com OE em suas rotinas mensais, a porcentagem média que seria tratada com Osurnia foi quantificada em 55%. Os principais pontos limitantes para a escolha de Osurnia para o tratamento de futuras OE agudas ou exacerbações agudas de OE recorrentes foram a dificuldade da venda do valor a alguns tutores, a presença de diferentes fatores etiológicos e a alta frequência de casos crônicos que atendem por trabalhar exclusivamente com dermatologia Eventos adversos Dos 69 cães tratados com Osurnia, evento adverso foi reportado em apenas um caso, com manifestações de hipersensibilidade no dia 14. A avaliação da MT não foi possível pelo investigador no momento do diagnóstico devido ao edema de conduto, cão com dermatite atópica de base. No exame físico do dia 14, foi observado aumento da quantidade de exsudato, de aspecto purulento, edema, sensibilidade e eritema. No exame citológico foi observada grande quantidade de neutrófilos e o exsudato foi enviado para cultura e antibiograma com resultado negativo. O animal foi removido do estudo e instituído tratamento suporte com resolução dos sintomas.

8 4. Discussão O presente estudo demonstrou que Osurnia, duas aplicações com uma semana de intervalo, foi eficaz e seguro ao tratar a OE aguda e a exacerbação aguda da OE recorrente em cães da rotina clínica de médicos veterinários formadores de opinião atuantes em dermatologia em todo o território brasileiro. Ao final do estudo (D28+/-2), 91,5% dos cães apresentaram resolução dos sintomas de otite (ECT 3). Osurnia já havia se mostrado eficaz e seguro em ensaios clínicos randomizados, com grupo negativo (placebo) e positivo (comercial), realizado nos Estados Unidos da América e Europa respectivamente 13,14. As concentrações de seus princípios ativos foram testadas in vitro para as concentrações inibitórias mínimas (CIM) de cepas de patógenos (Staphylococcus pseudointermedius, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus canis, Proteus mirabilis, Malassezia pachydermatis e Candida albicans) isoladas de cães com otite no Brasil, demonstrando sua eficácia 16. Porém, ensaio clínico realizado regionalmente é interessante por avaliar a eficácia in vivo com seus desafios locais. De forma geral, os cães incluídos são representativos de pacientes da rotina clínica que apresentam OE com infecção secundária, candidatos ao tratamento com Osurnia. Os animais apresentaram características comumente encontradas, com variedade da raça, sexo, peso e idade. Adicionalmente, os cães são provenientes de diversas cidades e estados do Brasil, representando quatro de suas cinco regiões. Além de vasto território, cada uma de suas regiões apresenta particularidades físicas, culturais e econômicas; as quatro regiões do estudo representam a maior densidade demográfica do país Perfil das otites Dos casos analisados no estudo, a exacerbação aguda da OE recorrente foi pouco mais frequente do que a OE aguda, e o tipo de exsudato mais observado foi o ceruminoso eritematoso. A causa primária das otites não foi identificada, porém já foi demonstrado que mais de 90% dos casos de OE recorrente bilateral são resultado da presença de dermatite atópica ou trofoalérgica como causa de base em cães, sendo a OE o único sinal da doença em 3 a 5% e 25% respectivamente 8. No momento do diagnóstico, o exame citológico revelou mais frequentemente a presença de infecção mista por cocos e leveduras, seguida de infecção somente por leveduras. Cultura e antibiograma não foram realizados em nenhum dos pacientes do estudo, porém Malassezia pachydermatis e o Staphylococcus pseudointermedius já foram demonstrados como os fatores perpetuantes mais frequentes associados à OE canina 18. É importante enfatizar que o conduto auditivo externo apresenta um pequeno número de leveduras e bactérias residentes, assim como bactérias transitórias, em condições fisiológicas, de normalidade. Cultura e antibiograma de orelhas saudáveis demonstraram a presença de Malassezia pachydermatis em 96% das mesmas, assim como a presença de Staphylococcus pseudointermedius, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus spp e Proteus spp. Nos casos de supercrescimento os agentes mais comumente presentes foram Staphylococcus pseudointermedius, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Corynebacterium spp, Enterococcus spp e Streptococcus spp, sendo a P. aeruginosa a mais comum em casos crônicos e nos recorrentes. No caso de supercrescimento por leveduras a espécie mais comum encontrada é a Malassezia pachydermatis com ocasional isolamento de Candida albicans O diagnóstico de otite foi definido com a presença de sintomatologia clínica compatível por um escore clínico baseado no OTI-3, que gradua os principais sintomas presentes (eritema, edema, erosão/ ulceração e quantidade de exsudato) com o intuito de classificar a otite de forma mais objetiva e dessa forma, permitir maior acurácia na análise da resposta ao tratamento 16. Dessa forma, no presente estudo o prurido, por ser um sinal mais subjetivo e observado pelo tutor, não foi acessado. A dor foi quantificada em escores pelo médico veterinário investigador, mas não foi considerada na somatória do ECT por ser também um critério subjetivo. Assim, foi utilizado ECT com notas de 0-3 para cada um dos quatro sinais clínicos, com somatória total máxima de 12 e necessidade de soma mínima de 5 para inclusão no estudo. No momento do diagnóstico o ECT médio dos cães foi de 6,69/12, sendo os sinais mais evidentemente observados o eritema (2,51/3) e a quantidade de exsudato (2,29/3). Eritema, edema e o ECT apresentaram médias mais altas nos casos de exacerbação aguda de OE recorrente do que nos casos de OE aguda, provavelmente pela maior correlação dos casos recorrentes com doenças de base de etiologia alérgica/ inflamatória crônicas (tabela 8). Tabela 8. Evolução das médias de eritema, edema e ECT. Otite externa aguda n=26 Exacerbação aguda da otite externa recorrente n=33 Eritema D0 (DP) 2,46 (0,58) 2,54 (0,56) Eritema D28 (DP) 0,42 (0,76) 0,70 (0,81) Edema D0 (DP) 1,46 (0,76) 1,67 (0,85) Edema D28 (DP) 0,11 (0,59) 0,18 (0,46) ECT D0 (DP) 6,65 (1,57) 6,73 (1,57) ECT D28 (DP) 1,08 (1,85) 1,54 (1,71) ECT Escore Clínico Total DP Desvio padrão 4.2. Interpretação da eficácia No exame citológico realizado no dia 28±2, não foram observados microrganismos nem neutrófilos em 20/59 cães (34%). Dos 33/59 cães (56%) que ainda apresentavam microrganismos, porém somente leveduras e/ou cocos, o ECT médio foi de 1,52/12 comparado a 6,56/12 no dia 0. Todas as médias dos escores de citologia individualmente para cada tipo celular apresentaram melhora percentual acentuada. O tipo celular que apresentou menor percentual de melhora foi a levedura, ainda assim com melhora de 70%. Vale ressaltar novamente que leveduras e cocos fazem parte da microbiota residente do conduto auditivo externo de cães mesmo em condições de normalidade 19,22. Quatro cães (8%) ainda apresentavam bacilos nos exames citológicos controles realizados no dia 28±2, com a presença concomitante de cocos (3/4) e neutrófilos (2/4). Em três cães a contagem de microrganismos reduziu do dia 0 para o dia 28±2, assim como o ECT (7,33 para 3,67). Um dos cães, com OE aguda, não apresentava bacilos no exame citológico do momento do diagnóstico, somente no exame do dia 28±2 e não apresentou evolução favorável clínica, com ECT inicial e final de 9/12. Para melhor avaliação do caso outros exames seriam necessários, como a realização de cultura e antibiograma para determinação da espécie bacteriana envolvida e seu perfil de sensibilidade. Somado à isso, a chave para o sucesso no tratamento da OE é além da abordagem da infecção, o diagnóstico e manejo da doença primária e o reconhecimento de fatores perpetuantes e predisponentes 7. Em relação à evolução clínica, todos os parâmetros individuais evoluíram significativamente com melhora ao longo do tempo, assim como o ECT. Não houve determinação prévia de escore limite para a definição de cura, porém como base de comparação Nuttal e Bensignor, 2014 ao proporem o OTI-3 como escore clínico para a OE canina, concluíram que escores 3 foram 100% sensitivos e 91,9% específicos para o sucesso clínico 16. Assim, a média do ECT no dia 28±2 ficou abaixo desse limiar (1,34). Ao analisar a evolução de todos os parâmetros clínicos individualmente, assim como o ECT, diferença estatística foi observada na evolução do dia 0 para o dia 7±2, também com média de ECT 3 (2,63). Ainda é possível analisar que no D7±2 76% (45/59) dos cães já apresentavam ECT 3, subindo para 91,5% (54/59) no D28±2. Essa rápida evolução para resolução clínica pode estar relacionada a presença do acetato de betametasona, glicocorticóide com ação anti-inflamatória, e a rápida absorção do gel ótico com atingimento das concentrações terapêuticas adequadas dos princípios ativos. Noli et al, 2017 não observaram diferença estatística do OTI-3 ao longo do

9 tempo ao comparar Osurnia com controle positivo (comercial), mas observaram melhora superior significativa dos escores de citologia e do prurido no dia A avaliação de dor e sua quantificação eram opcionais para os investigadores. A análise dos cães avaliados mostrou evolução favorável, com melhora significativa do dia 0 para o dia 7±2. A dor é mais comumente observada em otite supurativa com a presença de erosão e ulceração, porém assim como o prurido, a dor não é considerada um parâmetro objetivo que diferencie orelhas saudáveis de doentes, assim como não permite a identificação do sucesso do tratamento, visto que em um estudo 66 de 90 casos avaliados a dor não foi observada no momento do diagnóstico 16. Mais estudos e recursos diagnósticos são necessários para melhor avaliação e correlação com a evolução do tratamento Interpretação da segurança O tratamento com duas doses de Osurnia demonstrou ser bem tolerado. Dos 69 cães tratados com Osurnia, evento adverso foi reportado em apenas um caso, com manifestações de hipersensibilidade no dia 14 resolvidas após tratamento suporte Interpretação da satisfação A eficácia de Osurnia foi percebida pelos tutores e médicos veterinários pela resolução dos sinais clínicos na quase totalidade dos cães tratados. A nova forma de tratar a otite, com apenas duas doses com uma semana de intervalo foi considerada prática com superioridade em relação aos tratamentos hoje disponíveis no mercado. Além de prover qualidade de vida aos cães e seus tutores, a administração é feita pelo médico veterinário em seu consultório e apresenta ação residual com concentrações terapêuticas dos princípios ativos por pelo menos 5 semanas 4. Dessa forma, visto que a principal dificuldade do tratamento é a adesão do tutor, as chances de sucesso são maiores assim como são menores as chances de cronificação 11. Além disso, ao garantir a adesão e o tratamento pelo período adequado, se minimizam as possibilidades de seleção de cepas bacterianas com multi mecanismos de resistência, normalmente consequência de repetidas exposições à antimicrobianos em concentrações baixas Os médicos veterinários investigadores consideraram em média 55% a probabilidade de indicar Osurnia como tratamento das OEs agudas e das exacerbações agudas das OEs recorrentes de suas rotinas devido a possibilidade de outras etiologias envolvidas, como por exemplo a presença de ácaros, e também pelo fato da presença expressiva de casos crônicos por atenderem exclusivamente dermatologia e muitos casos serem encaminhados por colegas. 5. Ponderações finais O presente estudo apresentou algumas limitações em relação ao seu desenho que podem ter impactado nos resultados e análises. A falta de um grupo controle como referência e, dessa forma, melhor comparação e análise estatística para os critérios de eficácia, escores de citologia e clínicos (ECT). Como ensaio clínico os cães eram de tutores e foi mantida sua rotina habitual durante o experimento, o que não permite um ambiente controlado, mas por outro lado permite a resposta ao tratamento em condições reais da rotina clínica. Consequentemente à ausência de grupo controle não foi possível a avaliação cega, o que pode gerar a interferência de fatores externos à avaliação. A causa primária das otites não foi caracterizada nesse estudo, assim como o prurido como um dos parâmetros clínicos. Além de subjetivo e observado majoritariamente pelo tutor, o prurido está frequentemente associado à dermatopatias crônicas de base, como as alérgicas, e mesmo a resolução da otite pode não estar associada com a resolução completa desse sintoma. A identificação e manejo da causa de base é importante fator na análise de sucesso ao tratamento, porém muitas vezes diagnosticá-la e controlá-la com efetividade é desafiador, especialmente nos casos de dermatite atópica 7. Como acesso indireto ao prurido foram realizados os questionários de satisfação com o tutor para avaliação dos sintomas percebidos pelos mesmos, com alta taxa de satisfação A presença de microrganismos nos exames citológicos controle podem gerar a percepção de que nem todos os casos obtiveram sucesso no tratamento. Porém, para a conclusão adequada da efetividade é fundamental correlacionar o resultado citológico com a evolução da sintomatologia, que deve ser soberana a despeito da citologia ser considerada o diagnóstico ouro para OE por permitir melhor avaliação da condição da epiderme e diferenciar o microbioma de disbioses 19,29. Assim, apesar da citologia e a avaliação clínica estarem correlacionadas em cães com OE, não é possível estabelecer limiares com sensibilidade e especificidade suficientes para considerar os desfechos citológicos em estudos clínicos 30. Como avaliação quantitativa dos tipos celulares observados na citologia foi solicitado aos investigadores a contagem dos mesmos com base na média de 10 campos (1000x). Houve grande variabilidade de resultados incluindo valores infinitos o que dificultou a organização e análises dos dados. Assim, a determinação de um método semiquantitativo em escores pré definidos pode ser válido para maior homogeneidade e objetividade dos dados 31. Adicionalmente, cultura e antibiograma não foram realizados não sendo possível assim, a determinação das espécies de bactérias envolvidas e seu perfil de sensibilidade. Porém, essa esse exame não deve ser considerado como rotina no plano diagnóstico da otite e não deve ser realizado antes da citologia identificar a presença de bactérias e células inflamatórias no exsudato. A indicação de sua realização está associada a casos crônicos, a presença de bacilos e otite média, com a necessidade de terapia sistêmica. Vale ressaltar que a resistência in vitro a um antimicrobiano pode não estar correlacionada a resposta clínica devido ao fato que a aplicação tópica resulta em concentrações maiores do antimicrobiano que não podem ser atingidas com a concentração sistêmica Conclusão Osurnia, um gel ótico adaptável que contém florfenicol, terbinafina e acetato de betametasona, aplicado duas vezes com intervalo de uma semana, é uma valiosa opção para o tratamento da OE aguda e a exacerbação aguda da recorrente em cães no Brasil, assim como já comprovada no mundo. A facilidade de uso e sua praticidade oferecidas pela formulação em gel exclusivo, que permanece no local da aplicação, são dois fatores importantes que auxiliam na melhor adesão e sucesso do tratamento, inclusive como primeira escolha terapêutica nos casos agudos.

10 Referências 1. Hill PB et al. Survey of the prevalence, diagnosis and treatment of dermatological conditions in small animals in general practice. Veterinary Record 2006; 158: O Neill DG et al. Prevalence of disorders recorded in dogs attending primarycare veterinary practices in England. PLoS One 2014; 9(3):e Inoue M et al. Breed, gender and age pattern of diagnosis for veterinary care in insured dogs in Japan during fiscal year Preventive Veterinary Medicine 2015; 119(1-2): Lucas R, Calabria KC, Palumbo MIP. Otites. In: Larsson CE & Lucas R, Tratado de medicina externa dermatologia veterinária. Interbook 1ed, 2016; Scott DW, Miller WH, Griffin CE. External ear diseases. In: Small animal dermatology. Saunders 6ed, 2001; Griffin C. Classifying cases of otitis externa the PPSP system. Proceedings of ESVD Workshopping in Otitis, Paterson S. Topical ear treatment options, indications and limitations of current therapy. Journal of Small Animal Practice 2016; 57: Rosser EJ. Causes of otitis externa. The Veterinary Clinics Small Animal Practice 2004; 34: Saridomichelakis MN et al. Aetiology of canine otitis externa: a retrospective study of 100 cases. Veterinary Dermatology 2007; 18: Jamet JF et al. Prospective study of the effect of otitis externa before and after treatment on 20 owners assessment of their own and their dog s quality of life. Veterinary Dermatology 2016; 27:45 (abstract). 11. Boda C, Liege P, Rème CA. Evaluation of owner compliance with topical treatment of acute otitis externa in dogs: a comparative study of two auricular formulations. The International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine 2011; 9: Nuttall T, Foster S. Terbinafine and florfenicol concentrations in the canine ear canal exceed minimum inhibitory concentrations for common otic pathogens after treatment with Osurnia (Elanco Animal Health). In: Proceedings of the British Veterinary Dermatology Study Group Spring Meeting 2015; Forster SL et al. A randomized placebo-controlled trial of the efficacy and safety of a terbinafine, florfenicol and bethametasone topical ear formulation in dogs for the treatment of bacterial and/or fungal otitis externa. Veterinary Research 2018; 14: King SB et al. A randomized, controlled, single-blinded, multicenter evaluation of the efficacy and safety of a once weekly two dose otic gel containing florfenicol, terbinafine and betamethasone administered for the treatment of canine otitis externa. Veterinary Research 2108; 14: Noli C, Sartori R and Cena T. Impact of terbinafine-florfenicolbethametasone acetate otic gel on the quality of life of dogs with acute otitis externa and their owners. Veterinary Dermatology 2017; 28:386-e Nuttal T, Bensignor E. A pilot study to develop an objective clinical score for canine otitis externa. Veterinary Dermatology 2014; 25: Tadini BS and Shigemoto T. Determinação na concentrações inibitória mínima (CIM) e não interferência entre os ativos: florfenicol, terbinafina e acetato de betametasona contra as cepas de bactérias e fungos isolados de otite externa aguda em cães no Brasil baseado nos dados da Elanco Saúde Animal como parte do dossiê de submissão de Osurnia. Boletim Técnico BRCACOSU00063, agosto Graham-Mize CA and Rosser EJ Jr. Comparison of microbial isolates and susceptibility patterns from the external ear canal of dogs with otitis externa. Journal of American Animal Hospital Association 2004; 40(2): Tater KC et al. The cytology of the external ear canal in the normal dog and cat. Journal of Veterinary Medicine-Series A 2003; 50: Blue JL and Wooley RE. Antibacterial sensitivity patterns of bacteria isolated from dogs with otitis externa. Journal of Veterinary Medical Association 1977; 171(4): Cole LK et al. Microbial flora and antimicrobial susceptibility patterns of isolated pathogens from the horizontal ear canal and middle ear in dogs with otitis media. Journal of American Veterinary Medical Association 1998; 212(4): Korbelick J et al. Analysis of the otic microbiota in dogs with otitis externa compared to healthy individuals. Veterinary Dermatology 2018; 29(5): 417- e Beck KM et al. Prevalence of meticillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) from skin and carriage sites of dogs after treatment of their meticillin-resistant or meticillin-sensitive staphylococcal pyoderma. Veterinary Dermatology 2012; 23: Loeffler A et al. Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among staff and pets in a small animal referral hospital in the UK. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2005; 56: Sasaki T et al. Methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in a veterinary teaching hospital. Journal of Clinical Microbiology 2007; 45: Van Duijkeren E et al. Transmission of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius between infected dogs and cats and contact pets, humans and the environment in households and veterinary clinics. Veterinary Microbiology 2011; 150: Andersson DI and Hughes D. Microbiological effects of sub lethal levels of antibiotics. Nature Review Microbiology 2014; 12: Sandegren L. Selection of antibiotic resistance at very low antibiotic concentrations. Upsala Journal of Medical Sciences 2014; 119: Hoffmann AR et al. The skin microbiome in healthy and allergic dogs. PLoS One 2014; 9(1):e Pulido-Vilamarin A et al. Concordance between otic cytology and culture in diagnosis of external otitis canine by Malassezia spp. Revista MVZ Cordoba 2014; 20(3): Budach S and Mueller RS. Reproducibility of a semi quantitative method to assess cutaneous cytology. Veterinary Dermatology 2012; 23: Murphy MK. A review of techniques for te investigation of otitis externa and otitis media. Clinical Techniques in Small Animal Practice 2001; 16(4):