DESENVOLVIMENTO DE PROTOCOLOS PARA MICROPROPAGAÇÃO DE ESPÉCIES DE BROMELIACEAE

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1 DESENVOLVIMENTO DE PROTOCOLOS PARA MICROPROPAGAÇÃO DE ESPÉCIES DE BROMELIACEAE Eldelon de Oliveira Pereira, Ester Ujiie Nogueira, Matheus Fonseca de Souza, Simone Paiva Caetano, Andreia Barcelos Passos Lima Universidade Federal do Espírito Santo/Departamento de Produção Vegetal, Alto Universitário s/n, Guararema, Alegre, ES, Resumo- Este trabalho foi executado no Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Campus de Ciências Agrárias da UFES, visando o desenvolvimento de protocolos para estabelecimento e propagação in vitro de bromélias nativas do Distrito de Burarama, Município de Cachoeiro do Itapemirim, ES. O principal problema para o desenvolvimento desta técnica é a contaminação fúngica e bacteriana dos explantes provenientes do campo, exigindo um tratamento eficiente para descontaminação. Foram testados ápices caulinares, gemas, segmentos foliares e base de folhas de plantas mantidas em casa de vegetação, na presença de 1 mg/l de ANA e BAP, porém devido ao alto índice de contaminação, optou-se por utilizar plantas germinadas in vitro como doadoras de explantes. Obteve-se a germinação e estabelecimento in vitro de Ananas macrodontes, Canistropsis billbergioides e Pitcairnia flammea, que podem ser plantas doadoras de explantes sadios. Foi observada indução de organogênese indireta nas concentrações de 1 e 4µM de ANA combinadas com 4µM de BAP em A. macrodontes. Palavras-chave: Bromeliaceae, contaminação, germinação in vitro. Área do Conhecimento: Ciências agrárias Introdução Bromeliaceae é a maior família das angiospermas, quase exclusivamente neotropical, presente desde o Sul da América do Norte até a Patagônia (Argentina) (WANDERLEY et al., 2007). São encontradas nas mais variadas condições de altitude, temperatura e umidade e apresentam sofisticadas adaptações ao hábito epifítico, podendo ser epífitas obrigatórias ou facultativas (BENZING, 2000). Muitas de suas espécies são também terrícolas, saxícolas ou rupícolas, e foi registrado o fato de também vegetarem em solos sujeitos a inundações periódicas (SCARANO et al., 1997). O grande interesse pelas bromélias pode ser explicado pela sua aparência exótica e bela, característica importante para o paisagismo e a comercialização de artigos ornamentais, e por sua rusticidade, não precisando de muitos cuidados para garantir sua sobrevivência (CARVALHO, MERCIER, 2005); isso torna essas plantas de fácil manejo e utilização em pesquisas. As bromélias apresentam elevado grau de importância ecológica nos ecossistemas onde se inserem e afetam muitos aspectos do ecossistema que habitam. Contribuem para sustentabilidade da diversidade do ecossistema, atuam como indicadores globais de mudanças climáticas, além de fornecer ao homem matéria-prima para a horticultura, para fins medicinais e valor econômico (NADKARNI, 1991). Podem ser propagadas de forma sexuada ou assexuada. Na propagação assexuada, ou vegetativa, formam-se brotos a partir da planta mãe, que podem sair da base da planta por estolhos ou rizomas, ou do interior da própria roseta. O processo sexual envolve a formação de sementes, das quais podem ser obtidas grandes quantidades de plântulas (RAUH, 1979). A propagação vegetativa de bromélias é muito lenta, uma vez que poucos brotos laterais são produzidos por planta (KOH, DAVIES, 1997). A propagação in vitro tem demonstrado grande potencial em relação às técnicas convencionais como redução do tempo, espaço e custos (GRATTAPAGLIA, MACHADO, 1999). Os explantes utilizados nos protocolos de micropropagação de bromélias são variados. Plântulas in vitro foram usadas como material inicial, em algumas espécies de Tillandsia Linnaeus (MEKERS, 1977; KOH, DAVIES, 2001) e em Dyckia distachya Hassler (POMPELLI, GUERRA, 2005). Alternativamente, outras fontes de explantes foram usadas, como folhas (MERCIER, KERBAUY, 1992), estolões (CARNEIRO et al., 1999) meristemas intercalares (KOH, DAVIES, 1997) e brotos estiolados (PEREIRA et al., 2001). 1

2 A germinação de sementes in vitro de algumas bromélias já vem sendo relatada na literatura, com resultados diferenciados entre as espécies (POMPELLI et al., 2001; ARANDA-PERES, 2005). Além disso, o cultivo in vitro de sementes pode ser considerado uma técnica de grande importância na conservação de germoplasma de bromélias ameaçadas de extinção, visto que a emergência da planta ocorre em um tempo mais reduzido, quando comparado ao processo natural, além de um número muito maior de sementes germinarem (MERCIER, KERBAUY, 1997). Um dos princípios básicos para o sucesso da Cultura de Tecidos depende, em parte, de medidas de controle e prevenção da contaminação microbiana (LEIFERT et al., 1994; SILVA et al., 2003). A assepsia do material vegetal é de fundamental importância na micropropagação e, sendo efetuada com sucesso, evitará contaminação no meio de cultura por fungos e bactérias, que ocasionam perdas do material vegetativo e do meio de cultura (RODRIGUES et al., 2003). Os microrganismos contaminantes competem com os explantes pelos nutrientes do meio de cultura, eliminando no meio metabólitos tóxicos, podendo ocasionar a morte das plântulas (PEREIRA et al., 2003). Portanto, o desenvolvimento de protocolos de descontaminação de explantes de Bromeliaceas pela técnica de cultura de tecidos, é de grande importância, pois constitui um recurso útil na micropropagação. A utilização de plantas germinadas in vitro como doadora de explantes é uma estratégia viável nos ensaios de micropropagação, pois garante a obtenção de plantas assépticas e explantes sadios para introdução no cultivo in vitro. O objetivo desse trabalho foi desenvolver protocolos para a desinfestação de explantes de bromélias nativas, visando a micropropagação e seu estabelecimento em cultivo in vitro Metodologia O experimento foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia Vegetal do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo (CCA-UFES), localizado no município de Alegre ES. Foram utilizadas espécies de bromélias identificadas e coletadas no distrito de Burarama, situado no município de Cachoeiro de Itapemirim- ES. Quanto à utilização do material vegetal para obtenção de explantes, foram adotadas duas estratégias de trabalho: plantas coletadas no campo e mantidas em casa de vegetação e sementes obtidas de indivíduos da região de trabalho, que foram secas em estufa e mantidas na geladeira até o uso. Ápices caulinares, gemas e segmentos foliares de plantas mantidas em casa de vegetação (espécies Canistropsis billbergioides e Pitcairnia flammea) foram lavados em água corrente e detergente comercial, imersos em álcool 70% por 3 minutos e transferidos para o hipoclorito de sódio a 2,5% + tween 20 por 15 minutos, sob agitação. Na capela de fluxo laminar os explantes foram imersos em álcool 70% por 1 minuto, hipoclorito de sódio a 2% por 5 minutos e enxaguados 3 vezes em água destilada e autoclavada. Em um primeiro experimento foram utilizados segmentos de folhas (30 explantes), gemas (10 explantes) e meristemas (4 explantes) cultivados em meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) acrescido de ANA (1 mg/l), BAP (1 mg/l), sacarose (30g) e Ágar (7g.L -1 ). Os explantes foram mantidos na sala de cultivo nas condições de claro e escuro. O segundo experimento foi realizado nas mesmas condições do primeiro, utilizando como explantes apenas as bases das folhas visando a diminuição da porcentagem de contaminação. Foram utilizados 40 segmentos de base de folhas cultivados nas condições de claro e escuro. Na tentativa de reduzir a contaminação proveniente do campo foram iniciados experimentos utilizando explantes provenientes de plântulas germinadas in vitro. Foram realizados ensaios com três espécies de Bromeliaceae: Ananas macrodontes, Canistropsis billbergioides e Pitcairnia flammea. Sementes de A. macrodontes foram imersas em álcool 92,8% por 1 minuto e em seguida transferidas para hipoclorito de sódio a 2,5% por 5 minutos, sob agitação. Na capela de fluxo laminar as sementes foram enxaguadas 3 vezes em água destilada e autoclavada. As sementes foram inoculadas em meio MS (MURASHIGE, SKOOG, 1962) acrescido de sacarose (30g) e ágar (7 g.l -1 ). As plântulas germinadas in vitro serviram como doadoras de explantes para um experimento realizado com base e segmentos de folhas. Neste experimento foram utilizadas diferentes doses de ANA (0; 0,5; 1; 2 e 4 µm) e uma dose constante de BAP (4µM), constituindo 5 tratamentos, sendo 4 repetições de 3 tubos, totalizando 12 tubos por tratamento para cada explante testado. Foi utilizado o meio MS (MURASHIGE, SKOOG, 1962) nas mesmas condições do experimento anterior. Após a inoculação os explantes permaneceram na condição de escuro. Sementes de C. billbergioides foram desinfestadas como descrito anteriormente e em seguida embebidas em água destilada por 4 horas e na capela de fluxo laminar repetiu-se a desinfestação inicial, seguido de tríplice enxágüe com água destilada e autoclavada e 2

3 posteriormente inoculação em meio MS (MURASHIGE, SKOOG, 1962). Para as sementes de P. flammea houve a necessidade inicial de se testar diferentes tratamentos de desinfestação. Foram realizados 6 tratamentos com 4 repetições, 3 tubos por repetição e 3 sementes por tubo (216 sementes). Os tratamentos estão descritos a seguir: 1 minuto em ácool 92% e 5 minutos em hipoclorito 1%; 1 minuto em ácool 92% e 10 minutos em hipoclorito 1%; 1 minuto em ácool 92% e 5 minutos em hipoclorito 2%; 1 minuto em ácool 92% e 10 minutos em hipoclorito 2%; 1 minuto em ácool 92% e 5 minutos em hipoclorito 3%; 1 minuto em ácool 92% e 5 minutos em hipoclorito 3%. Após a desinfestação, as sementes foram inoculadas em meio MS (MURASHIGE, SKOOG, 1962) acrescido de sacarose (30g) e Ágar (7 g.l -1 ). Resultados Inicialmente foram utilizados gemas, meristemas e segmentos foliares nos ensaios de indução de organogênese na presença de BAP e ANA e avaliada a porcentagem de contaminação bacteriana. A inoculação foi realizada em 10 gemas no claro, 10 gemas no escuro, 30 segmentos foliares no claro e 30 no escuro, 4 meristemas no claro e 4 no escuro. Na condição de claro houve 100% de contaminação. Na condição de escuro, 50% dos explantes foliares não apresentaram contaminação. No segundo experimento utilizando 40 explantes de base foliar, na condição de claro e escuro. No claro, 15% dos explantes apresentaram contaminação bacteriana e no escuro apenas 10%. Para A. macrodontes foram inoculadas 32 sementes, obtendo 87,5% de sementes germinadas, em aproximadamente 30 dias. As plântulas de C. billbergioides foram germinadas apenas em condição de claro. Após 30 dias de inoculação, as sementes mantidas na condição de escuro foram transferidas para a condição de claro e todas também germinaram. As sementes de P. flammea, apresentaram 100% de geminação. Figura 1 Calos e brotações em base foliar de A. macrodontes. A 4µM de ANA com 4µM de BAP B 1µM de ANA com 4µM de BAP. Barra=1cm. Figura 2 Germinação de Bromeliaceae em meio MS. A - A. macrodontes. B P. flammeae var. cuspidata. C C. billbergioides. Barra=1cm. Discussão Foram inoculados 10 gemas no claro, 10 gemas no escuro, 30 segmentos foliares no claro e 30 no escuro, 4 meristemas no claro e 4 no escuro. Na condição de claro houve 100% de contaminação. Na condição de escuro, 50% dos explantes foliares não apresentaram contaminação. Nesta mesma condição, as gemas e meristemas não apresentaram sinais de contaminação, entretanto, pôde-se notar sinais de necrose tecidual. Posteriormente foi realizado um segundo experimento utilizando 40 explantes de base foliar, na condição de claro e escuro. No claro, 15% dos explantes apresentaram contaminação bacteriana e no escuro apenas 10%. As menores taxas de contaminação foram alcançadas sob condição de escuro, com explantes foliares cultivados na presença de ANA (1 mg/l) e BAP (1 mg/l). Com a utilização de explantes de base foliar houve redução na taxa de contaminação, apesar de não apresentarem respostas morfogênicas in vitro. Provavelmente, deva existir algum tipo de influência dos agentes descontaminantes utilizados neste trabalho sob o desenvolvimento in vitro de explantes de bromélias. Objetivando reduzir os índices de contaminação e tentar induzir o desenvolvimento e 3

4 diferenciação celular in vitro de Bromeliaceae, foram utilizados explantes de plântulas germinadas in vitro das três espécies estudadas. Para A. macrodontes foram inoculadas 32 sementes, obtendo 87,5% de sementes germinadas, em aproximadamente 30 dias. No entanto, o padrão de germinação foi desuniforme. As plântulas obtidas neste experimento foram doadoras de explantes para ensaios de indução de organogênese. Foram utilizados como explantes base e segmentos de folha cultivados na presença de ANA e BAP, sendo mantidos na condição de escuro. Após 57 dias de cultivo, como os explantes não apresentaram respostas morfogênicas, os mesmos foram transferidos para a condição de claro. Foi observada indução de organogêse indireta apenas nas concentrações de 1 e 4 µm de ANA e 4 µm de BAP. Foi verificado o início de diferenciação celular com a emissão de brotos (FIGURA 1). Plântulas de C. billbergioides foram germinadas apenas em condição de claro. Após 30 dias de inoculação, as sementes mantidas na condição de escuro foram transferidas para a condição de claro e todas também germinaram. As sementes de P. flammea foram inicialmente submetidas a diferentes tratamentos de desinfestação. Todos os tratamentos se mostraram eficientes na desinfestação, não diferindo estatisticamente e garantindo 100% de germinação. Segundo Steward (1958), citado por Murashige (1974), o desenvolvimento in vitro de algumas espécies vegetais, como Dacus carota L., Asparagus officinalis L., orquídea, gérbera e bromélias, é bastante influenciado pela consistência do meio de cultura. A utilização do meio líquido é considerado economicamente mais viável para uma propagação em massa (TAUTORUS, DUNSTAN, 1995). Segundo Caldas, Haridasan, Ferreira (1990), o meio semi-sólido tem a propriedade de impor restrições à velocidade de difusão de nutrientes em relação ao meio líquido, causando deficiência nutricional das plantas. Embora não tenha sido obtido sucesso com a utilização de explantes retirados de plantas vindas do campo e mantidas em casa de vegetação, foi possível a germinação e estabelecimento in vitro de espécies de Bromeliaceae que podem ser utilizadas como plantas doadoras de explantes sadios (FIGURA 2). A manutenção in vitro assegura o armazenamento de germoplasma e é vantajosa inclusive por proporcionar uma alta taxa de multiplicação, a produção de plantas saudáveis, e a representação de grande variedade de genótipos em espaços reduzidos (ENGELMANN, 1991). Neste caso, o cultivo in vitro a partir de sementes é aconselhado também por gerar um grande número de plantas-matrizes, evitando a retirada de indivíduos da natureza, o que agravaria o grau de ameaça sobre estas espécies. Outra vantagem decorre da maior facilidade na desinfestação de sementes quando comparadas com tecidos extraídos de plantas nativas (MERCIER, KERBAUY, 1994). Conclusão Para condição dessa pesquisa: Foi observada alta taxa de contaminação quando explantes retirados de plantas mantidas em casa de vegetação foram cultivados em meio MS na presença de ANA e BAP; Foram obtidas plantas de A. macrodontes, C. billbergioides e P. flammea germinadas in vitro; Foi observada indução de organogêse indireta a partir de base de folha de A. macrodontes nas concentrações de 1 e 4 µm de ANA e 4 µm de BAP. Foi verificado o início de diferenciação celular com a emissão de brotos; Todos os tratamentos se mostraram eficientes na desinfestação de sementes de P. flammea, não diferindo estatisticamente e garantindo 100% de germinação. Referências ARANDA-PERES, A. N. Cultivo in vitro de bromélias da Mata Atlântica: micropropagação, avaliação nutricional e substrato para aclimatação f. (Tese Doutorado) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo. Piracicaba, BENZING, D. H. BROMELIACEAE, Profile for an adaptative radiation. Cambridge University Press, Cambridge. 690p CALDAS, L.S.; HARIDASAN, P.; Ferreira, M.E. Meios Nutritivos. In: TORRES, A.C; CALDAS, L.S.(eds.). Técnicas e Aplicações da Cultura detecidos de Plantas. Brasília: ABCTP/EMBRAPA-CNPH. p CARNEIRO, L. A.; ARAÚJO, R. F. G.; BRITO, G. J. M.; FONSECA, M. H. P. B.; COSTA, A.; CROCOMO, O.J.; MANSUR, E. In vitro regeneration from leaf explants of Neoregelia cruenta (R. Graham) L.B. Smith, an endemic bromeliad from eastern Brazil. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, n. 55, p

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